Ингибитор фарнезилтрансферазы LNK-754 ослабляет аксональную дистрофию и уменьшает амилоидную патологию у мышей. Часть 1

Абстрактный

Фон:

Отложение амилоидных бляшек и дегенерация аксонов являются ранними событиями патогенеза БА. А разрушает микротрубочки в пресинаптических дистрофических нейритах, что приводит к накоплению нарушенных эндолизосомальных и аутофагических органелл, транспортирующих фермент, расщепляющий белок-предшественник амилоида (BACE1). Следовательно, дистрофические нейриты генерируют А 42 и вносят значительный вклад в отложение бляшек.

Аксональная дегенерация — это неврологическое заболевание, которое вызывает повреждение аксонов нейронов, тем самым влияя на нервную проводимость. Иммунитет является важной линией защиты человеческого организма, позволяющей противостоять вторжению чужеродных микробов и вирусов. Итак, существует ли связь между аксональной дегенерацией и иммунитетом?

Во-первых, аксональная дегенерация не является заболеванием, вызванным иммунной системой, поэтому нет необходимости беспокоиться о негативном влиянии иммунитета на нее. Хотя конкретная причина дегенерации аксонов неизвестна, некоторые исследования предполагают, что дегенерация аксонов может быть связана с воспалительными реакциями иммунной системы. Воспалительная реакция является защитным механизмом иммунной системы против вторжения чужеродных патогенов. Однако, если его сверхактивировать, это вызовет воспалительное повреждение нейронов и будет способствовать дегенерации аксонов.

Во-вторых, сильная иммунная система может повысить сопротивляемость организма и снизить риск инфекций и заболеваний, что особенно важно для пациентов с аксональной дегенерацией. Поскольку нервная система пациентов с аксональной дегенерацией повреждена, способность организма к самовосстановлению относительно слаба. Если они страдают от других заболеваний, состояние ухудшится и еще больше повлияет на качество их жизни. Таким образом, поддержание здорового питания и образа жизни, а также повышение иммунитета могут помочь снизить риск возникновения других заболеваний. В то же время он может улучшить иммунный ответ организма и способствовать восстановлению аксонов и нервной проводимости.

Таким образом, хотя не существует необходимой связи между аксональной дегенерацией и иммунитетом, здоровая иммунная система может обеспечить необходимую защиту и поддержку пациентам с аксональной дегенерацией. Поэтому мы должны обратить внимание на важность поддержания иммунной системы, начиная с таких аспектов, как диета и образ жизни, а также активно улучшая уровень иммунитета организма, чтобы заложить прочную основу для здоровья и долголетия. Видно, что нам необходимо улучшить память, а цистанхе пустынный может значительно улучшить память, потому что цистанхе пустынный — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффективность мясного фарша обусловлена ​​различными содержащимися в нем активными ингредиентами, включая кислоты, полисахариды, флавоноиды и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными способами.

Нажмите «Знайте 10 способов улучшить память»

Ингибиторы фарнезилтрансферазы (FTI) недавно были исследованы на предмет использования в лечении нейродегенеративных заболеваний и блокирования действия фарнезилтрансферазы (FTase), катализирующей фарнезилирование, посттрансляционную модификацию, которая регулирует белки, участвующие в функции лизосом и стабильности микротрубочек. В посмертном мозге с болезнью Альцгеймера активность FTase и ее нижестоящей передачи сигналов активируется. Однако влияние FTI на амилоидную патологию и дистрофические нейриты неизвестно.

Методы:

Мы протестировали действие FTIR LNK-754 и лонафарниба на мышиной модели амилоидной патологии 5XFAD.

Полученные результаты:

У мышей 2-месячного возраста 5XFAD, получавших хроническое лечение в течение 3 месяцев, LNK-754 снижал нагрузку на амилоидные бляшки и гиперфосфорилирование тау, а также ослаблял накопление BACE1 и LAMP1 в дистрофических нейритах. У 5-мышей 5XFAD месячного возраста, получавших острое лечение в течение 3 недель, LNK-754 уменьшал размер дистрофических нейритов и накопление LysoTracker-Green при отсутствии воздействия на отложения А. Острая терапия LNK-754 улучшила память и нарушения обучаемости у амилоидных мышей hAPP/PS1.

В отличие от LNK-754, лечение лонафарнибом было менее эффективным в отношении уменьшения бляшек, гиперфосфорилирования тау и дистрофических нейритов, что могло быть результатом снижения активности против Фтазы по сравнению с LNK-754. Мы исследовали влияние FTI на аксональный транспорт эндолизосомальных органелл и обнаружили, что лонафарниб и LNK-754 усиливают ретроградный аксональный транспорт в первичных нейронах, указывая на то, что FTI могут поддерживать созревание аксональных поздних эндосом в лизосомы. Кроме того, обработка FTI повышала уровни LAMP1 в первичных нейронах мышей и мозге мышей 5XFAD, демонстрируя, что FTI стимулируют биогенез эндолизосомальных органелл.

Выводы:

Мы показываем новые данные, позволяющие предположить, что LNK-754 способствует транспортировке аксонов и функции эндолизосомальных компартментов, что, как мы предполагаем, уменьшает аксональную дистрофию, уменьшает накопление BACE1 и ингибирует отложение амилоида у мышей 5XFAD. Наши результаты согласуются с предыдущей работой, идентифицирующей Фтазу как терапевтическую мишень для лечения протеинопатий, и могут иметь важное терапевтическое значение при лечении БА.

Ключевые слова:

Болезнь Альцгеймера, Дистрофические невриты, Ингибиторы фарнезилтрансферазы.

Фон

Болезнь Альцгеймера (БА) — прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, которое является наиболее распространенной причиной деменции у стареющего населения и характеризуется значительными нарушениями обучения и памяти. На молекулярном уровне отличительными особенностями мозга при болезни Альцгеймера являются накопление амилоидных (А) бляшек и наличие гиперфосфорилированных тау-включений.

На ранних, бессимптомных стадиях БА А накапливается в мозге более двух десятилетий и дольше, прежде чем наступит ухудшение памяти [1–3]. Следовательно, снижение уровня А в мозге было центральным направлением стратегии лечения БА [4]. В настоящее время единственной терапией, модифицирующей заболевание, условно одобренной FDA, является антитело против А, которое удаляет агрегированные формы А из мозга [5], подтверждая, что нацеливание на А в мозге является многообещающим подходом к лечению AD.

Однако большинство клинических исследований, посвященных А, потерпели неудачу из-за проблем с безопасностью или эффективностью, и теперь акцент делается на мишенях, основанных на различных гипотезах БА, включая распространение тау, воспаление, дисгомеостаз кальция и нейроваскулярные факторы [4, 6, 7]. ]. Кроме того, растет интерес к терапевтическому потенциалу активации лизосомальных путей деградации как метода снижения патогенных белков, что является особенностью, характерной для нейродегенеративных заболеваний [8–12].

Обширная дисфункция эндолизосомальных и аутофагических путей хорошо документирована как раннее событие патогенеза БА. Многие генетические локусы предрасположенности к БА связаны с субклеточным эндолизосомным транспортом и функцией лизосом [13], а увеличенные дисфункциональные эндолизосомные и аутофагические органеллы накапливаются в головном мозге АД в дистрофических нейритах [14, 15].

Дистрофические нейриты, по-видимому, инициируются при повреждении нейронов, и при БА это, как предполагается, является дестабилизацией микротрубочек А [16]. Это приводит к фокальным отекам аксонов, которые нарушают нормальный транспорт и пути деградации ключевых белков, участвующих в выработке А, включая BACE1 [16, 17]. В результате дистрофии генерируют А42 и в значительной степени способствуют отложению внеклеточных бляшек и аксональной дистрофии [18], запуская путь прямой связи, приводящий к потере синапсов, нейродегенерации и когнитивным дефицитам [16].

Терапевтические стратегии, улучшающие транспорт и активность эндолизосомных и аутофагических органелл, могут предотвратить нейритную дистрофию, поддержать деградацию патогенных белков и стать критическим механизмом снижения уровней BACE1 и A при AD.

Поскольку поиск эффективного лечения БА продолжается, количество перепрофилированных препаратов, участвующих в клинических испытаниях БА, существенно выросло, поскольку клинически оцененные препараты имеют известные проблемы с безопасностью и эффективностью, что ускоряет процесс разработки лекарств [7, 19]. Исследования последних лет выявили, что ИФТ относятся к классу препаратов, которые могут быть повторно использованы для лечения нейродегенеративных заболеваний.

FTI ингибируют фарнезилирование, посттрансляционную модификацию, которая регулирует белки, в которых фарнезилпирофосфат ковалентно модифицируется до остатков цистеина в белках, содержащих мотив CAAX [20]. Первоначально FTI были разработаны для блокирования онкогенной активности Ras путем ингибирования его пренилирования, но были прекращены в клинических исследованиях по лечению рака после открытия альтернативных путей пренилирования Ras [21, 22].

Однако существует множество субстратов ФТазы [23–25], что позволяет оценивать FTI при широком спектре заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, гепатит D и прогерию [20, 26]. Кроме того, FTI показали многообещающую эффективность в борьбе с нейродегенеративными заболеваниями, характеризующимися накоплением белковых агрегатов. В моделях протеинопатий на грызунах и клеточных культурах FTI индуцируют лизосомальную активность и протеолиз специфичных для заболевания токсичных белков [8, 9, 27, 28].\

Ранее мы показали, что LNK-754, FTI, протестированный в исследованиях рака, усиливает транспорт лизосомальной гидролазы и снижает агрегацию альфа-синуклеина (-синуклеина) в нейронах, полученных от пациентов с болезнью Паркинсона (БП), и на мышиных моделях БП [8]. ].

Другие исследования сообщили об аналогичных результатах применения FTI в отношении уменьшения агрегатов белка; обработка моделей БП в клеточных культурах FTI-277 восстановленным -синуклеином [28] и лонафарнибом, одобренным FDA FTI для лечения прогерии [29], повышением лизосомальной активности и уменьшением тау-включений в мышиной модели таупатии [29] 9]. Более того, недавнее исследование показало, что генетический нокаут нейрональной FTase в мышиной модели AD APP/PS1 предотвращает генерацию A [30]. В центре внимания прошлых исследований по оценке FTI при протеинопатиях была роль субстратов FTase в лизосомальной активности и аутофагии.

Однако известно также, что FTI способствуют стабильности микротрубочек (МТ) и действуют синергично со стабилизирующими МТ препаратами, усиливая ацетилирование тубулина через Ras-независимый путь [31–33]. Стабилизация МТ ингибирует патологию AD у мышей APP/PS1 [34], и в настоящее время несколько агентов, стабилизирующих МТ, исследуются клинически для лечения AD [35]. Таким образом, есть существенные данные, свидетельствующие о том, что FTI могут принести пользу при заболеваниях, характеризующихся дисфункциональными механизмами белкового гомеостаза, таких как AD. Тем не менее, мишени и пути, которые связывают фарнезилирование белков с уменьшением белковых агрегатов при нейродегенеративных заболеваниях, до конца не изучены.

В этом исследовании мы оценили, может ли фармакологическое лечение FTI улучшить A-ассоциированную патологию AD. Мы оценили влияние LNK-754 и лонафарниба, двух FTI, которые, как известно, уменьшают агрегаты белка при нейродегенеративных заболеваниях, на скопление бляшек и дистрофические нейриты в мышиной модели амилоидной патологии 5XFAD. Наши результаты дают представление о путях, на которые влияет ингибирование ФТазы, и решительно поддерживают дальнейшее исследование повторного использования FTI в качестве терапевтического средства для лечения AD и других нейродегенеративных заболеваний, характеризующихся накоплением агрегации белков.

Материалы и методы

Животные и медикаментозное лечение

Вся работа с животными выполнялась с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных Северо-Западного университета (IACUC). Мышей кормили стандартным рационом для грызунов и давали воду вволю и содержали со стандартным 12-часовым циклом света/темноты. Мышей 5XFAD на фоне C57BL6 (Jackson Laboratories) поддерживали путем скрещивания трансген-положительных гемизиготных самцов мышей C57BL6 с трансген-негативными самками мышей C57BL6 (Jackson Laboratories).

В нашем протоколе лечения хронических заболеваний медикаментозное лечение начиналось в возрасте 2 месяцев, в возрасте, когда начинается отложение бляшек [36, 37]. В протоколе неотложного лечения медикаментозное лечение начиналось в возрасте 5 месяцев, после чего широко распространены отложение бляшек и дегенерация аксонов [38, 39].

LNK{{0}} был синтезирован компанией Link Medicine (Массачусетс, США), а лонафарниб был получен от Cayman Chemical Company (Энн-Харбор, Мичиган). Для лечения животных LNK-745 и лонафарниб готовили в нагретом растворе 0,5% карбоксиметилцеллюлозы (Sigma-Aldrich) в качестве носителя в концентрации 0,10 мг/мл до растворения и раствор прозрачный.

Аликвоты для инъекций замораживали при температуре -20 градусов, а затем размораживали и хранили при температуре 4 градуса каждую неделю лечения. Мышей лечили в соответствии с установленным протоколом, который, как известно, повышает активность лизосом [8]. В протоколе лечения хронических заболеваний мышам 5XFAD в возрасте 2-месячного возраста внутрибрюшинно (в/б) вводили либо носитель, либо LNK754, либо лонафарниб ежедневно с использованием инсулинового шприца 29-калибровочного калибра в течение 12 недель, пока мышам не исполнилось 5 лет. месяцев. В режиме острого лечения 5-месячным мышам 5XFAD вводили инъекции ежедневно в течение 3 недель.

По завершении лечения мышам вводили анестезию и перфузию, а мозг собирали для дальнейшего анализа (см. разделы ниже). Для экспериментов на клеточных культурах LNK-754 и лонафарниб растворяли в ДМСО и добавляли к культурам первичных нейронов мышей в концентрации 10 нМ на 48 часов. Обработка носителя представляла собой эквивалентное количество ДМСО. Клетки собирали и анализировали, как описано ниже.

Антитела

В экспериментах по иммунофлуоресценции использовали следующие антитела: крысиное анти-LAMP1 (#1D4B, DSHB), кроличьее анти-А 42 (#700254, Invitrogen), кроличьее анти-BACE1 (#ab108394, Abcam), кроличьее анти-III тубулин (#ab18207, Абкам). Для иммуноблоттинга использовались следующие антитела: кроличьи антиактины (#926–42,210, LI-COR), кроличьи антиp44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), кроличьи анти-44/42. (Erk1/2) (#CS137F5, Cell Signaling Technology), кроличье анти-LAMP1 (#CS3234, Cell Signaling Technology), мышиное анти-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), мышиное анти-APP (6E10) ( №803001, BioLegend), кроличье анти-p-tau (ser404) (#CS20194, Cell Signaling Technology), мышиное анти-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), преламин-A (#MABPT858, Millipore Sigma) и мышиное анти-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma). -HDJ-2 (#sc-59,554, Санта-Крус). Для иммуноблоттинга использовали вторичные антитела против кролика или мыши от Vector Laboratories.

Поведенческое тестирование

Животные и медикаментозное лечение

Поведенческий анализ проводился компанией reMYND, Inc. с использованием мышиной модели hAPP/PS1 с нейрон-специфической экспрессией клинического мутанта человеческого белка-предшественника амилоида вместе с клиническим мутантом человеческого пресенилина 1 [40]. У этой двойной трансгенной мыши наблюдается спонтанное прогрессирующее накопление А в головном мозге, что в конечном итоге приводит к образованию амилоидных бляшек в субикулюме, гиппокампе и коре головного мозга в возрасте 6 месяцев. Для этого исследования использовали 48 самок мышей hAPP/PS1 на фоне FVB x C57Bl/6J в возрасте 6 месяцев в сочетании с 12 контрольными самками самок дикого типа того же возраста на фоне FVB x C57Bl/6J. Введение 0,9 мг/кг/день LNK-754 осуществляли перорально через зонд один раз в день в течение 12 дней подряд. Убой животных осуществляли через 2 часа после последнего введения дозы.

Все мыши были генотипированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в возрасте 3 недель и получили уникальный идентификационный номер, как только стали известны результаты ПЦР. Перед началом исследования всех мышей дважды проверяли с помощью второй ПЦР. Все мыши были слепо рандомизированы и подобраны по возрасту. Компьютер давал мышам случайное число и случайным образом распределял их по группам лечения. Животные были повторно помещены в клетки экспериментальной группы за 15 дней до начала исследования, чтобы дать им возможность ознакомиться с новой обстановкой в ​​клетке. Мыши имели свободный доступ к предварительно фильтрованной и стерильной воде и стандартному корму для мышей (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Зост, Германия). Продукты питания хранились в сухих и прохладных условиях в хорошо вентилируемом складском помещении. Количество воды и еды проверялось ежедневно, доставлялось при необходимости и обычно обновлялось раз в неделю. Мышей первоначально содержали при обратном ритме день-ночь (14 часов света/10 часов темноты), начиная с 19:00, в стандартных металлических клетках типа RVS T2 (площадь 540 см2).

Клетки оборудованы твердым полом и слоями подстилки. Количество мышей в клетке было ограничено местным законодательством о защите животных. За 15 дней до начала лечения мышей повторно помещали в индивидуальные вентилируемые клетки с макролоном Т2 и транспортировали в лабораторию для акклиматизации к лабораторным условиям в рамках подготовки к лечению. В лаборатории ритм дня и ночи был изменен на 12 часов света/12 часов темноты, начиная с 19:00.

Водный лабиринт Морриса

Водный лабиринт Морриса проводили на 8–12-й день лечения, животных забивали сразу после зондового теста. В бассейне (белый круглый сосуд диаметром 1 метр) содержалась вода температурой 20 градусов с диоксидом титана в качестве нетоксичной добавки без запаха, скрывающей платформу для эвакуации (на 1 см ниже уровня воды). Плавание каждой мыши записывали на видео и анализировали (Ethovision, Noldus Information Technology, Вагенинген, Нидерланды). Перед тренировкой каждую мышь помещали на платформу на 15 секунд. Для тестов навигации по месту мышей обучали находить скрытую платформу в семи блоках по три испытания в течение четырех дней подряд.

Каждое испытание состоит из принудительного плавания продолжительностью максимум 120 секунд, за которым следует 10 минут отдыха. Измерялось время, необходимое каждой мыши для обнаружения платформы. Семь последовательных блоков образуют кривую обучения. Через 24 часа после последней тренировки каждое животное подвергалось зондовому испытанию с удаленной платформой. Мышам давали возможность искать в течение 60 секунд и измеряли время поиска в квадранте и пересечение исходного положения платформы. Во время последнего зондового теста мышам разрешили обыскивать предыдущее местоположение платформы в течение 60 секунд после того, как платформу убрали.

Первичная культура нейронов

Передний мозг препарировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) (Thermo Fisher # 14185–052) у беременных мышей C57BL6 дикого типа (Jackson) на E15.5 для получения первичных нейронов. Рассеченный передний мозг расщепляли в 2,5% трипсине при 37 градусах в течение 20 минут. Для диссоциации нейронов в HBSS использовали отполированную огнем пипетку Пастера. Затем нейроны высевали на шестилуночный планшет, покрытый поли-L-лизином, 2×106 нейронов на лунку в нейробазальной среде, дополненной 2% B-27, 500 мкМ глутамина, 10% лошадиной сыворотки и 2,5 мкМ. глутамат (все от Thermo Fisher).

Через 2 часа среду меняли на Нейробазальную с 2% B-27, 500 мкМ глутамина и 2,5 мкМ глутамата. Через 24 часа среду меняли на Нейробазаль плюс 2% B-27 и 500 мкМ глютамина. Половина замен сред производилась каждые 2–3 дня. Первичные нейроны культивировали в течение 7 дней и обрабатывали носителем (ДМСО) или 10 нМ концентрацией LNK-754 или лонафарнибом в течение 48 часов. Затем нейроны фиксировали или визуализировали в реальном времени, как описано ниже.

Для фиксации нейроны инкубировали в течение 20 минут в 4% параформальдегиде, 0.12M сахарозе в 1XPBS, пермеабилизировали в 0,5% тритоне X-100 и инкубировали в течение ночи с первичными антителами, а затем инкубировали с первичными антителами в течение ночи. вторичные антитела осла против мышиного Alexafuor (Molecular Probes, 1:1000) и совместное окрашивание 300 нМ DAPI. Покровные стекла монтировали с помощью Prolong Gold (Molecular Probes), а изображения получали на конфокальном микроскопе Nikon A1 с объективом 60X (NA 1.4) и программным обеспечением NIS Elements.

Живая визуализация нейронов

Для экспериментов с живым изображением нейроны готовили, как указано выше, и помещали в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм (MatTek # P35G-1.5-14C) на 7 дней в культуре. Затем к кондиционированной среде добавляли 10 нМ LNK-754 или лонафарниба, контрольные культуры обрабатывали ДМСО в качестве носителя. Через 48 часов обработки среду заменяли кондиционированной средой из необработанных параллельных пластинок нейронов. К кондиционированной среде добавляли 25 нМ LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) и нейроны инкубировали в течение 30 минут при 37 градусах.

Покадровую визуализацию нейронов проводили с использованием широкопольного микроскопа Ti2. Визуализация начиналась сразу через 30 минут и продолжалась не более 30 минут. Снимки 1- делались каждую минуту, и в течение 30 минут были получены изображения 20–30 отдельных областей на каждую чашку. Количественное определение расстояния и скорости частиц LysoTracker и анализ кимографа были выполнены с использованием программного обеспечения NIS Elements и подробно описаны ниже. В отдельных экспериментах к кондиционированной среде добавляли 1 мкм Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen), а полученные изображения живых нейронов снимали в течение не более 15 минут с использованием конфокального микроскопа Nikon A1 с объективом 60X. (NA 1.4) и программное обеспечение NIS Elements.

For more information:1950477648nn@gmail.com