Эпигаллокатехин-3-галлат способствует созреванию in vitro и развитию эмбриона после ЭКО ооцитов свиней Часть 2

Пожалуйста, свяжитесь с намиoscar.xiao@wecistanche.comДля получения дополнительной информации

Результаты

Влияние EGCG на индекс кучевого расширения

Морфология зрелых ооцитов и ооцитов с первой экструзией полярного тела показана на дополнительных рисунках S1A и S1B соответственно. Во-первых, мы изучили индекс кучевого расширения в ооцитах после обработки различными концентрациями EGCG, и, как показано в таблице 1, EGCG при 5 и 10 мкМ значительно увеличил индекс расширения кучевой массы по сравнению с контрольной группой (группа 5 мкМ против группы 0 мкМ: 2,989 ±0,068 против 2,438±0,081;10 мкМ группы против группы 0 мкМ: 3,079±0,110 против 2,438±0,081). Однако EGCG при 20 мкМ не влиял на индекс кучевого расширения по сравнению с контрольной группой (группа 20 мкМ против группы 0 мкМ∶2,879±0,076 против 2,438±0,081).

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Влияние EGCG на скорость IVM ооцитов

Влияние EGCG на скорость созревания ооцитов in vitro было дополнительно определено. Как показано в таблице 2, скорость созревания ооцитов была выше в группах 5 и 20 мкМ по сравнению с контрольной группой EGCG 0 мкМ; в то время как разница не была статистически значимой (таблица 2). С другой стороны, лечение EGCG 10 мкМ значительно увеличивало скорость созревания ооцитов по сравнению с контрольной группой EGCG 0 мкМ (группа 10 мкМ против групп 0 мкМ∶58,63±2,79% против 46,27±3,25%; P<>

Влияние EGCG на окислительный стресс ооцитов

Производство ROS ооцитов, обработанных EGCG, было определено с помощью анализа производства ROS. Репрезентативные изображения флуоресцентных сигналов АФК в ооцитах после лечения различными концентрациями EGCG были показаны на рисунке 1А. Количественная оценка иммунофлуоресцентного окрашивания показала, что EGCG при 5 мкМ не влиял на выработку АФК в ооцитах по сравнению с контрольной группой 0 мкМ (рисунок 1B).EGCG при 10 и 20 мкМ значительно снижал уровни АФК ооцитов по сравнению с контрольной группой EGCG 0 мкМ (рисунок 1B).

Цистанхе может улучшить иммунитет

Поскольку EGCG на 10 мкМ мог увеличить индекс расширения кучевых масс и скорость созревания ооцитов, а также снизить уровень АФК в ооцитах, для последующих исследований был выбран EGCG на 10 мкМ. Как показано на рисунке 1C, EGCG при 10 мкМ значительно увеличилантиоксидантвместимостьЯйцеклетокпо сравнению с контрольной группой 0 мкМ (рисунок 1С). Кроме того, уровень глутатиона был повышен, в то время как уровень MDA был снижен в ооцитах, обработанных 10 мкМ EGCG (рисунок 1D и E). Кроме того, qRT-PCR была выполнена для определения уровней экспрессии мРНКокислительныйгены, связанные со стрессом, включая каталазу (CAT), глутатионпероксидаза(GPx) и супероксиддисмутаза (SOD). EGCG при 10 мкМ значительно повышал уровни экспрессии мРНК CAT, GPx и SOD по сравнению с контрольной группой 0 мкМ (рисунок 2A-C).

Влияние EGCG на уровни экспрессии мРНКАпоптозРодственные гены в ооцитах

QRT-PCR была выполнена для определения уровней экспрессии мРНК генов, связанных с апоптозом, включая

Bax, Bcl-2 и каспаза-3. EGCG при 10 мкМ значительно снижал уровни экспрессии мРНК Bax и каспазы-3 и увеличивал уровень экспрессии мРНК Bcl-2 по сравнению с контрольной группой 0 мкМ (рисунок 3A-C).

Влияние EGCG, используемой во время IVM и ЭКО, на потенциал развития ооцитов

Репрезентативные изображения эмбрионов и бластоцист были показаны на дополнительном рисунке SIC-S1E.

лечение во время ЭКО значительно увеличивало скорость расщепления и частоту бластоцисты по сравнению с контрольной группой (таблица 3). Лечение EGCG во время IVM значительно увеличивало скорость бластоцисты, но не скорость расщепления по сравнению с контрольной группой (таблица 3). Кроме того, лечение EGCG во время КАК IVM, так и IVC значительно увеличивало скорость расщепления и скорость бластоцисты по сравнению с другими тремя группами (таблица 3). Эти результаты показали, что EGCG во время IVM и IVF могут способствовать развитию потенциала ооцитов.

Влияние EGCG, используемого во время IVM и VC, на потенциал развития ооцитов

Лечение EGCG во время IVC значительно снижало скорость расщепления и скорости бластоцисты ооцитов по сравнению с группой без лечения EGCG (таблица 4). С другой стороны, лечение EGCG во время IVM значительно увеличивало скорость расщепления и скорость бластоцисты ооцитов по сравнению с группой без лечения EGCG (таблица 4). Лечение EGCG во время IVM и IVC значительно снижало скорость расщепления и скорость бластоцисты ооцитов по сравнению с группой без лечения EGCG и группой с лечением EGCG во время IVM (таблица 4). В совокупности эти результаты показали, что лечение EGCG во время IVM увеличивало потенциал развития ооцитов, в то время как лечение EGCG во время IVC ослабляло потенциал развития ооцитов.

Обсуждение

Метод IVM для COC был разработан и применен для производства потомства у млекопитающих, включая свиней, однако скорость образования бластоцитов после ЭКО все еще низка с использованием ооцитов IVM по сравнению с ооцитами in vivo-зрелыми, такими как свиньи. У свиней КОК обычно собирают из антральных фолликулов среднего размера (диаметром >3 мм), где ооцит обладает способностью индуцировать созревание ооцитов, тогда как фолликулярные соматические клетки не приобретают способность реагировать на стимулы овуляции. Кроме того, среды in vitro обычно увеличивают клеточную продукцию АФК, которая была вовлечена в качестве основной причины повреждения клеток.16 Поэтому оптимизация условий культивирования для имитации сред in vivo имеет важное значение для нормального роста и созревания ооцитов. В настоящем исследовании различные концентрации EGCG были добавлены в культуральную среду IVM, IVF и IVC для наблюдения за качеством созревания ооцитов. EGCG при 10 мкМ значительно улучшает IVM свиных ооцитов. В этом исследовании добавление EGCG во время ЭКО и IVC производит два разных эффекта. Добавление 10 мкМ EGCG во время ЭКО может способствовать скорости расщепления ооцитов, что согласуется с выводами Spinaci et al, показывающими, что добавление 10 мкМ EGCG во время ЭКО, но не IVM значительно увеличивает скорость оплодотворения.17Эффект добавления EGCG во время ЭКО может быть обусловлен его действием на сперму, а не на OOcyte.

В процессе посева in vitro ооциты и эмбрионы неизбежно подвергаются воздействию света и более высоких концентраций кислорода, чем in vivo, что может привести к усилению производства АФК (супероксид-анион, перекись водорода и высокореакционноспособный гидроксил). Большое количество исследований показало, что добавление антиоксидантов в среду IVM может улучшить способность эмбриона к развитию. Было обнаружено, что EGCG действует как антиоксидант, чтобы смягчить вредное воздействие материнской гипертермии на фолликулярные ооциты у мышей». Barberino et al продемонстрировали, что EGCG ослабляет апоптоз преантральных фолликулов через сигнальный путь фосфатидилинозитол-3-киназы / протеинкиназы B после посева in vitro ткани яичников овец». Huang et al предположили, что 50 мкМ EGCG может улучшить созревание яйцеклеток крупного рогатого скота, а защитная роль EGCG может быть коррелирована с его антиоксидантным свойством.°В сочетании с предыдущими исследованиями наши результаты показали, что влияние EGCG на IVM свиных ооцитов может быть связано с антиоксидантным и антиапоптозным эффектом, который был дополнительно изучен в настоящем исследовании.

Чрезмерное накопление АФК может привести к окислительному стрессу, и наши результаты показали, что EGCG может увеличить общую антиоксидантную способность и снизить уровень АФК и МДА в ооцитах свиней. Это может быть связано с тем, что EGCG может непосредственно устранять ROS и / или EGCG может действовать синергетически с антиоксидантной системой. Неферментативные системы полагаются на молекулы для непосредственного гашения АФК, в то время как ферментативные системы состоят из специфических ферментов, которые детоксифицируют АФК. В последнем случае семейство SOD играет важную роль в регуляции окислительного стресса. SOD является единственным известным ферментом, который непосредственно поглощает свободные радикалы, катализируя дисмутацию супероксидного аниона в перекись водорода. Фермент SOD регулирует уровни супероксида и перекиси водорода, продуцируемых клетками, а затем регулирует трансдукцию клеточного сигнала». Каталаза является важным антиоксидантом и маркерным ферментом пероксисом. На его долю приходится 40% от общего количества ферментов пероксисомы. Это антиоксидантный олигомер с четырьмя идентичными субъединицами, расположенными в тетраэдрах, и является важным ферментом, который защищает клетки от окислительного повреждения АФК.2Глутатион представляет собой трипептид, состоящий из глутаминовой кислоты, цистеина и глицина, содержащего Y-амидные связи и сульфгидрильные группы. Он может поддерживать нормальную функцию иммунной системы и обладает антиоксидантным действием. Глутатионпероксидаза (GPX) сочетает окисление GSH с H, O, детоксикацией.2«Исследования показали, что тепловой стресс может вызывать окислительный стресс в бубалиновых ооцитах, что вызывает устранение АФК системой защиты антиоксидантных ферментов.2 Наши исследования последовательно показали, что EGCG снижает уровень АФК и содержание MDA в ооцитах при одновременном увеличении внутриклеточного содержания GSH и общей антиоксидантной способности.

Процесс апоптоза может влиять на качество и выживаемость ооцитов и, таким образом, влиять на эмбриональное развитие. Белки семейства Bcl-2 играют ключевую роль в регулировании гибели клеток посредством сбалансированного взаимодействия между проапоптотическими и антиапоптотическими белковыми членами.24 Проапоптотический белок Bax является ядром митохондриально-зависимого апоптоза млекопитающих. Каспаза-3 также играет незаменимую роль в клеточном апоптозе. Каспаза-3 является важнейшим терминальным сплайсинговым ферментом в процессе клеточного апоптоза, а активированная каспаза-3 является ключевым исполнителем клеточного апоптоза. Наши результаты показывают, что EGCG повышал уровень экспрессии мРНК Bcl-2, но снижал уровни экспрессии мРНК Bax и caspase-3. В совокупности эти результаты подразумевают, что антиоксидантные и антиапоптотические эффекты EGCG в ооцитах свиней в значительной степени связаны с регуляцией SOD1, CAT и GPX, а также генов, связанных с апоптозом.

Таким образом, наши результаты показывают, что EGCG способствует созреванию in vitro и развитию эмбриона после ЭКО свиных ооцитов. Защитное действие EGCG на ооциты может быть связано с его антиоксидантными и антиапоптозными свойствами.

Финансирование

Это исследование было поддержано грантами Фонда естественных наук провинции Гуандун (2020Al515010976), Проекта местных инновационных и исследовательских групп Программы талантов жемчужной реки Гуандун (2019BTO2N630), Проектов стратегии инноваций в области науки и техники провинции Гуандун (2018B020203002).

Эта статья взята из Эта статья была опубликована в следующем журнале Dove Press: Проектирование, разработка и терапия лекарственных средств