Улучшение протеомики тканей головного мозга сверху вниз с помощью FAIMS. Часть 4.

Мы также идентифицировали многочисленные фрагменты, полученные из неканонических изоформ сплайсинга таупротеина, которые, как известно, экспрессируются в человеческом мозге. до as0N, 1N и 2N) и количества повторов связывания микротрубочек вследствие альтернативного сплайсинга экзона 10 (называемого 3R или 4R).84

Тау-белок — важный белок нейрональных клеток, который играет очень важную роль в поддержании нормальной структуры и функции нейрональных клеток. Исследования показали, что тау-белок тесно связан с памятью, а его аномальная экспрессия может привести к ухудшению когнитивных функций и даже когнитивным нарушениям.

Ученые провели много исследований о взаимосвязи между тау-белком и памятью. Согласно исследованиям, тау-белок может помочь регулировать стабильность нервных волокон, тем самым способствуя передаче информации и формированию памяти между нейрональными клетками. Однако если тау-белок становится ненормальным, например, при накоплении белка, это приведет к разрыву нервных волокон и гибели большого количества нейрональных клеток, что повлияет на формирование и поддержание памяти и даже приведет к ухудшению памяти. Поэтому поддержание нормальной экспрессии и функции тау-белка очень важно для поддержания здоровья памяти.

Недавние исследования также показали, что питательные вещества, содержащиеся в некоторых продуктах и ​​напитках, также полезны для поддержания нормальной функции тау-белка. Например, антиоксиданты, жирные кислоты омега-3, а также овощи и фрукты, богатые кофеином, помогают регулировать экспрессию и функцию тау-белка, что способствует улучшению памяти и когнитивных функций.

Поэтому мы должны уделять внимание поддержанию хороших жизненных привычек, контролю диеты, снижению стресса и т. д., чтобы поддерживать нормальную экспрессию и функцию тау-белка. В то же время поддержание хороших привычек в учебе и умеренные физические нагрузки также могут способствовать передаче информации и формированию памяти между нейрональными клетками. Я считаю, что пока мы уделяем внимание здоровому образу жизни, мы можем иметь здоровую память и лучше наслаждаться жизнью. Это показывает, что нам необходимо улучшить нашу память. Цистанхе может значительно улучшить память, поскольку цистанхе — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффективность Цистанхе обусловлена ​​различными содержащимися в ней активными ингредиентами, в том числе дубильной кислотой, полисахаридами, флавоноидными гликозидами и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными способами.

Нажмите «Узнай 10 способов улучшить память»

Также стоит отметить, что эндогенные фрагменты тау часто обнаруживаются в тканях головного мозга и спинномозговой жидкости человека, а дифференциальная фрагментация тау может играть роль в прогрессировании болезни Альцгеймера.85,86

Мы наблюдали несколько фрагментов, по которым можно было однозначно отличить {{0}}N и 1N тау (рис. 10A, S7 и S8). Тот факт, что мы наблюдаем высокие спектральные значения для 0N (86 PrSM) и 1N (91 PrSM), но не наблюдаем каких-либо PrSM для 2N, согласуется с предыдущим количественным иммуноблоттингом, который обнаружил, что 0N и 1N являются доминирующими формами и составляют ∼ 91% от общего количества тау, тогда как 2N составляет всего ~9%.87

Что касается однозначного назначения повторов, связывающих микротрубочки, мы наблюдали спектры, которые можно было отнести как к 3R (рис. 10A и S9), так и к 4R tau (рис. 10A и S10).

Экономный вывод позволил нам заключить, что брейнтау представлен в основном смесью сплайс-вариантов 1N3R (Tau-B), за которыми следуют 0N4R (Tau-D), что согласуется с предыдущими наблюдениями.87,88

Хотя другие изоформы сплайсинга также имели уникальные фрагменты, небольшое количество спектральных совпадений (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Неожиданно оказалось, что N-концы преобладающих фрагментов, содержащих R-домен, являются продолжением С-концев преобладающих фрагментов, содержащих N-домен, или, другими словами, они кажутся связанными фрагментами, полученными в результате возможного события протеолитического расщепления (называемого участок № 1 на рисунке 10А). Кроме того, С-концы протеоформ, содержащих домены 3R и 4R, имеют один и тот же сайт расщепления (называемый сайтом № 2 на фигуре 10А), даже несмотря на то, что сами последовательности различаются из-за вариаций сплайсинга экзона 10.

Еще более удивительно то, что все эти сайты расщепления лежат в пределах трех хорошо описанных гексапептидных мотивов. 89–95 На рисунке 10B показаны все уникальные фрагменты, которые мы идентифицировали из наших наборов данных, которые могут быть сопоставлены с тау-изоформой 1N3R, а также расположение места расщепления. сайты.

Сайт расщепления № 1 расположен внутри второй богатой пролином области тау, которая разделяет гексапептидную последовательность KVAVVR и обеспечивает один из самых сильных сайтов связывания для микротрубочек (рис. 10B).89–91 Сайт расщепления № 2 находится внутри гексапептидных мотивов 3R и 4R VQIVYK и VQIINK, которые, как было продемонстрировано, стимулируют агрегацию тау (рис. 10B).92–95

Интересно, что многие фрагменты, как показано на рисунке 10В, начинаются или заканчиваются вблизи этих двух сайтов расщепления. Известно, что каждый из этих гексапептидных мотивов образует -структуру, часто в виде -шпильки, которая лежит в основе агрегации, вовлеченной в различные нейродегенеративные заболевания.89,93,96 Интересно, что эти наблюдения подчеркивают возможность общего пути протеолитической деградации среди изоформ тау, т.е. способны нарушить их агрегацию-засеивание регионов.25,85,86

Наконец, мы нашли множество спектральных совпадений для A, которые можно было наблюдать только с помощью FAIMS.

Эти протеоформы А, которые обычно требуют специальных методов фракционирования или обработки для улучшения извлечения из-за их гидрофобных и склонных к агрегации свойств,9,16,97,98 наблюдались в неизмененном виде с помощью FAIMS в диапазоне CV от -40 до -50.

Сюда входят канонические A 1–42 и A 1–40 (рис. 11A, B соответственно), а также несколько укороченных по N-концу форм (в частности, A 2–42 и A 4–42, рис. 11C, D).

Стоит отметить, что протеоформы А с различными N- и C-концевыми расщеплениями, как известно, трудно идентифицировать при восходящем анализе из-за чрезвычайной гидрофобности триптических продуктов, что подчеркивает преимущество анализа интактных белков.

Мы считаем, что методология FAIMS-TDP предлагает надежный способ добиться неповрежденной идентификации этих А-протеоформ, позволяя легко определять различные комбинации существующих продуктов N- и C-концевого расщепления.

ВЫВОДЫ

Мы описали, как обратнофазовое разделение нано-ЖХ очень сложных образцов, содержащих белки, в широком диапазоне масс может принести пользу от реализации газофазного фракционирования с помощью FAIMS в контексте нисходящей масс-спектрометрии.

Было продемонстрировано, что FAIMS влияет на передачу протеоформ в зависимости от размера и/или заряда, уменьшая сложность MS1 и обеспечивая большую глубину охвата протеома.

FAIMS при одном CV (-50) позволил идентифицировать в среднем 1833 ± 17 уникальных протеоформ, что более чем вдвое больше, чем без FAIMS (754 ± 35). Добавление FAIMS не привело к ухудшению воспроизводимости количественного определения и оставалось около 20% RSD, что сопоставимо с подходами «снизу вверх» без меток.

Было отмечено, что снижение CV FAIMS приводит к увеличению молекулярной массы видов ионов, передаваемых в прибор (медиана MW ~ 5 кДа при -50 CV против ~ 15 кДа при -20 CV), а также наблюдалось, что модуляция CV влияет на передачу Огибающая зарядового состояния протеоформы дифференциально.

Мы также определили оптимальные комбинации CV, которые могли бы обеспечить наибольший теоретический максимум покрытия протеоформ/генов или протеомных последовательностей. По сравнению с тремя наборами данных «No FAIMS», внешнее регулирование CV при -50, -40 и -30 В может более чем удвоить количество уникальных протеоформ, уникальных генов и охвата протеомных последовательностей.

Также стоит отметить, что в нашей работе исследовался только относительно небольшой диапазон CV, который, по нашему мнению, лучше всего подходит для нашего подхода TDP с использованием сложной выборки. Поскольку FAIMS можно легко адаптировать к другим методам, анализ MS1 с низким разрешением с помощью анализаторов Orbitrap может улучшить идентификацию более крупных протеоформ в протестированном нами диапазоне CV, а также за пределами -20 В, где, вероятно, будут наблюдаться более крупные протеоформы.

Можно также предположить, что будущие масс-анализаторы, которые улучшат сбор более крупных протеоформ и будут совместимы с FAIMS, смогут извлечь выгоду из исследования CV ниже -20, простирающегося до диапазона положительного напряжения.

Наш рабочий процесс TDP позволил нам идентифицировать и охарактеризовать уникальные протеоформы, полученные из генов, играющих известную роль в нейродегенеративных заболеваниях.

Это включало определение состава неизвестного массового сдвига, присутствующего вблизи железосвязывающего домена -синуклеина, который использовался для точного определения местоположения потенциальных железосвязывающих доменов в - и синуклеине. Также было обнаружено, что PARK7 модифицирован сукцинильной группой в остатке Cys в активном центре.

Нам удалось однозначно различить тау-фрагменты, соответствующие изоформам вариантов сплайсинга 0N, 1N, 3R и 4R индивидуально, и описать новые сайты протеолитического расщепления, расположенные внутри или рядом с несколькими гексапептидными повторами, затрачивающими агрегацию.

Наконец, FAIMS позволил идентифицировать несколько интактных протеоформ А, включая склонные к агрегации А 1–42, без необходимости использования сложных методов фракционирования или очистки.

Подводя итог, мы считаем, что добавление FAIMS для обнаружения TDP обеспечит надежный и воспроизводимый метод увеличения количества протеома, доступного для обнаружения и характеристики.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы см. в веб-версии PubMed Central.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить Тао Лю и Ричарда Смита за их советы и полезные обсуждения.

Эта работа была поддержана U01 AG061356 (PLDJ) и R01 AG015819 (DAB). Часть исследования была проведена с использованием EMSL (grid.436923.9), пользовательского центра Управления науки Министерства энергетики США, спонсируемого программой биологических и экологических исследований. Графические абстракции и изображения на рисунке 1 были созданы с помощью Biorender.com.

ССЫЛКИ

(1). Николс Э; Секе CEI; Воллсет SE; Аббаси Н; Абдаллах Ф; Абдела Дж; Айчур МТЕ; АкиниемиРО; Алахдаб Ф; Асгедом SW; Авасти А; Баркер-Колло С.Л.; Бауне Б.Т.; Бежо Ю; Белачев А.Б.; Беннетт Д.А.; Бьядго Б; Биджани А; Бин Саид М.С.; Брэйн С; Плотник ДО; Карвалью Ф;Катала-Лопес Ф; Серин Э; Чой JYJ; Данг АК; Дегефа М.Г.; Джалалиния С; Дубей М; Дюкен Э.Э.; Эдвардссон Д; Эндрес М; Эскандарие С; Фару А; Фарзадфар Ф; Ферештехнежад С.М.; ФернандесЭ; Филипп I; Фишер Ф; Гебре АК; Геремью Д; Гасеми-Касман М; Гнедовская Е.В.; ГуптаР; Хачинский В; Хагос ТБ; Хамиди С; Хэнки Дж.Дж.; Харо Дж.М.; Привет СИ; Ирвани ССН; Джа Р.П.; Йонас Дж. Б.; Калани Р; Карч А; Касаеян А; Хадер Ю.С.; Халил И.А.; Хан Э.А.; Ханна Т;Ходжа ТАМ; Хубчандани Дж; Киса А; Кисимова-Скарбек К; Кивимяки М; Коянаги А; КронКДж; Логроскино Дж; Лорковский С; Майдан М; Малекзаде Р; Марц В; Массано Дж; МенгистуГ; Меретоя А; Мохаммади М; Мохаммади-Ханапоштани М; Мокдад АХ; Монделло С; Моради Дж; Нагель Дж; Нагави М; Найк Г; Нгуен Л.Х.; Нгуен Т.Д.; Нирайо Ю.Л.; Никсон М.Р.; Офори-Асенсо Р.; Огбо ФА; Олагунью А.Т.; Оволаби М.О.; Панда-Йонас С; Пассос В.М. д. А.;Перейра Д.М.; Пинилья-Монсальве, Германия; Пирадов М.А.; Пруд КД; Пустчи Х; Корбани М; Радфар А; Райнер Р. К.; Робинсон С.Р.; Рошандель Г; Ростами А; Русь ТЦ; Сачдев П.С.; Сафари Н; СафириС; Сахатеван Р; Салими Ю; Сатпати М; Сони М; Сайлан М; Сепанлоу С.Г.; ШафиисабетА; Шейх М.А.; Сахрайан М.А.; Сигемацу М; Шири Р; Шиуэ I; Сильва Дж. П.; Смит М; СобханиС; Штейн диджей; Табарес-Сейседос Р.; Товани-Палоне MR; Тран БХ; Тран ТТ; Цегай А.Т.; УллахИ; Венкетасубраманиан Н; Власов В; Ван Ю.П.; Вайс Дж.; Вестерман Р; Видератне Т; ВайперГМА; Яно Ю; Йимер ЭМ; Ёнемото Н; Юсефард М; Заиди З; Заре З; Вос Т; Фейгин В.Л.; Мюррей К.Д.Л. Глобальное, региональное и национальное бремя болезни Альцгеймера и других деменций, 1990–2016 гг.: систематический анализ для исследования глобального бремени болезней, 2016 г. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [В pubmed: 30497964]

(2). Бейройтер К; Masters CL Белок-предшественник амилоида (APP) и бета-амилоид A4 в этиологии болезни Альцгеймера: взаимоотношения предшественник-продукт при нарушении функции нейронов. Патол мозга. 1991, 1, 241–251. [В pubmed: 1669714]

(3). Харди Дж; Хиггинс Г. Болезнь Альцгеймера: гипотеза амилоидного каскада. Наука 1992, 256,184–185. [В pubmed: 1566067]

(4). Белок Goedert M. Tau и нейрофибриллярная патология болезни Альцгеймера. Тенденции Neurosci.1993, 16, 460–465. [В pubmed: 7507619]

(5). Икбал К; Лю Ф; Gong CX Tau и нейродегенеративные заболевания: история на данный момент. Нат. Преподобный Нейрол. 2016, 12, 15–27. [В pubmed: 26635213]

(6). Мусик Е.С.; Хольцман Д.М. Три измерения амилоидной гипотезы: время, пространство и «ведомые». Нат. Нейроски. 2015, 18, 800–806. [В pubmed: 26007213]

(7). Такеда С. Распространение тау как диагностическая и терапевтическая мишень при деменции: потенциалы и вопросы без ответа. Передний. Нейроски. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Грегорич З.Р.; Ge Y. Нисходящая протеомика в здоровье и болезнях: проблемы и возможности. Протеомика 2014, 14, 1195–1210. [В pubmed: 24723472]

(9). Захарова Н.В.; Бугрова А.Е.; Кононихин А.С.; Индейкина, Авторы заявляют об отсутствии конкурирующего финансового интереса. МИ; Попов И.А.; Николаев Е.Н. Масс-спектрометрический анализ разнообразия пептидов Абета: трудности и перспективы открытия биомаркеров БА. Эксперт Рев.Протеомика 2018, 15, 773–775. [В pubmed: 30253669]

(10). Грассо Дж. Масс-спектрометрия — многогранное оружие, которое можно использовать в борьбе с болезнью Альцгеймера: бета-амилоидные пептиды и не только. Масс-спектр. Ред. 2019, 38, 34–48. [PubMed: 29905953]

(11). Андреев В.П.; Петюк В.А.; Брюэр Х.М.; Карпиевич Ю.В.; Се Ф; Кларк Дж; Лагерь Д; Смит Р.Д.; Либерман А.П.; Альбин Р.Л.; Наваз З; Эль Хокаем Дж; Майерс А.Дж. Количественная ЖХ-МС без маркировки протеомика болезни Альцгеймера и мозга нормально стареющего человека. J. Протеом Рез. 2012, 11,3053–3067. [В pubmed: 22559202]

(12). Чжан Ц; Ма С; Шестерня М; Ван П.Г.; Чин Л.С.; Ли Л. Интегрированный протеомный и сетевой анализ выявляет белковые центры и изменения сети при болезни Альцгеймера. АктаНейропатол. Коммун. 2018, 6, 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com