Экспрессия почечного витамина D и генов, связанных с фосфатонином, в модели остеопороза у овец

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный:Остеопороз является серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире, при этом постменопаузальный остеопороз из-за дефицита эстрогена возникает примерно в 3/4 случаев. В этом исследовании 18 старых овец-мериносов подверглись овариэктомии, а 10 из них были контрольными. Трем овариэктомированным овцам еженедельно вводили 400 мг метилпреднизолона в течение 5 месяцев, а трем — еженедельно в течение 2 месяцев, после чего следовал 3-месячный период восстановления. Через 2 месяца пять контрольных животных и шесть животных с овариэктомией были подвергнуты эвтаназии. В 5 месяцев всех оставшихся овец усыпили. Образцы почек собирали посмертно для количественного ПЦР-анализа NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA и NCX1. Овариэктомированные овцы имели значительно большую экспрессию VDR по сравнению с другими группами. Овариэктомированные овцы, получавшие глюкокортикоиды в течение 2 месяцев с последующей эвтаназией через 5 месяцев, показали значительные различия в экспрессии генов TRPV5, CYP24A1 и klotho по сравнению с другими группами. Различия в экспрессии klotho были наиболее заметны после корректировки повторных измерений (p=0.1). Клото известен как «антивозрастной» гормон и участвует в метаболизме кальция и фосфора. Klotho может участвовать в восстановлении минеральной плотности костей у овец после овариэктомии, получавших глюкокортикоиды в течение 2 месяцев с последующей эвтаназией через 5 месяцев. Рекомендуется дальнейшее исследование роли klotho.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Ключевые слова:остеопороз; овец; Витамин Д; фосфатирование; кПЦР; метаболизм кальция; фосфорный обмен; клото

1. Введение

Остеопороз является серьезной проблемой общественного здравоохранения для все более стареющего населения мира, который обошелся Соединенным Штатам Америки почти в 17 миллиардов долларов США в 205 году и, по прогнозам, вырастет до 25 миллиардов долларов США в 2025 году [1,2]. Приблизительно 70-75 процентов бремени остеопороза связано с постменопаузальным остеопорозом у женщин [1], первичным остеопорозом, при котором дефицит эстрогена приводит к уменьшению костеобразования и усилению резорбции кости, что приводит к снижению костной массы и хрупкости костей [3] . Остеопороз также может возникать вторично по специфическим причинам, таким как лечение глюкокортикоидами. Овца является хорошо зарекомендовавшей себя моделью крупных животных для различных заболеваний скелета человека, включая остеопороз [4]. Одним из преимуществ крупных животных-моделей, таких как овцы, является возможность тестировать ортопедические имплантаты, хирургические методы и биоматериалы [4]. Кроме того, овцы относительно дешевы, просты в обращении и предоставляют богатый материал для тестирования. [4,5].

Наиболее распространенными моделями остеопороза у овец являются овцы с овариэктомией через 12 месяцев после операции и овцы с овариэктомией 6-месяцев, находящиеся на диете с дефицитом кальция и витамина D и получающие глюкокортикоиды [4]. Используя комбинацию известных факторов, индуцирующих остеопороз, включая овариэктомию, лечение глюкокортикоидами и диету с низким содержанием кальция, мы смогли создать модель остеопороза у овец всего за 5 месяцев [6,7], тем самым сократив содержание, труд, и затраты на корма, связанные с разработкой модели. В этой модели было обнаружено, что овариэктомия увеличивает концентрацию в сыворотке С-концевых телопептидов коллагена I типа (CTX-I, маркер резорбции кости) и остеокальцина (маркер резорбции кости) по сравнению с контрольной овцой. Овцы, получавшие лечение глюкокортикоидами в течение 2 месяцев, имели более высокие концентрации CTX-I в сыворотке и более низкие концентрации остеокальцина в сыворотке. Кроме того, плотность костей бедренного и поясничного отделов позвоночника, а также общая и трабекулярная объемная минеральная плотность костей проксимального отдела большеберцовой кости были ниже в экспериментально обработанных группах по сравнению с контрольными группами, особенно у овец, подвергнутых овариэктомии, получавших глюкокортикоиды [6]. Аминокислотный и липидный обмен также был изменен у овец после овариэктомии и лечения глюкокортикоидами [7].cistanche wirkungПодобные изменения также были обнаружены в других моделях остеопороза овец [8].

Цистанхе может омолаживать

Гены, чувствительные к витамину D, и система фосфатирования ранее не изучались на моделях овец после овариэктомии. Витамин D, активной формой которого является 1,25-дигидроксивитамин D, в конечном итоге приводит к увеличению концентрации ионизированного кальция и фосфора в плазме за счет связывания с гетеродимером рецептора витамина D (VDR)-ретиноида X и изменения экспрессии многочисленных витаминов. D-чувствительные гены, такие как кальций-связывающие белки (кальбиндин D9 и 28k (CalD9k, CalD28k)) и кальциевые каналы (член 5 и 6 подсемейства V подсемейства катионных каналов временного рецепторного потенциала (TRPV5, TRPV6), кальций-АТФаза плазматической мембраны (PMCA) , натрий-кальциевый обменник 1(NCX1)[9].Выработка 1,25-дигидроксивитамина D является строго регулируемой стадией, посредством которой почечная логидроксилаза (CYP27B1) катализирует превращение 25-гидроксивитамина D до 1,25-дигидроксивитамина D, а фермент 24-гидроксилаза (CYP24A1) расщепляет как 25-гидроксивитамин D, так и 1,25-дигидроксивитамин D на неактивные побочные продукты.цистанчеФосфатирующая система также контролирует концентрацию фосфора и кальция в плазме [10]. Ключевым элементом этой системы является фактор роста фибробластов 23, который продуцируется остеоцитами в костях и в первую очередь контролирует концентрацию фосфора в плазме путем связывания с кофактором klotho для снижения экспрессии натрий-фосфатных котранспортеров (NPT1, NPT2a, NPT2c). [11]. Из-за взаимосвязанных эффектов паратиреоидного гормона и 1,25-дигидроксивитамина D определение влияния FGF23 на метаболизм кальция представляет собой сложную задачу, но есть данные, свидетельствующие о том, что он может регулировать всасывание кальция в кишечнике и в почках. реабсорбция кальция [12,13].

Глюкокортикоиды оказывают многочисленные эффекты на метаболизм кальция и фосфора, включая ингибирование всасывания кальция в кишечнике, снижение реабсорбции кальция в почечных канальцах и снижение реабсорбции фосфора в почках [14-16]. Кроме того, в небольшом количестве исследований изучалось влияние дефицита эстрогена на гены, чувствительные к витамину D, и на систему фосфатирования [17,18].

Эта модель остеопороза овец с овариэктомией, диетой с низким содержанием кальция и лечением глюкокортикоидами предоставила возможность получить предварительную информацию о влиянии этих методов лечения на экспрессию генов, отвечающих за фосфатирование и витамин D, в почках овец. Это исследование преследовало две цели: (1) определить, изменили ли овариэктомия или овариэктомия и лечение глюкокортикоидами экспрессию витамина D и генов, связанных с фосфатированием, в почках; (2) определить отношения между почечным витамином D и генами, связанными с фосфатированием, сывороточный витамин D и сывороточные маркеры метаболизма костной ткани (CTX-I и остеокальцин).

2. Материалы и методы

Ранее были опубликованы подробные методы разработки модели остеопороза у овец после овариэктомии и лечения глюкокортикоидами [6]. Вкратце, старых мериносовых овец (7-9 лет, n=28) случайным образом распределили на группы: контрольную (n=10), овариэктомированную (OVX) (n=12), овариэктомированную и лечение глюкокортикоидами (40 мг метилпреднизолона подкожно) ежемесячно в течение 2 месяцев с последующим отсутствием лечения в течение 3 месяцев (n=3) и лечение глюкокортикоидами (400 мг метилпреднизолона) ежемесячно в течение 5 месяцев (n=3) .цитрусовые биофлавоноидыОвец содержали в сарае и кормили либо контрольным (115 г/кг кальция; 2,2 г на овцу в день), либо кормом с низким содержанием кальция (5 г/кг кальция; 1 г на овцу в день) кормом с концентратом овечьих гранул [19]. Поддерживающие потребности для нестельных овец составляют 1,2 г на овцу в день[19].

Образцы крови собирали путем пункции яремной вены через 2 и 5 месяцев после операции. Остеокальцин измеряли с использованием набора для иммуноанализа Micro Vue Osteocalcin, а CTX-I — с помощью набора IDS Serum CrossLaps ELISA, как сообщалось ранее [6]. , Калифорния, США). Концентрацию 25-гидроксивитамина D в сыворотке измеряли с помощью жидкостной хроматограммы с изотопным разбавлением и масс-спектрометрии в Endolab, Canterbury Health Laboratories, Крайстчерч, Новая Зеландия.

Через несколько месяцев 5 овец из контрольной группы и 6 из группы OVX были подвергнуты эвтаназии и вскрытию. Через 5 месяцев оставшихся овец также подвергли эвтаназии (контрольная группа n =5, группа OVX n=6, OVX плюс 2 млн глюкокортикоидов n=3 и OVX плюс 5 млн глюкокортикоидов n=5 ) и вскрытие. Образцы почек были собраны в течение 30 минут после смерти и разделены на две части: один образец был помещен в 10-процентный нейтральный забуференный формалин и обработан для гистологии, а другой образец был быстро заморожен в жидком азоте и хранился при -80 градусах до обработки гематоксилином и Окрашенные эозином срезы почек были исследованы основным автором и подтвердили отсутствие значительных поражений.

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Университета Мэсси (номер утверждения 14/103) и проводились в соответствии с Кодексом этического поведения при использовании живых животных для исследований в Университете Мэсси, Палмерстон-Норт, Новая Зеландия.

Экстракцию РНК и количественную ПЦР проводили, как описано ранее [20,21]. Вкратце, Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Дармштадт, Германия) использовали для выделения РНК в соответствии с инструкциями производителя. Геномную ДНК удаляли с помощью Ambion Turbo DNA free (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию РНК определяли с помощью флуориметра Qubit 2.0 и набора для анализа широкого диапазона РНК Qubit (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США), а качество РНК оценивали путем определения соотношения 260/280 и прогона. на агарозном геле. Набор для синтеза кДНК первой цепи Transcriptor (Roche) использовали для синтеза кДНК. Каждые 20 мкл реакционной смеси содержали 600 нг РНК, 2,5 мкМ олиго(dT), 8 мМ реакционного буфера RT, 1 мМ dNTP, 10 ед. обратной транскриптазы, 20 ед. ингибитора РНКазы и воду без РНКазы-Дназы. Реакцию проводили при 55°С в течение 30 мин, 85°С в течение 5 мин, а затем охлаждали до 4°С с использованием термоциклера Applied Biosystems Veriti (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США). КПЦР в реальном времени проводили с использованием машины для ПЦР в реальном времени StepOne Plus (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Уолтем, Массачусетс, США). Каждая смесь для ПЦР содержала 5 мкл мастер-микса Power SYBR Green PCR (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США), прямого и обратного праймеров в концентрациях, перечисленных в таблице S, 10 нг кДНК, а затем доводили до 10 мкл. с РНКазой, водой без ДНКазы. Протокол ПЦР состоял из 95° в течение 20 с, 40 циклов при 95° в течение и 60° в течение и, наконец, кривой плавления в диапазоне от 60° до 95° со скоростью нагревания 0,3°/15 с. Вода и реакционная смесь без обратной транскриптазы включались в качестве отрицательного контроля в каждый цикл ПЦР, и все образцы анализировались в двух экземплярах. Были оценены следующие гены: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA и NCX1. Ранее было обнаружено, что PKG1 и SDHA стабильно экспрессируются в почках овец [20], и образцы были нормализованы относительно экспрессии этих генов и эффективности генов с использованием метода 2-AACt [22].

Статистический анализ был выполнен с использованием R Studio 1.3.1093[23] с версией R

4.0.3 и tidyverse, nlme 3.1-150 и Гэри

2.1.2 пакеты. Линейные модели были применены к данным экспрессии трансформированных генов log10. В первой модели экспрессия гена была переменной результата, в то время как группа (контроль или OVX, но исключая овец, получавших глюкокортикоид) и время (эвтаназия на 2 или 5 мес) были зависимыми переменными с включенным термином взаимодействия (группа: время). Во второй модели экспрессия генов была переменной исхода, в то время как группа (контроль, OVX, OVX с лечением глюкокортикоидами в течение 2 месяцев и OVX с лечением глюкокортикоидами в течение 5 месяцев) была зависимой переменной.Преимущества киноморияПоскольку несколько переменных исхода (гены) тестировались на различия между группами, значения p были скорректированы для множественного тестирования с использованием последовательной процедуры Холма [24]. Концентрации кальция, фосфора и 25-гидроксивитамина D в сыворотке были протестированы на моделях экспрессии генов, но они не были значительными и, учитывая отсутствие существенных различий между группами, были удалены. Кроме того, анализ основных компонентов использовался для оценки того, различались ли данные по экспрессии трансформированного гена log10 в зависимости от группы, времени эвтаназии или концентрации 25-гидроксивитамина D в сыворотке. Попарная корреляция Спирмена и диаграммы рассеяния использовались для изучения корреляции между данными кратности экспрессии трансформированного гена log10 и анализируемыми веществами в сыворотке.

3. Результаты

3.1. Влияние овариэктомии, времени после овариэктомии и лечения глюкокортикоидами на концентрацию кальция, фосфора и 25-гидроксивитамина D в сыворотке

Полные результаты концентрации кальция, фосфора и 25-гидроксивитамина D в сыворотке в каждой группе представлены на рисунке 1. группа с овариэктомией и диетой с низким содержанием кальция и группа без овариэктомии с адекватной диетой кальция, а также время после овариэктомии 2 месяца и 5 месяцев Эти результаты показывают, что овариэктомия в сочетании с диетой с низким содержанием кальция не влияла на концентрацию кальция в сыворотке крови. и получавшие глюкокортикоиды в течение нескольких месяцев с последующей эвтаназией через 5 месяцев, имели значительно более низкие концентрации кальция в сыворотке (p =0.0462, adj R20.13) по сравнению с 5 мес овариэктомией на диете с низким содержанием кальция и диета с низким содержанием кальция и овцы, получавшие глюкокортикоиды.Однако изучение данных позволяет предположить, что это может быть связано с гипокальциемией у одного животного (1,52 ммоль/л, референсный диапазон 2,{17}},7 ммоль/л); из это животное не имело никакого значения.пустынный гиацинтВсе остальные овцы имели концентрацию кальция в сыворотке крови в пределах референтного диапазона. Не наблюдалось различий в концентрациях фосфора в сыворотке крови или 25-гидроксивитамина D у 5-месячных овец, подвергшихся овариэктомии и получавших глюкокортикоиды.

3.2. Влияние овариэктомии и времени, прошедшего после овариэктомии, на экспрессию витамина D и генов, связанных с фосфатонином, в почках

Экспрессия генов витамина D и генов, связанных с фосфатированием, не была связана с овариэктомией или временем после овариэктомии (рис. 2). Исключением был рецептор витамина D (VDR), при этом группа OVX имела значительно большую экспрессию VDR (p=0.05, прил. R2 0.16); однако это значение исчезло после поправки на повторные измерения.

3.3. Влияние овариэктомии и лечения глюкокортикоидами на экспрессию генов, связанных с витамином D и фосфатонином, в почках через 5 месяцев после операции

Полные результаты представлены на рисунке 3. Экспрессия PTH1R была значительно выше у овец OVX, получавших глюкокортикоиды в течение 5 месяцев, по сравнению с другими группами (p=0,04, adj R40,18), в то время как TRPV5 (p{ Экспрессия {8}}.01, adj R20.31) и CYP24A1 (p=0.005, adj R40.40) была значительно выше у овец OVX, получавших глюкокортикоиды в течение 2 месяцев, по сравнению с другими группами.

Экспрессия klotho значительно различалась между всеми группами (p =0.01, adj R20.48), с самой низкой экспрессией у контрольных овец. Овцы OVX, получавшие глюкокортикоиды в течение 2 месяцев, имели самую высокую экспрессию (p =0,002), за ними следовали овцы OVX (p=0,008), а затем овцы OVX, получавшие глюкокортикоиды в течение 5 месяцев (p{ {10}}.03). Однако при поправке на повторные измерения экспрессия генов существенно не отличалась между этими группами, при этом klotho показал наибольшую разницу у овец OVX, получавших глюкокортикоиды в течение 5 месяцев (p=0.1).

Точно так же экспрессия VDR значительно различалась между всеми группами (p =0,03, adj R20,38). Наибольшая экспрессия VDR была у овец OVX, получавших глюкокортикоиды в течение нескольких месяцев (p=0,009), затем у овец OVX (p=0,01), затем у овец OVX, получавших глюкокортикоиды в течение 5 месяцев. (p=0.05), а самая низкая экспрессия присутствовала у контрольных овец.

3.4. PCA общей экспрессии генов между группами

Анализ PCA OVX, контроля и эвтаназии через 2 и 5 месяцев не позволил выделить разные группы (рис. S1). PCL и PC2 объяснили 69,6% вариаций. Точно так же PCA-анализ групп, подвергшихся эвтаназии в возрасте 5 месяцев, также не смог выделить разные группы. PCL и PC2 объяснили 53,2 процента вариации (Рисунок S2). Анализ PCA показал, что общая экспрессия генов не может быть объяснена концентрациями кальция и фосфора в сыворотке 25-гидроксивитамина D (Рисунок S3).

3.5. Попарная корреляция между всеми аналитами и экспрессией генов

Независимо от статуса овариэктомии, содержания кальция в рационе, времени после овариэктомии (2 мес или 5 мес) или статуса лечения глюкокортикоидами экспрессия гена NPT1 значимо и положительно коррелировала (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. Дискуссия

Результаты этого исследования позволяют предположить, что лечение глюкокортикоидами овариэктомированных овец оказало наибольшее влияние на экспрессию генов, в то время как сама овариэктомия и время после овариэктомии (2 и 5 месяцев) оказали незначительное влияние на экспрессию генов. В однофакторном анализе значительные различия в экспрессии генов TRPV5, CYP24A1 и klotho наблюдались у овец после овариэктомии, получавших глюкокортикоиды в течение 2 месяцев с последующей эвтаназией через 5 месяцев, и в PTH1R у овец после овариэктомии, получавших глюкокортикоиды в течение 5 месяцев. Различия были наиболее заметны в экспрессии klotho после поправки на повторные измерения.

Количественная периферическая компьютерная томография проксимального отдела большеберцовой кости этих овец показала, что овариэктомия снижала общую объемную минеральную плотность кости (vBMD) на 8 процентов, овариэктомия с лечением глюкокортикоидами в течение 5 месяцев на 27 процентов, овариэктомия с применением глюкокортикоидов в течение 2 месяцев и эвтаназия через 5 месяцев. на 13% [6]. Интересно, что трабекулярная МПК, трабекулярная площадь и содержание минералов в трабекулярной кости были аналогичны или превышали контрольные показатели у овец после овариэктомии, получавших глюкокортикоиды в течение 2 месяцев и подвергнутых эвтаназии через 5 месяцев, что свидетельствует о восстановлении костной массы [6]. Глюкокортикоиды имеют несколько хорошо задокументированных эффектов на кости, которые приводят к развитию глюкокортикоид-индуцированного остеопороза. Эти эффекты включают ингибирование образования клеток-предшественников остеобластов и остеобластов, усиление апоптоза остеобластов и снижение продукции остеоидов, что снижает образование кости [25,26]. В то же время глюкокортикоиды усиливают резорбцию кости за счет снижения экспрессии OPG, повышения экспрессии RANKL, увеличения образования остеокластов, снижения апоптоза остеокластов и увеличения секреции катепсинов и матриксных металлопротеиназ остеокластами [25,26].

Klotho является неотъемлемым компонентом фосфатирующей системы, благодаря чему он связывается с фактором роста фибробластов 23 (FGF23) в почках. Затем комплекс klotho-FGF23 связывается с рецептором FGFR1IIC, который инициирует несколько клеточных путей и, в конечном счете, приводит к усилению экспрессии почечной 24-гидроксилазы (CYP24A1) и подавлению почечной β-гидроксилазы (CYP27B1) и почечных канальцев. Котранспортеры Na/P II (NPT2a и 2c) [10]. Повышенная экспрессия (различия в которой были наиболее заметны после поправки на повторные измерения) klotho у овец, получавших глюкокортикоиды в течение 2 месяцев, а затем подвергнутых эвтаназии через 5 месяцев, может объяснить повышенную экспрессию CYP241, также наблюдаемую в этой группе овец, несмотря на отсутствие существенных различий в концентрации 25OHD в сыворотке.

Klotho известен как антивозрастной белок, а у мышей с дефицитом klotho наблюдается низкое костеобразование и резорбция кости, что приводит к остеопении с низким метаболизмом костной ткани [27,28]. Кроме того, специфические полиморфизмы гена klotho связаны со снижением минеральной плотности костей у людей [29,30]. Растворимый klotho активирует белок 1 ответа на ранний рост (EGR-1) и индуцирует экспрессию маркеров дифференцировки кости в культуре клеток остеобластов [31]. Кроме того, глюкокортикоиды могут подавлять фактор роста фибробластов 232. Возможно, более выраженная экспрессия klotho у овец, получавших глюкокортикоиды в течение 2 месяцев, а затем умерщвленных через 5 месяцев, отражает процесс восстановления у этой овцы после лечения глюкокортикоидами и, учитывая его роль в формировании и резорбции кости, возможно, является ключевым фактором восстановления кости. и, следовательно, потенциально является мишенью для лечения остеопороза у людей.

Однако у овец OVX также наблюдалась повышенная экспрессия klotho по сравнению с контрольными овцами. Точно так же одно исследование на мышах с дефицитом ароматазы показало, что дефицит эстрогена увеличивает уровень белка klotho, а лечение эстрадиолом снижает экспрессию klotho у этих мышей [17]. У мышей эстроген подавляет NPT2a в процессе, который не зависит от klotho/FGF23 и ПТГ [18]. Однако в настоящем исследовании этот эффект не наблюдался у овец, подвергшихся овариэктомии. С другой стороны, имеется мало литературы о влиянии дефицита эстрогенов на клото. Дальнейшие исследования должны изучить влияние как овариэктомии, так и глюкокортикоидов на экспрессию klotho, учитывая ее роль в старении и хроническом заболевании почек.

TRPV5 представляет собой эпителиальный кальциевый канал, в основном экспрессирующийся в дистальных извитых канальцах и соединительных канальцах почек [20,33]. Канал TRPV5 конститутивно открыт, но подвергается кальций-зависимой инактивации в сочетании с кальмодулином, кальций-чувствительным белком [34]. Экспрессия TRPV5 может быть усилена ПТГ и 1,25(OH)D3 [35]. У одной овцы, получавшей глюкокортикоиды в течение 2 месяцев, а затем подвергнутой эвтаназии через 5 месяцев, была гипокальциемия, и концентрация кальция в сыворотке крови у овец в этой группе была значительно ниже, чем в других группах. Поэтому вполне вероятно, что повышенная экспрессия TRPV5 является результатом снижения концентрации кальция в сыворотке у этих животных. Было показано, что глюкокортикоиды снижают абсорбцию кальция в кишечнике за счет снижения экспрессии TRPV6 и CalD9k [36,37] и увеличения экскреции кальция с мочой [14], но клинически значимая гипокальциемия у здоровых людей встречается редко. Точно так же у овец с низкой концентрацией кальция в сыворотке не было клинических признаков гипокальциемической тетании. В качестве альтернативы, повышенная экспрессия TRPV5 у овец, получавших глюкокортикоиды в течение 2 месяцев, а затем усыпленных через 5 месяцев, может отражать процесс восстановления, при котором для замены восстановленных трабекулярных МПК, площади и содержания минералов в костях требуется повышенная резорбция кальция из почек.

У овец, получавших глюкокортикоиды в течение 5 месяцев, экспрессия PTH1R была увеличена по сравнению с другими группами. Кроме того, по сравнению с другими группами, между овцами в группе было мало различий в экспрессии. Хотя различий в концентрации кальция в сыворотке у овец, получавших глюкокортикоиды в течение 5 месяцев, не наблюдалось, возможно, это могло быть связано с усилением действия ПТГ и его рецептора. Влияние глюкокортикоидов на секрецию и действие ПТГ неясно. Некоторые исследования на людях показали, что у пациентов, получавших лечение глюкокортикоидами, были повышенные концентрации ПТГ в сыворотке крови наряду со снижением абсорбции кальция, увеличением экскреции кальция с мочой и снижением костной массы [38,39]. Однако в большинстве исследований не было обнаружено изменений концентрации ПТГ в сыворотке крови у людей при лечении глюкокортикоидами [38,40,41]. Одно исследование показало, что, возможно, влияние глюкокортикоидов заключается в изменении секреции ПТГ с повышенной пульсирующей секрецией ПТГ у лиц, получавших глюкокортикоиды [4]. Другие также показали повышенную экспрессию PTH1R в мезенхимальных стволовых клетках и остеобластоподобных клетках в ответ на лечение дексаметазоном [43,44]. Таким образом, увеличение почечной экспрессии PTH1R у овец, получавших глюкокортикоиды в течение 5 месяцев, вероятно, связано с 5-месячным лечением глюкокортикоидами.

В то время как овариэктомия в сочетании с диетой с умеренно низким содержанием кальция привела к минимальным изменениям в экспрессии генов, она, по-видимому, изменила экспрессию VDR, при этом овцы после овариэктомии на диете с умеренно низким содержанием кальция имели более высокую экспрессию VDR по сравнению с контрольными овцами. Это контрастирует с исследованием на овариэктомированных крысах, где у тех, кто получал диету с нормальным уровнем кальция, наблюдалось увеличение почечной экспрессии VDR, в то время как у тех, кто получал диету с низким содержанием кальция, экспрессия VDR снижалась [45]. В настоящем исследовании на овцах трудно отделить влияние овариэктомии на почечную экспрессию VDR от влияния диеты с низким содержанием кальция. Однако не было никаких существенных различий в концентрации кальция в сыворотке между группами (за исключением группы глюкокортикоидов), что позволяет предположить, что диета с умеренным низким содержанием кальция оказала минимальное влияние и, возможно, влияние на VDR связано с овариэктомией. Однако для изучения этих взаимосвязей потребуются дальнейшие исследования.

В двух предыдущих исследованиях изучались отдельные взаимосвязи между генами, реагирующими на витамин D, и генами, связанными с фосфатированием, в почках овец [20,21]. Однако взаимосвязь между витамином D и фосфатирующими путями не изучалась. Интересно, что наиболее значимые корреляции между генами, о которых сообщалось в этих двух статьях, справедливы и для взаимоотношений генов в настоящем исследовании овец, что свидетельствует о согласованности результатов между исследованиями и взаимоотношений между этими генами.экстракт цистанхе сальсаИз интересных взаимосвязей, о которых ранее не сообщалось, как можно было ожидать, учитывая его ключевую роль в метаболизме кальция, экспрессия PTH1R сильно коррелировала с CalD28k, CalD9k, TRPV5, CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho и NPT2c. Экспрессия klotho сильно коррелирует с экспрессией гена TRPV5, что согласуется с другими литературными данными, показывающими, что klotho активирует TRPV5 и способствует реабсорбции кальция в почках [46,47].

К сожалению, различные группы нельзя было разделить на основе экспрессии генов, чувствительных к витамину D и фосфатирующих генов, с помощью анализа PCA. Вероятно, это связано с основным ограничением данного исследования — небольшим размером выборки. Поскольку в каждой группе было всего 3-6 животных, это, вероятно, ограничило возможность обнаружения различий в экспрессии генов между группами.

5. Выводы

Результаты этого исследования показывают, что наиболее заметные различия в экспрессии генов были в экспрессии почечного klotho у овец после овариэктомии, получавших глюкокортикоиды в течение 2 месяцев с последующим периодом восстановления в течение 5 месяцев. Учитывая, что klotho является «антивозрастным» гормоном и играет критическую роль в метаболизме кальция и фосфатов, возможно, что этот гормон играет решающую роль в восстановлении минеральной плотности и площади трабекулярной кости у обработанных овец и, следовательно, потенциально может быть цель лечения остеопороза у людей. Однако необходимы дополнительные исследования влияния глюкокортикоидов и овариэктомии на клото.

Эта статья взята из Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals