Мелкодисперсное вещество 2.5 активирует меланогенез в клетках меланомы человека A375

Редактору: Эпидемиологические исследования показали, что воздействие мелких твердых частиц 2,5 (PM2,5) увеличивает риск гиперпигментации кожи.[1] Недавнее исследование доказало, что PM2.5 может индуцировать меланогенез, регулируя экспрессию тирозиназы (TYR) и связанных с тирозиназой белков 1 (TYRP1) и 2 (TYRP2) посредством активации передачи сигналов арилуглеводородного рецептора (AhR) / митоген-активируемой протеинкиназы. 2] AhR широко распространен в клетках кожи, и его лигирование контролирует окисление/антиокисление, функцию эпидермального барьера, фотоиндуцированный ответ, врожденный иммунитет и меланогенез. Он может быть активирован диоксином и полициклическими ароматическими углеводородами (составляющими PM2.5), и его активация индуцирует транскрипцию генов, кодирующих ферменты метаболизма ксенобиотиков как фазы I, так и фазы II (цитохромы P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 и CYP1B1). [3,4] BaP и опасные диоксины активируют AhR с сильным образованием активных форм кислорода (АФК), которое, по крайней мере, частично опосредовано CYP1A1. Кроме того, окислительный стресс, опосредованный CYP1A1-, отвечает за выработку провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-1, IL-6 и IL-8 в окружающей среде. обработанные загрязняющими веществами кератиноциты человека. [3,5] Однако очень мало исследований токсического воздействия PM2.5 на меланогенетические клетки. Здесь мы обработали клетки меланомы человека A375 различными концентрациями PM2.5, чтобы выяснить, может ли PM2.5 способствовать меланогенезу, и его связь с передачей сигналов AhR, окислительным стрессом и воспалительной реакцией.

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные кислородные радикалы (ОН-, Н₂О₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе могут усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и обладает способностью улавливать активные формы кислорода и предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение свободных радикалов тимина.

how to use cistanche

Нажмите на добавку Cistanche Tubulosa.

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

PM2,5 собирали зимой (с декабря по январь) в Пекине. Интеллектуальный пробоотборник общего количества взвешенных частиц (TSP) HY-1000 (дополнительный резак PM2.5, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Циндао, Китай) использовался для отбора проб кварцевого фильтра. Кварцевую мембрану погружали в 75-процентный этанол с последующим встряхиванием ультразвуком. Для приготовления маточного раствора высокой концентрации использовали стерильную воду. Клетки меланомы человека A375 культивировали в среде с 5% CO2 при 37°С в обычной среде Игла, модифицированной Дульбекко (Invitrogen Co., Ltd., Карлсбад, Калифорния, США), содержащей эмбриональную бычью сыворотку (Gibco, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Клетки A375 обрабатывали различными концентрациями PM2.5 (0, 100, 200 и 400 мкг/мл) в течение 24 часов, после чего клетки использовали для следующих исследований. Для статистического анализа использовали непарный t-критерий Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ, а значение P <0,05 считалось статистически значимым.

maca ginseng cistanche

Чтобы исследовать влияние PM2.5 на клетки A375, пролиферацию клеток определяли с помощью набора CCK-8 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), а клеточный апоптоз определяли с помощью флуоресцеинизотиоцианата аннексина V/ набор для апоптоза йодида пропидия (FITC/PI) (Multisciences, США) согласно инструкции производителя. Результаты показали, что PM2.5 проявлял зависящую от концентрации цитотоксичность по отношению к клеткам A375, но не влиял на апоптоз [дополнительная фигура 1, http://links.lww.com/CM9/A917].

Метод NaOH использовался для определения содержания меланина. Клетки A375, обработанные PM2.5-, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и лизировали водой. Лизаты центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 5 минут, промывали 10 процентным раствором трихлоруксусной кислоты (500 мл) (Sigma, St. Louis , Миссури, США) и 75-процентным этанолом (500 мл), а затем снова осветляли. После этого к гранулам добавляли 50 мл 1 моль/л NaOH, содержащего 10 процентов диметилсульфоксида, на 1 час при 80°С. Поглощение при 490 нм (ОП 490) измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Поскольку TYR является наиболее важным меланогенным ферментом, мы затем определили активность TYR с помощью анализа леводопы (L-DOPA). В шестилуночные планшеты (Corning, США) засевали клетки А375 с плотностью 3·105 клеток/лунку. Затем клетки промывали PBS и лизировали 0,5% дезоксихолатом натрия (Sigma). Лизат разделяли на три группы и к каждой пробе добавляли 0,1% L-DOPA (Sigma). Через 5 минут измеряли OD 490 и использовали 0,1% L-DOPA в качестве стандарта. Мы также измерили уровни экспрессии мРНК и белка TYR. Тотальную РНК экстрагировали с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Япония). После этого была проведена количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR) на Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Япония). Праймеры от Invitrogen представлены в дополнительной таблице 1, http://links. lww.com/CM9/A917, и уровень экспрессии каждой мРНК рассчитывали с использованием метода 2*DDCT. Уровни экспрессии белка анализировали вестерн-блоттингом. Клетки промывали PBS и лизировали в RIPA-буфере (Beyotime, Китай), содержащем фенилметилсульфонилфторид (смесь ингибиторов протеаз, 20:1, Sigma-Aldrich). Концентрацию белка измеряли с помощью набора для анализа белка BCA (Beyotime, Китай). Суммарный белок кипятили при 70° в течение 10 мин, разделяли в 4-12% геле при 200 В в течение 40 мин, переносили на мембрану при 4° при 120 мА в течение 75–100 мин, а затем инкубировали с 5% нежирного молока за 1 ч. Затем мембраны зондировали антителами против TYR, анти-AhR, анти-CYP1A1 и анти-CYP1B1 (Abcam) в течение ночи при 4°С. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированное с пероксидазой хрена антитело против IgG мыши (Proteintech, США). Результаты показали, что PM2.5 увеличивает содержание меланина и активность TYR дозозависимым образом. Уровни экспрессии мРНК и белка TYR повышались [дополнительная фигура 2 A-D, http://links.lww.com/CM9/A917].

maca ginseng cistanche sea horse

PM2.5 может повышать активность TYR, активируя путь AhR. Чтобы определить, влияет ли PM2.5 на передачу сигналов AhR, мы определили уровни транскрипции AhR и его классических нижестоящих генов CYP1A1 и CYP1B1 с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга. Результаты показали, что PM2.5 повышал уровни экспрессии мРНК AhR и CYP1A1, а также экспрессию белка CYP1A1 [дополнительная фигура 2 E-G, http://links.lww.com/CM9/A917].

Активация AhR вызывает образование АФК, что также может повышать активность TYR.[5] Следовательно, мы оценили продукцию АФК с использованием 20,70 -дихлорфлуоресцеиндиацетата (DCFHDA) и проточной цитометрии. После 24 часов обработки PM2.5 клетки A375 инкубировали с DCFH-DA (5 ммоль/л) в течение 30 минут при 37°С в темноте. Клетки дважды промывали в PBS и измеряли флуоресценцию с помощью проточного цитометра. Среднюю интенсивность флуоресценции определяли количественно с использованием программного обеспечения FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США). Поскольку CYP1A1-индуцированная продукция АФК считается ответственной за воспалительный ответ,[5] уровни экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} и фактор некроза опухоли [TNF]-a). Было обнаружено, что PM2.5 увеличивает выработку АФК, а также уровни мРНК IL-1a, IL-6 и IL-8 в клетках A375 [дополнительная фигура 2 H и I, http ://ссылки. lww.com/CM9/A917].

how to take cistanche

Результаты этого исследования показали, что PM2.5 способствует меланогенезу и увеличивает как активность, так и экспрессию TYR в клетках A375. Более того, PM2.5 может активировать передачу сигналов AhR и вызывать окислительный стресс и воспалительную реакцию, что может быть меланогенным сигнальным каскадом, ответственным за гиперпигментацию.

Благодарности

Мы выражаем искреннюю благодарность следующим лицам: профессору доктору Масутаке Фуруэ и профессору доктору Цудзи Гаку из Университетской больницы Кюсю, которые улучшили рукопись и помогли с информацией, связанной с AhR. Мы также благодарим профессора доктора Роберта Шварца за редактирование на английском языке из Медицинской школы Рутгерса в Нью-Джерси.

Финансирование

Это исследование было поддержано грантом Национального фонда естественных наук Китая (№ 2101000271).

Конфликт интересов

Никто.