Оценка омолаживающего действия комбинации пробиотиков, выделенной от долгожителей, на модели мышей SAMP8, часть 2

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Иммунофлуоресценция и обнаружение воспалительных факторов

Мозг фиксировали в параформальдегиде, а затем подвергали обезвоживанию, очистке, погружению в воск и заливке. Вложенную ткань нарезали непрерывно толщиной 5 мкм. Срезы депарафинизировали и уравновешивали водой, подвергали извлечению антигена и инкубировали в 5-процентном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 30 мин. Затем срезы инкубировали с соответствующими первичными и вторичными антителами. Затем ядра окрашивали DAPI. После монтажа срезов их просматривали под прямым флуоресцентным микроскопом и получали изображения.флавоноидыКоличество NeuN-позитивных клеток подсчитывали с использованием программного обеспечения Image (National Institutes of Health). Среднее число клеток/поле зрения использовали для статистического анализа. Для выявления факторов воспаления белок экстрагировали из головного мозга, следуя тому же методу, который описан для вестерн-блоттинга. Следующие наборы использовали для оценки уровней воспалительных факторов в гиппокампе мышей в соответствии с инструкциями производителя: IL-1 (Proteintech, кат. № KE10003), TNF- (Proteintech, кат. № KE10002) и IL{ {5}} (Proteintech, № по каталогу KE10007).

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Бактериальная экстракция ДНК

Для анализа микробиоты собирали фекалии каждой группы мышей (n=8). Набор геномной ДНК (Qiagen, номер по каталогу 51804) использовали для выделения фекальной геномной ДНК в соответствии с инструкциями по продукту. Затем на спектрофотометре NanoDrop определяли концентрацию и качество выделенной ДНК. Геномная ДНК повторно экстрагировалась для образцов, не отвечающих требованиям качества. Участок 16S рибосомной ДНК (рДНК) V4 амплифицировали с использованием следующих праймеров: 515F,5'-GTG CCA GCMGCC GCG GTAA-3; 806R,5'-GGA CTA CVSGGG TAT CTAAT-3'. Для секвенирования использовали платформу IlluminaHiSeq2000.гесперидин используетРезультаты секвенирования депонированы в GenBank (инвентарный номер PRJNA768326).

Высокопроизводительное секвенирование Данные были подвергнуты шумоподавлению последовательности или кластеризации операционных таксономических единиц (OTU) с использованием процесса анализа программного обеспечения Search или анализа QIIME2 DADA2. Способ поиска (20) в основном включает в себя снятие начальных значений, сплайсинг, фильтрацию качества, дедупликацию, дехимеризацию, кластеризацию и другие этапы для получения OTU. Метод DADA2 в основном выполняет этапы депрайминга, качественной фильтрации, шумоподавления, сплайсинга и дехимеризма. Каждая дедуплицированная последовательность, созданная после контроля качества DADA2, называется вариантом последовательности ампликона (ASV) или функциональной последовательностью (соответствует репрезентативной последовательности OTU). Затем ASV и OTU использовались для анализа видового состава, альфа-разнообразия, бета-разнообразия, видового анализ различий и виды символов и т. д.

Цистанхе может омолаживать

Статистический анализ

Для статистического анализа использовали GraphPad Prism 7.потерянная империяДанные выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовали для определения статистически значимой разницы (p<>

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Пробиотические свойства

Во-первых, мы провели эксперименты по устойчивости к кислотам, солям желчных кислот и антибактериальным препаратам для оценки пробиотических характеристик выбранных штаммов. Четыре выбранных пробиотика были устойчивы к кислоте средней силы (рис. 1А) и выживали при различных концентрациях солей желчных кислот (рис. 1В). Как показано на рисунке 1A, через 4 часа в PBS с pH 3 выживаемость L. fermentum SX-0718, L. Casey SX-1107, B. long SX-1326 и B. animalis SX -0582 составляли 80,2%, 92,4%, 99,0% и 99,5% соответственно. .микронизированная очищенная флавоноидная фракция 1000 мг.longum SX{{0}} показал отличную переносимость солей желчных кислот: при концентрации 0,5 процента выживаемость по-прежнему составляла 85,4 процента. Кроме того, выбранные пробиотики значительно ингибировали рост патогенов S. Typhimurium ATCC 1331l. , Sh.flexneri ATCC 12022, P.acnes ATCC 11827, Sh.dysenteriae 301, E. coli O157, S. enteritidis ATCC 13076, L. monocytogenes ATCC 19111, Staph. aureus Cowan и C.albicans SC531 с площадью подавления от 15,25 мм до 22,5 мм (рис. 1С).

Комбинация пробиотиков улучшила поведение мышей SAMP8

Лабиринтный тест Барнса использовался для оценки влияния комбинации пробиотиков на способности к пространственному обучению и памяти. По сравнению с группой С, при ежедневных тренировках мышам группы М требовалось значительно больше времени для поиска платформы, в то время как комбинация пробиотиков (группа L и Н) значительно уменьшала латентный период выхода, латентный период поиска нужного отверстия.отефлавоноидВ пробном тесте латентный период комбинированного лечения пробиотиками был значительно короче, чем у группы М (L vs.M=27.4s vs.48.19s;p<0.001; vhs.m=""><0.001), and="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" low-dose="" and="" high-dose="" probiotics="" (figure="">

Тест на полюсе был проведен для наблюдения за влиянием комбинации пробиотиков на двигательную дисфункцию мышей SAMP8. Как показано на рисунке 2, по сравнению с группой C, группа M показала значительную двигательную заторможенность (M против C=19,46 с против 8,877 с; p<0.001), and="" treatment="" with="" either="" low="" or="" high="" concentrations="" of="" the="" probiotic="" combination="" significantly="" alleviated="" the="" motor="" dysfunction="" of="" samp8="" mice(l="" vs.m="13.78" s="" vs.19.46=""><0.001; vhs.m="10.73s" vs.19.46=""><>

Тест «открытое поле» использовался для выявления поведенческих и психических изменений мышей в новой среде, таких как исследовательское поведение и тревога. Экспериментальные параметры показали, что по сравнению с мышами в группе M (расстояние =4384 см, количество=109, расстояние =574.6), мыши в группах C, L и H имели более длительное общее движение. расстояние(расстояние =

5505 см, расстояние =5474 см, расстояние=5313 см; С против М, П<0.05;l vs=""><0.05;h vs=""><0.05),more times="" to="" enter="" the="" central="" area="" (number="59.33," number="91.56," number="104.8;C" vs=""><0.05;l vs=""><0.05;h vs=""><0.05)and longer="" central="" movement="" distance="" (distance="1379" cm,="" distance="1187" cm,="" distance="1416" cm;="" c="" vs="" m,=""><0.05;l vs="" m,=""><0.05;h vs=""><0.05).in addition,there="" was="" no="" dose-dependent="" in="" probiotics="">

Комбинация пробиотиков уменьшала гибель нейронов и предотвращала снижение экспрессии Sirt 1 в гиппокампе мышей SAMP8. Снижение количества нейронов гиппокампа у мышей SAMP8 тесно связано с ухудшением обучения и памяти. Поэтому мы определили количество нейронов в гиппокампе мышей SAMP8 с помощью иммуноокрашивания NeuN. По сравнению с группой С, в группе М было меньше нейронов гиппокампа; комбинация пробиотиков защищала нейроны гиппокампа по сравнению с группой М (рис. 3А). Потеря нейронов из-за апоптоза, регулируемого Bax и Bcl-2-, играет важную роль в возникновении и развитии старения. p-AKT может модулировать апоптоз, регулируя Bcl-2/Bax. Мы оценили экспрессию Bax, Bcl-2 и p-AKT в гиппокампе мышей с помощью вестерн-блоттинга. Результаты показали, что экспрессия проапоптотического белка Bax у мышей группы М была значительно выше, чем у мышей С, а экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 и p-AKT была значительно ниже, чем у мышей группы М. М, тогда как экспрессия проапоптотического белка в группах L и H была значительно ниже, чем в группе М, а экспрессия апоптотического белка была заметно выше, чем в группе М. Кроме того, экспрессия Sirt 1 в группах C, L и H была значительно выше, чем в группе М, что указывает на то, что комбинация пробиотиков может ингибировать снижение экспрессии Sirt 1 у стареющих мышей. Комбинация пробиотиков ингибирует сигнальный путь TLR4/NF-B и воспаление гиппокампа у мышей SAMP8. Воспаление играет важную роль в поддержании и ускорении старения, а путь TLR4/NFkB тесно связан с воспалением. Следовательно, мы оценили экспрессию белков, участвующих в сигнальном пути TLR4/NFkB в гиппокампе, с помощью вестерн-блоттинга. По сравнению с группой М, комбинация пробиотиков значительно снижала TLR4,

Экспрессия MyD88 и p-p65/p65 (рис. 4A, p<0.01). in="" addition,="" the="" detection="" of="" inflammatory="" factor="" protein="" levels="" showed="" that="" the="" probiotic="" combination="" significantly="" reduced="" the="" relative="" expression="" of="" the="" pro-inflammatory="" cytokine="" il-1β,="" il-6,="" and="" tnf-α="" compared="" with="" the="" m="" group,(figure="" 4b;=""><0.01). these="" results="" suggest="" that="" the="" probiotic="" combination="" modulates="" the="" upregulation="" of="" tlr4/nfkb="" signaling="" pathway="" components="" to="" reduce="" inflammation="" in="" samp8="">

Комбинация пробиотиков изменила состав кишечной микробиоты мышей SAMP8. Кишечная микробиота тесно связана с возникновением и развитием старения. Мы собрали фекалии мышей и проанализировали изменения их кишечной микробиоты с помощью высокопроизводительного секвенирования. Всего было получено 1 138 968 действительных меток и 10 202 OTU, в среднем 2550,25 на группу (данные не показаны). Чтобы проанализировать влияние комбинации пробиотиков на кишечную микробиоту мышей SAMP8, мы провели анализ разнообразия микробиоты. . Индекс Observed_видов представляет фактическое наблюдаемое количество OTU, а индекс Chaol указывает на разнообразие микробиоты. Как показано на рис. 5, наблюдаемый_видовой индекс и индекс Chaol группы мышей М были снижены, в то время как пробиотическая комбинация увеличивала обилие и разнообразие кишечной микробиоты, хотя изменения не были значительными (рис. 5А, Б). Диаграмма Венна показывает 441 общий OTU среди всех групп с 47, 42, 69 и 57 уникальными OUT для групп C, M, L и H соответственно (рис. 5C). Кроме того, анализ главных координат (PCoA), использованный для изучения сходства микробных сообществ, показал, что точки группы C сгруппированы вместе, точки группы M относительно разбросаны, а выборки C, L и H-группы имеют высокое сходство. Эти результаты показывают, что комбинация пробиотиков изменяет кишечную микробиоту стареющих мышей по типу, аналогичному таковому у нормальных мышей (рис. 5D). Мы проанализировали относительную численность 20 основных родов бактерий среди различных групп. Наблюдалось заметное увеличение относительной численности Alisipes, Prevotella, Odoribacter, Lactobacillus и Oscillibacter и снижение относительной численности Alloprevotella, Barnesiella и Akkermansia. По сравнению с группой М, комбинация пробиотиков снизила относительное количество Aliscipes и Prevotella и увеличила относительное количество Alloprevotella, Acetatifactor и Clostridium XIVa (рис. 5E). Комбинация пробиотиков облегчала воспаление толстой кишки и снижала экспрессию белков плотных контактов у мышей SAMP8. Дисбаланс микробиоты кишечника и воспаление кишечника могут быть причинно связаны друг с другом. Поэтому окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) использовали для выявления патологических изменений в толстой кишке мышей, а вестерн-блоттинг применяли для выявления экспрессии ключевых белков в воспалительном пути TLR4/NFKB и белков, связанных с кишечной проницаемостью, в толстой кишке мышей. салфетка. Как показано на рисунке 6, эпителиальные клетки слизистой оболочки были отслоены, и небольшое количество структуры кишечных желез было разрушено в толстой кишке мышей в группе М, в то время как эпителиальные клетки слизистой оболочки не отпадали, а структура кишечных желез сохранялась в тканях кишечника. группы C, L и H. Кроме того, мы использовали вестерн-блот для изучения экспрессии ключевых белков в воспалительном пути TLR4/NFKB, а также

белки, связанные с кишечной проницаемостью. По сравнению с группой C экспрессия ZO-1 и окклюдина снизилась, а экспрессия TLR4, MyD88 и p-p65 увеличилась в группе M. Комбинация пробиотиков значительно увеличивала экспрессию ZO-1 и окклюдина, что указывает на повышение целостности кишечного барьера, и снижала экспрессию TLR4, MyD88 и pp65 -, что указывает на модуляцию воспаления кишечника (рис. 6B). , С).

ОБСУЖДЕНИЕ

Старение населения является заметной глобальной проблемой современного общества. Старение может привести к ряду физических изменений и ненормального поведения, таких как выпадение волос, дряблость кожи, снижение умственных способностей, ухудшение памяти и даже слабоумие (21). Проблемы со здоровьем, вызванные старением, представляют собой серьезную проблему в области здравоохранения (12). В настоящее время нет хорошего способа предотвратить или лечить старение. Поэтому срочно необходимы исследования, связанные с лечением против старения и заболеваниями, связанными со старением. Мышь SAMP8 демонстрирует быстрое старение, которое согласуется с тем, что происходит у людей. Он в основном характеризуется снижением обучаемости и памяти, когнитивными нарушениями и нейродегенеративными изменениями. Это обычная модель естественного патогенеза для изучения деменции и старения (22). В этом исследовании мышей SAMP8 использовали для оценки эффектов комбинации пробиотиков. Во-первых, мы идентифицировали четыре пробиотика (L. fermentum SX-0718, L. casei SX-1107, B.longum SX-1326 и B.animalis SX-0582; Jiangxi Shanxing Biotechnology Co., Ltd, Наньчан, Цзянси, КНР) из фекалий долгожителей. Эксперименты in vitro подтвердили, что они обладают хорошей кислотостойкостью, устойчивостью к солям желчных кислот и антибактериальными свойствами (рис. 1). Кроме того, комбинация пробиотиков может облегчить потерю веса и снизить показатель старения мышей SAMP8 (дополнительные рисунки 1B, C). В поведенческих тестах стареющие мыши показали нарушение пространственной памяти, двигательную дисфункцию и снижение исследовательского поведения (рис. 2). Комбинация пробиотиков смогла улучшить эти изменения, что указывает на то, что она может оказывать омолаживающее действие. Учитывая многообещающие поведенческие данные, мы изучили возможный омолаживающий механизм комбинации пробиотиков. Гиппокамп участвует в обучении и памяти, и повреждение этой области мозга может вызвать ухудшение обучения и памяти, а также нарушения пространственного позиционирования (23). По сравнению с группой С в гиппокампе группы М было меньше нейронов. Комбинация пробиотиков может облегчить потерю нейронов у мышей SAMP8 (рис. 3А). Многие исследования показали, что сигнальный путь AKT играет значительную роль в апоптозе и метаболизме нейронов. Сигнальный путь AKT улучшает выживаемость клеток за счет регуляции транскрипционного фактора forkhead (FKHR), а также мишени рапамицина у млекопитающих (mTOR) для увеличения синтеза белка и воздействия на нервы. Рост синапсов и развитие синаптической пластичности в конечном итоге влияют на обучение и память.

функции (24,25). p-AKT может напрямую регулировать образование гетеродимера Bcl-2/Bax через фосфоинозитид 3-киназу (PI3K)-1 (26). Sirt I играет важную роль в развитии мозга и нейронов, а также в патогенезе БА. Нейродегенерация и когнитивная функция значительно улучшаются после инъекции вируса, кодирующего Sirt 1, в гиппокамп (27). Исследование Zhou et al. (28) также показали, что блокирование Sirt 1 с помощью малой интерферирующей РНК (siRNA) может ускорить развитие патологии AD и когнитивных нарушений. Более того, существует взаимодействие Sirt 1 и AKT. Гистонацетилтрансфераза (HAT) может ингибировать фосфорилирование AKT, в то время как Sirt 1 представляет собой гистондеацетилазу (HDAC), которая использует NAD для деацетилирования AKT на остатках лизина, на которые нацелена HAT (29). Sirt 6 представляет собой еще одну зависимую от NAD плюс деацетилазу, Kawahara et al. (30) обнаружили, что Sirt 6 может быть рекрутирован на промоторы нижестоящих генов NFkB, снижая уровень ацетилирования промотора и ингибируя экспрессию нижестоящих генов, связанных с апоптозом и клеточным старением. Исследования показали, что сверхэкспрессия Sirt 6 может увеличить продолжительность здоровой жизни мышей в среднем на 30 процентов (31), поэтому Sirt 6 может быть еще одним механизмом, с помощью которого пробиотики оказывают омолаживающее действие, хотя эта возможность требует дальнейшего изучения. Обнаружение NeuN-позитивных клеток, апоптоза, белков, связанных с пролиферацией, и Sirt 1 в гиппокампе продемонстрировало, что комбинация пробиотиков может предотвратить потерю нейронов гиппокампа (рис. 3). Нейропротекторный эффект комбинации пробиотиков на нейроны гиппокампа может быть обусловлен регуляцией сигнального пути AKT и Sirt 1.

Нейровоспаление играет важную роль в связанных со старением неврологических заболеваниях, таких как БА и БП (32). При этих заболеваниях различные воспалительные факторы (пищевые антигены, липополисахариды, свободные жирные кислоты, активные формы кислорода и т. д.) связываются с TLR и активируют NFkB. , важный фактор иммунной системы и воспалительного процесса после передачи сигнала. Это явление приводит к высвобождению многих провоспалительных факторов (IL-1B, IL-6, TNF-x и др.), вызывая нейровоспаление, повреждение головного мозга и гибель нейронов (32, 33). Некоторые препараты могут облегчать прогрессирование нейродегенеративных заболеваний, таких как БА и БП, путем модулирования нейровоспаления (34,35). }} , TNF- и IL-6 были значительно снижены в группах L и H (рис. 4), что указывает на то, что комбинация пробиотиков может ингибировать нейровоспаление у стареющих мышей и защищать нейроны.

Микробиота кишечника тесно связана со здоровьем человека. В нормальных физиологических условиях хозяин и кишечная микробиота поддерживают экологический баланс за счет синергетического антагонизма. Локальная и постоянная аномальная активность кишечных микробов может вызвать воспаление слизистой оболочки кишечника. Однако местные воспалительные реакции нередко приводят к возникновению хронического вялотекущего воспаления во всем организме. Хроническое слабовыраженное воспаление слизистой оболочки кишечника приводит к разрушению кишечного барьера, и многие вредные факторы (липополисахариды, патогенные бактерии и др.) попадают в организм, вызывая нейровоспаление (14,16,32). Мы обнаружили изменения в кишечных микробах мышей с помощью высокопроизводительного секвенирования. По сравнению с группой С разнообразие и богатство микробиоты кишечника в группе М были снижены. Комбинация пробиотиков противодействовала этим изменениям микробиоты кишечника и способствовала восстановлению гомеостаза кишечника (рис. 5А, В). На основании PCoA мы обнаружили, что после лечения комбинацией пробиотиков микробиота кишечника стареющих мышей агрегировала с микробиотой кишечника группы С (рис. 5D), что указывает на то, что комбинация пробиотиков восстанавливает микробиоту кишечника стареющих мышей до состав обычных мышей. В соответствии с выводами других авторов, численность Akkermansia muciniphila снижалась, а численность Prevotella увеличивалась у стареющих мышей (15). Более того, комбинация пробиотиков снижала относительную численность алистипеса и превотеллы (рис. 5Е). Аккермансия может улучшать обмен веществ, оказывает противовоспалительное действие и повышает эффективность иммунотерапии; он также тесно связан с барьерной функцией кишечника. Снижение Akkermansia может вызвать повреждение кишечного барьера и привести к воспалению в организме (36). Алистипес является грамотрицательным анаэробом и факультативным патогеном. Обилие алистипеса увеличивается у пациентов с депрессией (37). В микробах кишечника пациентов с синдромом кишечной раздражительности алистипес имеет тенденцию к увеличению, и это изменение может быть одной из основных причин депрессии у таких пациентов (38).пуритане витамин сИсследователи обнаружили, что Алистипес может влиять на использование триптофана, нарушая баланс серотонинергической системы в кишечнике, а затем подавляя электрическую активность мозга, что может привести к когнитивной дисфункции (37). Prevotella относится к роду незаменимых бактерий в здоровой кишечной биоте. Однако исследования показали, что бактерии Prevotellaceae увеличивают микробиоту кишечника пациентов с шизофренией (39). Обилие Prevotella в кишечной микробиоте больных детским церебральным параличом и детей с церебральным параличом и эпилепсией значительно увеличивается (40). Повышенное содержание Prevotella может быть связано с такими заболеваниями, как пародонтит, бактериальный вагиноз, ревматоидный артрит, нарушением обмена веществ и вялотекущим системным воспалением(41-43). Это может быть связано с кишечной колонизацией Prevtella, приводящей к изменениям метаболизма микробиоты, снижению продукции IL-18, что усиливает воспаление кишечника и может привести к системному аутоиммунитету (44).

Исследования показали, что дисфункция кишечного барьера и, следовательно, хроническое воспаление кишечника играют важную роль в старении (45). Поэтому мы исследовали патологические изменения в толстой кишке у мышей и обнаружили экспрессию компонентов воспалительного пути TLR4/NFKB (TLR4, MyD88 и p-p65) и белков плотных контактов (ZO-1 и окклюдин) в двоеточие. Эпителиальные клетки слизистой оболочки толстой кишки стареющих мышей отпадали, а небольшое количество структуры кишечных желез разрушалось. Комбинация пробиотиков противодействовала этим изменениям (рис. 6А). По сравнению с группой C сигнальный путь TLR4/NFKB был активирован в группе M с повышенной экспрессией связанных с воспалением белков TLR4 и MyD88, что, в свою очередь, повысило уровень p-p65 (рис. 6B). В то же время,

экспрессия ZO-1 и окклюдина значительно снизилась (рис. 6C). Лечение комбинацией пробиотиков уменьшало воспаление кишечника и повышало целостность кишечного барьера.

Таким образом, мы показали, что пробиотическая комбинация, разработанная путем скрининга фекалий долгожителей, увеличивает экспрессию связанных с кишечной проницаемостью белков ZO-1 и окклюдина, регулируя микробиоту кишечника. Он также ингибирует индуцированное TLR4/NFkB воспаление кишечника и, следовательно, нейровоспаление через ось кишечник-мозг и повышает экспрессию Sirt 1 для защиты нейронов гиппокампа (рис. 7). Эти изменения лежат в основе улучшения пространственной памяти, двигательной функции и исследовательского поведения стареющих мышей. Наше исследование создает основу для того, чтобы комбинация пробиотиков стала пищевой добавкой для борьбы со старением.

Эта статья взята из Frontiers in Immunology|www.frontiersin.org Декабрь 2021 г.|Том 12|Артикул 792746