Эхинакозид Rb1 ослабляет возрастные сосудистые нарушения, модулируя путь газа6

АБСТРАКТНЫЙ

Контекст:ЭхинакозидRb1 (Rb1) оказывает множество полезных эффектов и защищает от сердечно-сосудистых заболеваний.

Цель: исследовать, может ли Rb1 ослаблять возрастные сосудистые нарушения, и определить механизм. Материалы и методы. Самки мышей линии C57BL/6J в возрасте 2 и 18 месяцев, случайным образом распределенные в группы Young, Young + 20 мг/кг Rb1, Old + носитель, Old + 10 мг/кг Rb1 и Old + 20 мг/кг Rb1, получали ежедневно. внутрибрюшинно вводили носитель или Rb1 в течение 3 месяцев. Сегменты грудного отдела аорты использовались для исследования эндотелийзависимой вазорелаксации. Ткани левой грудной аорты собирали для гистологического или молекулярного анализа экспрессии, включая белки, связанные со старением, маркеры, относящиеся к кальцификации и фиброзу, и экспрессию Gas6/Axl.

Результаты: мы обнаружили, что в группе, получавшей носитель Oldþ, экспрессия белков старения и молекул клеточной адгезии была значительно повышена, с худшей эндотелийзависимой релаксацией грудной аорты (58,35% ± 2,50%), чем в группе Young (88,84% ± 1,20%). ). Однако обработка Rb1 значительно снижала уровни экспрессии этих белков и сохраняла эндотелий-зависимую релаксацию у старых мышей. Кроме того, лечение Rb1 также уменьшало отложение кальция, отложение коллагена и уровни экспрессии белков коллагена I и коллагена III у старых мышей. Кроме того, мы обнаружили, что снижение экспрессии белка Gas6 на 41,72 процента и экспрессии мРНК на 52,73 процента у старых мышей по сравнению с молодыми мышами было отменено обработкой Rb1. Но не было существенной разницы в экспрессии Axl между группами.

Выводы. Наше исследование подтверждает, что Rb1 может уменьшать повреждение сосудов, предполагая, что Rb1 может быть потенциальнымсредство против сосудистых нарушений, связанных со старением.

Купить Цистанхе, богатую эхинакозидом

Введение

По оценкам, в течение следующих 30 лет в Китае ожидается увеличение с 12,6 до 26 процентов взрослых в возрасте 65 лет и старше (Zhou and Walker 2021). Хотя продолжительность жизни человека увеличивается, возрастные заболевания продолжают вызывать озабоченность.Сердечно-сосудистые заболеванияявляютсясамые распространенные заболеваниякоторые поражают пожилых людей.Сосудистое старениесопровождается сосудистыми структурными и функциональными изменениями, является важным независимым фактором рискасердечно-сосудистые заболевания(Лакатта и Леви, 2003). Эпидемиологические исследования показали, что 82 процента пациентов, умирающих от сердечно-сосудистых заболеваний, находятся в возрасте 65 лет и старше (Moslehi et al. 2012). Таким образом, изучение механизма возрастных сосудистых нарушений и поиск препаратов, которые могут защитить сосудистую функцию от возрастного ухудшения, могут сыграть важную роль в снижении частоты и распространенности возрастных сердечно-сосудистых заболеваний у пожилых людей.

Артериальное старение вовлечено в патогенез сосудистой дисфункции и различных сердечно-сосудистых заболеваний и является отличительной чертой старения (Minamino and Komuro, 2007). Сосудистые изменения, возникающие в результате старения, различаются и включают дисфункцию эндотелия, гипертрофию гладкомышечных клеток сосудов (ГГМК), дилатацию артерий, реорганизацию внеклеточного матрикса (ВКМ), кальцификацию сосудов и увеличение отношения коллагена к эластину с фрагментацией. и ригидность сосудов (Tolle et al. 2015). Брандес и др. (2005) сообщили, что возрастная эндотелиальная дисфункция обычно характеризуется дисбалансом эндотелиальных релаксационных и сократительных факторов. Дальнейшее исследование Herrera et al. (2010) также показали, что эндотелиальная дисфункция тесно связана с прогрессирующим снижением эндотелийзависимой вазодилатации. Однако до сих пор неясно, как старение влияет на вазодилатацию или вызывает дисбаланс связанных факторов и в конечном итоге приводит к сосудистой дисфункции. Акоста и др. (2008) показали, что сосудистые клетки, подвергающиеся старению, могут продуцировать молекулы адгезии, в том числе ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1), белок 1 адгезии сосудистых клеток (VCAM-1) и молекулу межклеточной клеточной адгезии{{ 14}} (ICAM-1). Считалось, что все эти молекулы адгезии играют важную роль в привлечении моноцитов к атеросклеротическим участкам, а затем инициируют ремоделирование сосудов, что в конечном итоге приводит к снижению податливости и увеличению жесткости (Acosta et al. 2008; Kovacic et al. 2011). Сосудистая жесткость является наиболее важным проявлением старения сосудов. Это связано с ремоделированием ВКМ и способствует снижению вазодилатации. Предыдущие исследования продемонстрировали, что жесткость сосудов и старение СГМК связаны с медиальной кальцификацией и отложением коллагена (Mauriello et al., 1992; McClelland et al., 2006; Nakano-Kurimoto et al., 2009; Wendorff et al., 2015; Kim et al., 2018). ). Следовательно, дисфункция вазодилатации может быть результатом кальцификации и фиброза. Уменьшение отложения кальция или коллагена может отсрочить возрастное поражение артерий.

ЭхинакозидRb1 (Rb1) является одним из активных компонентов женьшеня. Исследования показали, что Rb1 оказывает множество полезных антистареющих и антиапоптотических эффектов, особенно в защите миокарда и эндотелия (Zheng et al. 2017; Zhou et al. 2017; Zheng et al. 2020). Недавние исследования показали, что Rb1 может снижать кальцификацию сосудов, связанную с хроническим заболеванием почек, и экспрессию коллагена I типа у крыс (Zhou et al. 2019b). Находки также предполагают, что Rb1 снижает экспрессию коллагена I типа (Kwok et al. 2012). Однако влияние Rb1 на возрастные сосудистые нарушения не исследовалось.

Сообщалось, что Rb1 ингибирует кальцификацию сосудов посредством трансактивации гена 6 (Gas6), специфичного для остановки роста, in vitro (Nanao-Hamai et al. 2019). Gas6, член семейства витамин К-зависимых белков, участвует в регуляции множества клеточных функций после связывания со своим рецептором Axl, тирозинкиназой мембранного рецептора (Nakano et al., 1997; Fridell et al., 1998; Yanagita et al. 2001). Некоторые исследования показали, что путь Gas6/Axl играет ключевую роль в биологии сосудов и таких заболеваниях, как сосудистая кальцификация, ремоделирование сосудов и атеросклероз (Korshunov et al., 2006; Hurtado et al., 2010; Son et al., 2010). Мы предполагаем, что Rb1 может ослаблять возрастные сосудистые нарушения путем подавления кальцификации и фиброза, которые потенциально связаны с регуляцией пути Gas6/Axl.

Материалы и методы

Экспериментальные реагенты

Rb1 (чистота более 98 процентов) был получен от Victory (Сычуань, Китай). Антитела против p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) и GAPDH (ab181603) были приобретены у Abcam. (Массачусетс, США). Антитела против коллагена I (14695), коллагена III (22734) и Axl (13196) были приобретены у Proteintech Group (Массачусетс, США). Антитела против Gas6 (A8545) и p16INK4a (A0262) были приобретены у ABclonal Technology (Hubei, Китай). Модифицированный буфер Krebs-Henseleit (KH), фенилэфрин (сильное сосудосуживающее средство) и ацетилхолин (Ach, эндотелиально-зависимый донор NO) были приобретены у Sigma-Aldrich (MO, США). Все остальные использованные реактивы были аналитической чистоты.

Животные и управление

Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Сунь Ятсена. Большинство исследований долголетия показали влияние на женщин (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); следовательно, мы провели наше долгосрочное исследование с использованием самок мышей. Самки мышей C57BL/6J в возрасте 2 и 18 месяцев были получены из Центра экспериментальных животных Университета Сунь Ятсена. Мышей кормили обычной пищей и содержали в контролируемых условиях (24 ± 2 C и 50 ± 5 процентов влажности) с 12-часовым световым периодом свет/темнота в конкретных условиях, свободных от патогенов. 40 молодых самок мышей C57BL/6J в возрасте 2 месяцев были случайным образом распределены в группы Young и Young + 20 мг/кг Rb1 (Young + Rb1-20) (n=20 в каждой). Этим мышам вводили ежедневную внутрибрюшинную инъекцию носителя (стерильный физиологический раствор) или 20 мг/кг Rb1, растворенного в носителе, в течение 3 месяцев перед эвтаназией путем удушения CO2 в возрасте 5 месяцев. 60 самок мышей C57BL/6J в возрасте 18 месяцев случайным образом распределяли в группу Old + носитель, Old + 10 мг/кг Rb1 (Old + Rb1-10) и Old + 20 мг/кг Rb1 (Old + Rb 1-20) групп (n=20 в каждой). Мыши, которые выжили до конца этого эксперимента, получали ежедневные внутрибрюшинные инъекции только носителя или Rb1 (10 или 20 мг/кг) в течение 3 месяцев, после чего мышей подвергали эвтаназии в возрасте 21 месяца. Эксперименты повторяли не менее трех раз с 4-5 мышами в группе.

Материалы и методы Экспериментальные реактивы

Rb1 (чистота более 98 процентов) был получен от Victory (Сычуань, Китай). Антитела против p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) и GAPDH (ab181603) были приобретены у Abcam. (Массачусетс, США). Антитела против коллагена I (14695), коллагена III (22734) и Axl (13196) были приобретены у Proteintech Group (Массачусетс, США). Антитела против Gas6 (A8545) и p16INK4a (A0262) были приобретены у ABclonal Technology (Hubei, Китай). Модифицированный буфер Krebs-Henseleit (KH), фенилэфрин (сильное сосудосуживающее средство) и ацетилхолин (Ach, эндотелиально-зависимый донор NO) были приобретены у Sigma-Aldrich (MO, США). Все остальные использованные реактивы были аналитической чистоты.

Животные и управление

Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Сунь Ятсена. Большинство исследований долголетия показали влияние на женщин (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); следовательно, мы провели наше долгосрочное исследование с использованием самок мышей. Самки мышей C57BL/6J в возрасте 2 и 18 месяцев были получены из Центра экспериментальных животных Университета Сунь Ятсена. Мышей кормили обычной пищей и содержали в контролируемых условиях (24 ± 2 C и 50 ± 5 процентов влажности) с 12-часовым световым периодом свет/темнота в конкретных условиях, свободных от патогенов. 40 молодых самок мышей C57BL/6J в возрасте 2 месяцев были случайным образом распределены в группы Young и Young + 20 мг/кг Rb1 (Young + Rb1-20) (n=20 в каждой). Этим мышам вводили ежедневную внутрибрюшинную инъекцию носителя (стерильный физиологический раствор) или 20 мг/кг Rb1, растворенного в носителе, в течение 3 месяцев перед эвтаназией путем удушения CO2 в возрасте 5 месяцев. 60 самок мышей C57BL/6J в возрасте 18 месяцев случайным образом распределяли в группу Old + носитель, Old + 10 мг/кг Rb1 (Old + Rb1-10) и Old + 20 мг/кг Rb1 (Old + Rb 1-20) групп (n=20 в каждой). Мыши, которые выжили до конца этого эксперимента, получали ежедневные внутрибрюшинные инъекции только носителя или Rb1 (10 или 20 мг/кг) в течение 3 месяцев, после чего мышей подвергали эвтаназии в возрасте 21 месяца. Эксперименты повторяли не менее трех раз с 4-5 мышами в группе.

Определение вазорелаксации в грудных кольцах аорты

После эвтаназии животных кольца грудной аорты быстро удаляли и помещали в холодный буферный раствор KH (118 ммоль/л NaCl, 4,75 ммоль/л KCl, 25 ммоль/л NaHCO3, 1,18 ммоль/л MgSO4 1). 18 ммоль/л KH2PO4, 2,54 ммоль/л CaCl2 и 11,1 ммоль/л глюкозы), окружающие жир и ткани тщательно удаляли. Длина колец аорты составляла примерно 3 мм. Сегменты аорты подвешивали на крюках из нержавеющей стали, аэрировали в буфере KH и непрерывно оксигенировали 95% O2 при 37°C. Затем кольца аорты подключали к датчикам силы FORT-10 для сбора данных MacLab. Первоначальное пассивное напряжение в кольцах аорты было установлено на уровне 3 мН в течение 30 минут для достижения стабильности сосудистых колец перед дальнейшими экспериментами. Буфер KH заменяли каждые 10 мин. В ванночку с тканями добавляли фенилэфрин в концентрации 10 5 моль/л, чтобы вызвать вазоконстрикцию. После достижения стабильности сосудистого кольца вазорелаксант АХ (10 9 -10 5 моль/л) сразу же добавляли в ванну с тканями для получения кривой доза-реакция. Расслабление при каждой концентрации измеряли и выражали в процентах силы, генерируемой в ответ на фенилэфрин.

Иммуногистохимия

Ткани грудной аорты фиксировали в формалине, обезвоживали, заливали в парафин и разрезали на поперечные срезы толщиной 4 мкм. Эти срезы инкубировали в цитратном буфере (pH 6.0) и дважды подвергали микроволновой обработке в течение 10 минут после депарафинизации и регидратации. Козью сыворотку (10 процентов) (Gibco, BRL, NY, USA) использовали для блокирования неспецифического связывания в течение 1 часа при 37°С с последующей инкубацией в течение ночи с первичными антителами против p21Cip1 (1:1000) и p16INK4a (1:200). ) при 4°С во влажном боксе. После трех промывок в PBS добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) вторичные антитела (Abcam) и инкубировали в течение 60 мин при 37°C с последующим окрашиванием диаминобензидином (1:100, Abcam). Для контрастного окрашивания ядер клеток применяли гематоксилин. Срезы покрывали нейтральной смолой и фотографировали под микроскопом Zeiss.

Окрашивание гематоксилин-эозином (HE)

Срезы грудной аорты, залитые в парафин, окрашивали гематоксилином в течение 2 мин. После промывки и обработки 1%-ным кислым спиртом срезы окрашивали эозином в течение 3 мин. После этого срезы промывали, обезвоживали и обрабатывали ксилолом перед микроскопическим исследованием. Срезы грудной аорты фотографировали под микроскопом Zeiss.

Трихромная окраска по Массону

Залитые парафином срезы грудной аорты окрашивали железным гематоксилином Вейгерта в течение 10 минут после депарафинизации и регидратации, а затем промывали PBS в течение 5 минут. Затем ткани окрашивали в растворе фуксина алой кислоты Бибриха в течение 5 мин и промывали дистиллированной водой. Затем срезы несколько раз подвергали дифференциации и обезвоживанию в 75-процентном и 90-процентном спирте с последующей промывкой водопроводной водой. Наконец, срезы очищали в ксилоле и заливали монтажной средой. Срезы визуализировали под микроскопом. На отложение интерстициального коллагена указывает сине-зеленое окрашивание.

Окраска ализариновым красным S

Для окрашивания кальцификации аорты срезы грудной аорты окрашивали 2-процентным раствором ализаринового красного S в течение 10 минут и промывали PBS. Затем срезы замачивали в безводном ацетоне в течение 30 с, в смешанном растворе безводного ацетона и ксилола (объемное соотношение=1:1) в течение 15 с и в безводном ксилоле в течение 1 мин. Интерстициальные соли фосфата кальция были обозначены красным окрашиванием.

Вестерн-блоттинг

Грудные отделы аорты помещали в буфер для лизиса RIPA (HaiGene, Харбин, Китай), дополненный ингибитором протеазы (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA), а затем гомогенизировали ультразвуком на льду. Тканевой лизат центрифугировали при 12,000 g при 4°С в течение 15 мин, супернатант собирали в новую пробирку. После этого определяли концентрацию белка в супернатанте с помощью набора для анализа белка BCA (Институт биотехнологии Beyotime, Цзянсу, Китай). SDS PAGE проводили с равными количествами белка из каждого образца, как описано ранее (Zheng et al. 2020), а затем белки переносили на мембраны PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Мембраны инкубировали при 4°С в течение ночи с одним из следующих первичных антител после блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином (Gibco) в течение 1 ч при комнатной температуре: p21Cip1 (1:1000), p16INK4a (1:1000), ICAM{ {16}} (1:1000), VCAM-1 (1:5000), PAI-1 (1:1000), коллаген I (1:1000), коллаген III (1:300), Gas6 (1:1000), Axl (1:500) и GAPDH (1:1000). После промывки мембраны инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с HRP (Boster, Ухань, Китай), в течение 1 ч при комнатной температуре. Связывание вторичного антитела анализировали с использованием набора ECL (EMD Millipore), а интенсивность полос анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ (версия 1.41; Национальный институт здоровья, Мэриленд, США). Экспрессию GAPDH использовали в качестве внутреннего контроля.

Количественная ОТ-ПЦР в реальном времени (кПЦР)

Сначала из грудной аорты выделяли тотальную РНК с использованием универсального набора для выделения РНК TaKaRa MiniBEST (9767, TaKaRa) в соответствии с протоколами производителя. Затем концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра DS-11 FX (DeNovix). Затем выделенную РНК (по 1000 нг на реакционную систему объемом 20 мл) подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием PrimeScriptTM RT Master Mix (RR360A, TaKaRa) в соответствии с инструкциями производителя в системе ProFlex PCR System (Thermo Scientific). ). Наконец, продукты обратной транскрипции использовали в качестве матриц для дальнейшей ПЦР-амплификации с SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa). Были использованы следующие последовательности праймеров: Gapdh: прямая 50 -CAGCAACTCCCA CTCTTCCAC-30 и обратная 50 - TGGTCCAGGGTTTCTTAC TC-30; и Axl: вперед 50 -GGAACCCAGGGAATATCACAGG- 30 и назад 50 -AGTTCTAGGATCTGTCCATTCCG-30; и Gas6 в прямом направлении 50 -TGCTGCTTCCGAGTCTTC-30 и в обратном направлении 50 -CGGGGTCGTTTCTCGAACAC-30. Каждая реакционная лунка в 96-луночном прозрачном планшете (Thermo Scientific), содержащем 0,4 пмоль/л прямого и обратного праймеров, 1 премикс SYBR Ex Taq II (RR820A, TaKaRa) и 10 нг кДНК. Конечный объем реакционной смеси составлял 20 мл, и все образцы анализировали в трех экземплярах. Амплификацию кДНК проводили следующим образом: предварительная денатурация при 95°С в течение 30 с, затем 40 циклов денатурации при 95°С в течение 5 с и отжиг при 60°С в течение 35 с в программе QuantStudio5 (Thermo Scientific). Для относительного количественного анализа собранных данных использовали метод 2–DDCT. Относительный уровень экспрессии мРНК генов-мишеней получали путем сравнения данных экспериментальной группы с данными контрольной группы относительно Gapdh.

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com WhatsApp плюс 86 15292862950