Клонирование генов, функциональная идентификация, структурный и экспрессионный анализ сахарозосинтазы Cistanche Tubulosa

Абстрактный:Сахарозосинтаза играет решающую роль в метаболизме сахара в растениях, катализируя выработку уридиндифосфата (УДФ)-глюкозы, которая служит биоактивным донором гликозила для различных метаболических процессов. В этом исследовании ген сахарозосинтазы под названием CtSus был клонирован изЦистанхе трубчатая, традиционная китайская медицина, известная своим богатымсодержание различных гликозидов, на основе результатов транскриптомного анализа. Открытая рамка считывания CtSus имела длину 2 418 п.о. и кодировала 805 аминокислот. Анализ последовательностей выявил консервативные домены, связанные с семейством сахарозосинтаз растений, как в N-концевых, так и в С-концевых областях белка CtSus. Филогенетический анализ показал, что CtSus имеет тесную эволюционную связь ссахарозосинтазыот других растений того же порядка. Функциональную идентификацию CtSus проводили посредством катализного связывания цельных клеток с UGT71BD1, охарактеризованным ферментом гликозилтрансферазой. Результаты показали, что введение CtSus значительно повышало скорость конверсии гликозилирования, катализируемого UGT71BD1. Растворимая экспрессия CtSus в Escherichia coli была дополнительно достигнута с использованием вектора экспрессии pCold™ TF. Ферментативный анализ in vitro показал активность CtSus по катализу образования УДФ-глюкозы в присутствии сахарозы и УДФ. Результаты количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени показали, что характер экспрессии гена CtSus в различных частях C. Tubeulosa и суспензионных культурах клеток C. Tubeulosa в условиях стресса засухи коррелирует с характером накопления, наблюдаемым для фенилэтанолгликозидов, соответственно. Кроме того, ключевые аминокислоты и их взаимодействие между ферментом и субстратом были исследованы на основе предсказания структуры белка и результатов молекулярного стыковки. В целом, наши результаты идентифицируют сахарозосинтазу CtSus, ответственную за поставку активного донора гликозилаUDP-глюкозы во время биосинтеза гликозидных продуктов в C. Tubeulosa, а также предоставили генный элемент, который может быть использован в конструировании штаммов для производства гликозидных продуктов.

Ключевые слова: Цистанхе трубчатая; сахарозосинтаза; гликозиды; УДФ-глюкоза; ферментативный катализ

ДИЧЕН ЦИСТАНЧЕ РАЗВИВАЕТ БАЗЫ В ЮТЯНЕ, ХОТАНЕ И СИНЬЦЗЯНЕ

Служба поддержки Wecistanche — крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Цистанхе трубчатая (Шенк) Р. Уайт— многолетнее травянистое паразитическое растение рода Cistanche семейства Оробанховые. Это традиционный редкий и драгоценный китайский лекарственный материал, произрастающий в Синьцзяне и Внутренней Монголии. Он сладкий, соленый и теплый по своей природе и выполняет функциитонизирующий Ян почек, принося пользу сущности и кровии увлажнение кишечника иоблегчение запора. Он известен как «пустынный женьшень» [1]. Современные исследования установили, чтоЦистанхе трубчатаясодержитразличные химические компонентытакой какфенилэтаноидные гликозиды, иридоидные эфиры терпенови их гликозиды, лигнаны и их гликозиды, сложные эфиры олигосахаридов, полисахариды, полиолы, олигосахариды, стерины и их гликозиды, монотерпеноидные гликозиды, сахара, аминокислоты и летучие масла [2,3], особенно гликозидные соединения являются наиболее важными активными ингредиентами. Среди них соединения фенилэтаноидных гликозидов имеют наибольшее содержание в исходном лекарственном сырье и обладают широким спектром фармакологической активности, такой как нейропротекция и омоложение [4]. Биосинтез вышеупомянутых гликозидных соединений включает несколько стадий реакций гликозилирования, которые катализируютсягликозилтрансферазы в растенияхипредоставление активных доноров гликозиловимеет важное значение в этом процессе. Обычными активными донорами сахара в организмах являются уридиндифосфат (UDP), тимидиндифосфат (TDP) и гуанозиндифосфат (GDP). Среди них УДФ-глюкоза является наиболее распространенным активным донором гликозила в растениях. Он может не только напрямую распознаваться глюкозилтрансферазой и катализировать реакцию переноса глюкозила, но также может использоваться в качестве предшественника для участия в синтезе других типов доноров гликозила. Например, УДФ-глюкоза может использоваться в качестве субстрата для образования УДФ-рамнозы под действием 4,6-дегидратазы, 3,5-изомеразы и 4-редуктазы[5]; УДФ-глюкоза может использоваться в качестве субстрата для катализа синтеза УДФ-ксилозы посредством УДФ-глюкозодегидрогеназы и УДФ-ксилозосинтазы; УДФ-ксилоза может дополнительно катализироваться УДФ-ксилозоэпимеразой с образованием УДФ-арабинозы[6]; УДФ-глюкоза и УДФ-галактоза являются диастереомерами и могут превращаться друг в друга посредством эпимеразы[7,8]. Следовательно, синтез УДФ-глюкозы оказывает важное влияние на снабжение растений активными донорами гликозилов и модификацию гликозилирования вторичных метаболитов.

Синтез УДФ-глюкозы в растениях может осуществляться через синтазный путь, фосфорилазный путь и киназный путь. Среди них сахарозосинтаза может напрямую катализировать реакцию между УДФ и сахарозой с образованием УДФ-глюкозы и фруктозы, а также обратную реакцию [9]. В широком смысле сахарозосинтаза принадлежит к подсемейству гликозилтрансфераз-4, которое включает множество гликозилтрансфераз, таких как фосфатаза синтеза сахарозы, трегалозосинтаза и трегалозофосфорилаза [10]. Сахарозосинтаза была впервые идентифицирована в зародышах пшеницы [11]. С тех пор исследователи идентифицировали сотни генов сахарозосинтазы из различных растений, таких как маш (Vigna radiata), рис (Oryza sativa), кукуруза (Zea mays), соя (Glycine max) и персик (Amygdalus persica). Они участвуют во многих метаболических процессах в растениях, включая транспорт и распределение сахарозы, синтез крахмала, синтез целлюлозы и состав клеточной стенки, биотический и абиотический стресс и т. д., и играют ключевую регуляторную роль в распределении источника углерода растениями [12]. Кроме того, на основе изучения физиологических функций исследователи также использовали полученную сахарозосинтазу в качестве генного элемента для ферментативного синтеза гликозидных соединений и добились идеальных результатов. Например, Масада и др. [13] совместно экспрессировали ген сахарозосинтазы AtSus-1 из Arabidopsis thaliana и ген гликозилтрансферазы CaUGT2 из Catharanthus Roseus in vitro и использовали двухферментную систему в одном горшке для катализа реакции гликозилирования куркумина, что увеличило выход гликозида куркумина в 7 раз. При этом количество использованного донора УДФ-глюкозы составляло лишь одну десятую от исходного.

Бунгаруанг и др. [14] сконструировали сопряженную каталитическую систему с использованием сахарозосинтазы GmSuSy из сои и гликозилтрансферазы OsUGT из риса. Они достигли гликозилированной модификации нотофагина, добавив лишь небольшое количество УДФ (1,0 ммоль·л-1) и сахарозы. По сравнению с одноферментным катализом OsUGT продукция продуктов гликозилирования увеличилась на три порядка: с мкмоль·л-1 до моль·л-1.

Богатство и разнообразие гликозидных соединений Cistanche Tubeulosa позволяют предположить, что он должен содержать мощную сахарозосинтазу, связанную с модификацией гликозилирования вторичных метаболитов, но этот фермент не был обнаружен у растений рода Cistanche. В данной работе в качестве материала использовали цистанхе трубчатую – лекарственное вещество, включенное в фармакопею. Посредством анализа транскриптома и сравнительного анализа транскриптома различных частей были использованы методы молекулярной биологии для обнаружения и идентификации гена сахарозосинтазы CtSus. Для изучения функции CtSus и ее корреляции с биосинтез гликозидных соединений в цистанхе трубчатом, заложив основу для изучения пути биосинтеза гликозидных соединений в цистанхе трубчатом.

Материалы и методы

Материалы Свежие растения Cistanche tubeulosa были собраны в городе Хотан, Синьцзян, Китай, а биологическая идентификация была проведена профессором Ту Пэнфэем из Пекинского университета; система суспензионной культуры клеток Cistanche Tubeulosa была создана нашей исследовательской группой на ранней стадии [15]; E.coliFast-T1 приобретали у Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.; E.coli BL21 (DE3) была приобретена у компании Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; Векторы pCold™ I и pCold™ TF были приобретены у Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.; Контрольный UDP-глюкоза был приобретен у Xi'an Qiyue Biotechnology Co., Ltd., а субстраты эскулина и ресвератрола были приобретены у Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.

ДИЧЕН ЦИСТАНЧЕ РАЗВИВАЕТ БАЗЫ В ХОТАНЕ, СИНЬЦЗЯН

Экстракция РНК и синтез кДНК РНК экстрагировали в соответствии с инструкциями набора OMEGA RNA Plant Kit (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek). Для определения чистоты, концентрации и целостности РНК использовали электрофорез в агарозном геле и спектрофотометр Nanodrop 2000. Подходящие образцы РНК подвергали обратной транскрипции с использованием набора для обратной транскрипции TransScript® OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) для синтеза первой цепи кДНК.

Добыча генов сахарозосинтазы и клонирование генов CtSus. В качестве матрицы использовали аминокислотную последовательность функционально идентифицированной сахарозосинтазы AtSus1 Arabidopsis thaliana (инвентарный номер GenBank: AED92894.1) [16]. Гены сахарозосинтазы были проверены на основе данных транскриптома C. Tubeulosa путем локального выравнивания последовательностей Blastp в сочетании с аннотацией генов транскриптома, анализом FPKM (обилие экспрессии генов) и сравнительным анализом данных транскриптома. Специфические праймеры были разработаны на основе информации о последовательностях генов-кандидатов, предоставленной данными транскриптома второго поколения C. Tubeulosa (таблица 1). кДНК C. Tubeulosa использовали в качестве матрицы, и ПЦР-амплификацию целевого гена проводили с использованием высокоточного фермента ПЦР (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.). Продукт ПЦР-амплификации очищали с использованием мини-набора FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.), а затем клонировали в соответствии с набором для быстрого клонирования (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) соединяли с вектором клонирования pCE2 TA/Blunt-Zero в соответствии с инструкциями по эксплуатации, переносили в компетентные клетки Fast-T1 и культивировали в течение ночи при 37 градусах. Плазмиду экстрагировали и передали в компанию Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd. для идентификации секвенирования.

Таблица 1 Нуклеотидная последовательность праймеров, использованных в этом исследовании. qPCR: количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

Биоинформатический анализ сахарозосинтазы CtSus Cistanche Tubeulosa

Онлайн-программа ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) использовалась для анализа физико-химических свойств белка; онлайн-программное обеспечение TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) использовали для предсказания трансмембранной структуры белка; для предсказать вторичную структуру белка; онлайн-программное обеспечение SMART (http://smart.embl.de/) использовалось для предсказания консервативного домена аминокислотной последовательности белка; программное обеспечение DANMAN использовалось для сравнения аминокислотных последовательностей CtSus с последовательностями сахарозосинтаз других видов; Филогенетическое дерево было построено методом кластерного анализа с использованием метода объединения соседей с использованием программного обеспечения MEGA11 с бутстреп-повторением 1,000 раз.

Анализ экспрессии CtSus в разных частях Cistanche Tubeulosa и в условиях засухи

Праймеры для количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени для CtSus и внутреннего эталонного гена DNAj были разработаны с использованием программного обеспечения DNAMAN [17] (таблица 1). Относительный уровень экспрессии гена CtSus в суспензионных клетках цистанха трубчатого в различных частях цистана трубчатого и в условиях засушливого стресса анализировали с помощью количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени. Количественный флуоресцентный ПЦР-анализ в реальном времени проводили с использованием набора TransStart® Top Green qPCR SuperMix Kit (Cat AQ131-01, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.). Программа амплификации использовала двухэтапный метод: 94 градуса в течение 30 с; 94 градуса – 5 с, 60 градусов – 30 с, повторяется 40 циклов; его проводили с помощью системы ПЦР-детекции в реальном времени Bio-Rad CFX Connect™ (лаборатория Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Методом 2–ΔΔCT был проведен анализ относительной экспрессии гена CtSus в различных экспериментальных группах. GraphPadPrism 9 использовался для анализа значимости и построения гистограммы.

Конструирование прокариотического вектора экспрессии и гетерологичная экспрессия гена CtSus. На основании результатов секвенирования гена были разработаны специфические праймеры, содержащие плечи гомологии вектора и сайты рестрикции (таблица 1), для ПЦР-амплификации. Целевой ген CtSus был сконструирован в векторы экспрессии pET-28a, pET-24b, pCold™ I и pCold™ TF с использованием технологии бесшовного клонирования с использованием набора для клонирования ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (CatC115-01). , Нанкинская компания Novogene Biotech Co., Ltd.). Плазмиды успешно сконструированных рекомбинантных векторов экспрессии экстрагировали и трансформировали в компетентные к экспрессии клетки Transetta (DE3) Escherichia coli. Клетки культивировали в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг·мл-1 сульфата канамицина (с pET-28a и pET-24b в качестве векторов экспрессии) или 1{{ 22}}0 мкг·мл-1 ампициллина (с pCold™ I и pCold™ TF в качестве векторов экспрессии) и 50 мкг·мл-1 хлорамфеникола, соответственно, при 37 градусах и 200 об/мин{{ 15}} при встряхивании до тех пор, пока значение А600 бактериального раствора не достигнет 0.4-0.6. Добавьте изопропил-бета-Дтиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 0,5 ммоль·л -1, чтобы индуцировать экспрессию белка. Инкубируйте в шейкере с постоянной температурой при 23 градусах (с pET-28a и pET-24b в качестве векторов экспрессии) или 15 градусах (с pCold™ I и pCold™ TF в качестве векторов экспрессии), 180 р· мин-1 в течение 16 часов (с pET28a и pET-24b в качестве векторов экспрессии) или 24 часов (с pCold™ I и pCold™ TF в качестве векторов экспрессии), затем собирают бактерии центрифугированием.

Лизисный буфер (20 ммоль·л-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0,5 моль·л-1 NaCl, 20 ммоль·л{{10} } Добавляли имидазол, 3% глицерин, 100 ммоль·л -1 фенилметилсульфонилфторида, 1 мг·мл -1 лизоцима, pH 7,4), клетки разрушали в течение 8 мин и центрифугировали. Супернатант и осадок отбирали соответственно. Супернатант адсорбировали на аффинной колонке HisTrap FF (кат. 17531901, Cytiva), заполненной наполнителем Ni Sepharose 6 Fast Flow, для адсорбции целевого белка, содержащего His-метку. После элюирования различными концентрациями имидазола каждую фракцию отбирали для обнаружения в SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, концентрировали центрифугированием, обессоливали в пробирке для ультрафильтрации (Millipore) и хранили в буфере [содержащем 50 ммоль·л-1 Трис-HCl (рН 7,5), 0,2 моль·л{{ 30}}NaCl, 1 ммоль·л -1 дитиотреитол, 3% глицерин] для последующих реакций ферментативного катализа in vitro.

Цельноклеточный катализ CtSus. Плазмида pCold™ I-CtSus и экспрессирующая плазмида pET-28a-UGT71BD1[18] гликозилтрансферазы UGT71BD1, идентифицированная исследовательской группой ранее, были одновременно трансформированы в экспрессионно-компетентную E. coli Transetta (DE3). Положительные рекомбинантные бактерии, содержащие гены CtSus и UGT71BD1, отбирали и инокулировали в среду LB (ростовую среду), содержащую 50 мкг·мл-1 сульфата канамицина, 100 мкг. ·мл-1 ампициллина и 50 мкг·мл-1 хлорамфеникола в соотношении 1:100 (об/об). Культуру культивировали при 37 градусах до тех пор, пока значение А600 бактериального раствора не составляло 0,4-0,6, а затем добавляли IPTG в конечной концентрации 1 ммоль·л-1. Культивирование продолжали при 15 градусах и 180 об/мин-1 в течение 24 часов. Культуру центрифугировали при 4 градусах и 4 000 об/мин-1. Соберите клетки. Инокулируют собранные клетки в среду М9 (ферментационная среда) в соотношении 40 мл культуральной среды на грамм бактерий и добавляют 75 мкмоль·л-1 сахарозы и 25 мкмоль·л-1 эскулетина (1). или ресвератрол (2) субстраты для реакционных групп. Продолжайте встряхивать культуру в течение 24 часов, центрифугировать при 4000 × g, 4 градуса в течение 30 минут, добавить метанол для ультразвукового разрушения осадка, добавить в надосадочную жидкость 2-кратный объём метанола, центрифугировать при 4000 × g, 4 градуса в течение 30 минут, возьмите надосадочную жидкость и объедините, выпарите растворитель при пониженном давлении, повторно растворите в метаноле, отфильтруйте через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и детектируйте продукт реакции с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent 1260. В качестве аналитической колонки использовали КОЛОНКУ CAPCELL PAK C18 (250 мм×4,6 мм, 5 мкм), в качестве подвижной фазы использовали 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты (А) и метанол (В), градиент элюирования составлял: {{61 }} мин, 30%-90% B; 25-27 мин, 90%-100% B; 27-33 мин, 100% B. Параметры масс-спектрометрии: режимы положительных и отрицательных ионов, а также автоматическое многоступенчатое полное сканирование MS1, MS2 и MS3.

Обнаружение каталитической активности фермента CtSus in vitro. Рекомбинантный белок, полученный с помощью вышеупомянутой колоночной аффинной хроматографии HisTrap FF, подвергали удалению терминальной метки с использованием фактора Ха. Система ферментативного расщепления была следующей: концентрацию рекомбинантного белка доводили до концентрации 1 мг·мл-1, и 1 мкл фактора Ха добавляли к 50 мкл рекомбинантного белка в буфере 20 ммоль·л-1 трис-HCl (pH 8,0), 100 ммоль·л-1 NaCl и 2 ммоль·л-1

CaCl2 при 23 градусах в течение 6 часов. Реакционная система составляла 100 мкл. Продукт системы ферментативного расщепления подвергали вторичному разделению белков с помощью аффинной хроматографии HisTrap FF для получения целевого белка с удалением метки для последующих реакций ферментативного катализа in vitro. Система ферментативных реакций была следующей: 10 ммоль·л-1 УДФ, 100 ммоль·л-1 сахарозы, 50 ммоль·л-1 MgCl2, 60 мкг белка CtSus, Трис-HCl (рН 7.0) добавляли до 100 мкл, реагировали на водяной бане при 30 градусах в течение 6 часов, а методы последующей обработки и анализа ВЭЖХ проводили, как описано в ссылке [19].

Трехмерное предсказание структуры и анализ молекулярного докинга белка CtSus AlphaFold2 использовали для предсказания трехмерной структуры белка CtSus [20]. Молекулу лиганда гидрировали и заряжали с помощью программного обеспечения AutoDock Tools 1.5.6. Карман связывания субстрата был получен путем выравнивания с матричным белком AtSus1 (PDBID 3S28). Боковые цепи аминокислотных остатков вокруг полости были гибкими.

Размер ячейки сетки был установлен на 40 × 40 × 40 Å3, а шаг сетки составлял 0,375 Å. Молекулярный докинг осуществляли в AutoDock Vina [21]. Программное обеспечение PyMOL 2.0 использовалось для визуализации модели с наилучшей аффинностью (kcat·mol-1

).

Статистический анализ Для статистического анализа использовался GraphPad Prism 9. Экспериментальные данные выражали как среднее ± стандартное отклонение. Критерий Стьюдента использовался для сравнения между двумя группами, а односторонний дисперсионный анализ использовался для сравнения между несколькими группами. Разница считалась статистически значимой, когда P < 0,05.