Сверхэкспрессия GRP78 запускает PINK1-IP3R-опосредованную нейропротекторную митофагию. Часть 2

2.5. Вестерн-блоттинг

Мы глубоко анестезировали крыс с помощью Dolethal (n=4) при 7 dpi, чтобы получить сегменты спинного мозга L4–L5 (длина 5- мм) для вестерн-блоттинга. Мы мгновенно заморозили образцы в жидком азоте.

В последние годы все больше и больше результатов исследований показывают, что существует тесная связь между блоттингом белков и памятью. Блоттинг белков — это аналитический метод обнаружения экспрессии белков, который широко используется в исследованиях в области нейробиологии.

Связь между нейронами тесно связана с хранением памяти. Белковый блоттинг может определить состояние связей между нейронами и экспрессию пре- и постсинаптических белков, что дополнительно раскрывает важную роль белков в формировании и хранении памяти.

Исследования показали, что экспрессия пресинаптических нейрональных белков тесно связана с формированием и хранением памяти. Например, в процессе обучения и памяти нейроны меняют экспрессию пресинаптических белков, и это изменение связано с формированием и хранением новых воспоминаний. Кроме того, некоторые исследования также показали, что изменения в экспрессии некоторых белков связаны с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера.

Таким образом, белковый блоттинг может обеспечить более глубокое понимание состояния связей между нейронами и изменений в экспрессии родственных белков, раскрывая молекулярный механизм нейронов. Это имеет большое значение для изучения механизма формирования памяти и нейродегенеративных заболеваний.

Короче говоря, взаимосвязь между блотингом белков и памятью показывает роль белков в связи между нейронами и хранилищем памяти. Это дает новые идеи и направления для изучения механизма формирования памяти и нейродегенеративных заболеваний. Давайте активно продвигать нейробиологические исследования и вносить вклад в здоровье и долголетие! Видно, что нам необходимо улучшить память, а Цистанхе может значительно улучшить память, поскольку обладает антиоксидантным, противовоспалительным и омолаживающим действием, что может помочь уменьшить окислительные и воспалительные реакции в мозге, тем самым защищая здоровье нервной системы. система. Кроме того, Цистанхе может также способствовать росту и восстановлению нервных клеток, тем самым улучшая связь и функцию нейронных сетей. Эти эффекты могут помочь улучшить память, способность к обучению и скорость мышления, а также предотвратить возникновение когнитивной дисфункции и нейродегенеративных заболеваний.

Нажмите, чтобы узнать, как улучшить работу мозга

Образцы хранили или подвергали дальнейшей обработке путем гомогенизации в лизирующем буфере (20 мМ HEPES, pH 7,7, 251 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА и смеси протеаз (Sigma-Aldrich) и ингибиторов фосфатазы (Roche, Базель, Швейцария). ) с гомогенизатором Поттера на льду.

После центрифугирования лизатов при 800×g в течение 20 минут при 4°C мы собирали супернатант в виде постъядерной фракции и количественно определяли белки с помощью анализа BCA (Pierce Chemical Co.).

Для вестерн-блоттинга мы загружали 30 мкг постъядерных фракций сегментов L4–L5 от каждого животного на 12% ДСН-полиакриламидные гели для электрофоретического разделения белков с последующим переносом на ПВДФ-мембрану в системе BioRadcuvette в 25 мМ. Трис, pH 8,4, 192 мМ глицина, 20% (по объему) метанола.

Мы блокировали мембраны с помощью 5% БСА в PBS плюс 0,1% Твин-20 в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубировали при 4 ◦C в течение ночи с первичным антителом: мышиным анти- -актином ( 1:10000; SigmaAldrich), мышиное анти-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), мышиное анти-CV (1:1000, Invitrogen), кроличье анти-HSP60 (1:500, Antibodies-online), мышиное анти- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), мышиный анти-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), кроличий анти-Паркин (1:500, Abcam, Кембридж, Великобритания), мышиный анти-PINK1 (1:500, Abcam), кроличьи анти-NRF2 (1:500, Abcam), анти-MNF2 (1:500, Abcam), кроличьи анти-GRP75 (1:500, Abcam).

После нескольких промываний мембраны инкубировали в течение 2 ч с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (1:5000, Vector). Мембрану визуализировали с помощью хемилюминесцентной смеси 1:1 (0,5 М люминол, 79,2 мМ п-кумаровая кислота, 1 М трис-HCl, pH 8,5) и (8,8 М перекись водорода, 1 М трис-HCl; pH 8,5) и изображения были получены с помощью аппарата Gene Genome и проанализированы с помощью программного обеспечения Gene Snap и Gene Tools (Syngene).

2.6. Модель in vitro

Клетки NSC34 культивировали в модифицированной среде Игла с высоким содержанием глюкозы (DMEM, Biochrom, Кембридж, Великобритания), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Sigma-Aldrich), 100 единиц/мл пенициллина и 0,5 X раствором пенициллина/стрептомицина. (Sigma-Aldrich) и хранили в сухом инкубаторе при температуре 37 ◦C и в атмосфере 5% CO2, по существу, как описано ранее [26].

Через 4 дня культивирования клеток без замены среды клетки NSC34 имели дифференцированный фенотип, характеризующийся наличием длинных нейритов. На 4-й день к клеткам добавляли лекарства. Растворы Tun (Sigma-Aldrich, Миссури, США) и EFV (Bristol-Myers Squibb, Нью-Йорк, США) готовили в концентрации 10X и растворяли в DMEM.

Через 24 часа оценивали жизнеспособность клеток, инкубируя клетки с раствором МТТ 4 мг/мл в течение 3 часов. Образовавшиеся синие кристаллы формазана растворяли в ДМСО и измеряли поглощение при 570 нм с помощью микропланшет-ридера (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, США).

2.7. Нуклеофекция

Мы трансфицировали миллион клеток 2 мкг плазмиды для экспрессии GFP, GRP78, HAPARK, мышиного sh-eGFP, мышиного sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), мышиного sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) и /или мышь sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) с использованием Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Базель, Швейцария) и набора Nucleofactor V (Lonza) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для статического цитометрического анализа мы высевали клетки в {{0}}луночные планшеты, покрытые 10% коллагена. После культивирования клетки фиксировали 4% PFA, дважды промывали PBS и сохраняли или впоследствии добавляли блокирующий буфер, содержащий 0,3% PBS (по объему) тритона X-100 и 10% фетальной бычьей сыворотки. Через 3 дня культивирования клеток добавляли растворенные в DMEM лекарства.

Для этих экспериментов мы использовали 1 мкМ Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 мкМ CsA (Sigma-Aldrich) или 10 мкМ BAPTA-AM (Sigma-Aldrich). -Олдрич). Через 5 часов после обработки мы либо фиксировали клетки для иммуноцитохимии с помощью 4% PFA, либо гомогенизировали их в модифицированном буфере RIPA (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EGTA). , 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, коктейли протеаз и фосфатаз) для иммуноблоттинга. Иммуногистохимию проводили путем двукратного промывания образцов PBS и инкубации с блокирующим буфером, содержащим PBSplus 0,3% (об./об.) тритона X-100 и 10% фетальной бычьей сыворотки.

Мы инкубировали со следующими первичными антителами: кроличьи анти-IP3R (1:200, Abcam), мышиные анти-HA (1:2000, Abcam), мышиные анти-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) и кроличьи анти-HSP60. (1:500, Антитела-онлайн). Для оценки жизнеспособности по МТТ, как описано выше, мы оставили лечение на 24 часа.

2.8. Измерение продукции митохондриального супероксида и ∆ψM

Клетки инкубировали с 2,5 мкМ MitoSOX для анализа супероксида или с 2,5 мкМTMRM для анализа ∆ψM, как от Molecular Probes, так и от Invitrogen, в течение последних 30 минут обработки. Флуоресценцию обнаруживали с помощью микроскопа IX81 Olympus и количественно определяли с использованием программного обеспечения статической цитометрии.

2.9. Электрохимическое измерение потребления кислорода

Клетки (1 × 106 на 1 мл в HBSS) перемешивали в газонепроницаемой камере при 37 ◦C. Измерения проводили с помощью O2-электрода Кларка типа (Rank Brothers, Кембридж, Великобритания) и записывали с помощью данных Dup.18. устройство сбора данных (WPI) сразу после 5-hобработки транспортным средством или Tun.

2.10. Митохондриальное и цитозольное фракционирование

Клетки гомогенизировали в буфере для лизиса (10 мМ HEPES, pH 7,4, 1 мМ EGTA, 250 мМ сахарозы и смеси протеаз (Sigma-Aldrich) и ингибиторов фосфатазы (Roche)) с помощью гомогенизатора Поттера на льду.

После центрифугирования лизатов при 2000×g в течение 5 мин супернатант центрифугировали при 10000×g в течение 12 мин. Супернатант считался растворимой фракцией (S2) и содержал цитозольные белки и микросомы.

Осадок (P2) представлял собой обогащенную митохондриальную фракцию, которую ресуспендировали в модифицированном буфере RIPA (50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EGTA, 1% NP{{8). }}, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, коктейли протеаз и фосфатаз) и концентрацию белка определяли с помощью анализа BCA. Затем образцы обрабатывали для вестерн-блоттинга.

2.11. Просвечивающая электронная микроскопия

Мы погрузили сегменты L{{0}}L5 спинного мозга (ломтики 1- мм) в фиксирующий раствор, состоящий из 2% (мас./об.) PFA и 2,5% (об./об.) глутаральдегида (класс EM). в 0.1 М PBS, pH 7,4 и помещали их на качающуюся платформу на 2 часа, затем фиксировали в 1% (мас./об.) PFA и затем постфиксировали 1% (мас./об.) тетраоксидом осмия (TAAB Lab). ), содержащий 0,08% (мас./об.) гексацианоферрата калия (Sigma-Aldrich) в PBS, в течение 2 часов.

Мы провели четыре промывки деионизированной водой и последовательное обезвоживание в ацетоне. Все процедуры проводили при температуре 4 ◦C, как описано ранее [33]. Образцы заливали в смолу EPON и полимеризовали при 60 ◦C в течение 48 часов.

Образцы обрабатывали для получения полутонких срезов (1 мкм) с помощью микротома Leicaultracut UCT, окрашивали 1% (мас./об.) водным раствором толуидинового синего и исследовали под световым микроскопом для выявления областей вентральных рогов, обогащенных МН.

Ультратонкие срезы (70 нм) вырезали алмазным ножом, помещали на сетки с покрытием и контрастировали с обычными растворами ацетата уранила и растворами цитрата свинца Рейнольдса.

Наконец, мы наблюдали срезы с помощью просвечивающего электронного микроскопа (Jeol 1400), оснащенного камерой GatanUltrascan ES1000CCD. Мы выбрали три среза для каждого условия, проанализировали три МН на секцию и измерили площади ядер по сравнению с общей площадью МН с помощью инструментов ImageJ.

2.12. Биоинформатика и статистика

Мы использовали дисперсионный анализ (ANOVA) для сравнения значений разных экспериментальных групп для данных, которые соответствовали предположению о нормальности. Различия между группами анализировались с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным многодиапазонным тестом Тьюки или с использованием t-критерия Стьюдента. Весь статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0,05 для значимости).

3. Результаты

3.1. Текст

3.1.1. Протеомный анализ сверхэкспрессии GRP78 показал, что митохондрии являются основной мишенью

Чтобы идентифицировать молекулярные механизмы, приводящие к нейропротекции, опосредованной сверхэкспрессией GRP78, мы провели сравнительный протеомный анализ без меток, чтобы выявить как количественные, так и качественные различия между животными, пораженными РА, инфицированными аденовирусами, по сверхэкспрессии GRP78 (Ad-GRP78), который, как ранее было установлено, обладает нейропротекторным действием. МН или бета-галактозидаза (Ad-β-Gal) в качестве контроля [20].

Согласно предыдущим исследованиям, проведенным в нашей лаборатории, в качестве временного интервала для анализа были выбраны семь дней после травмы (dpi) [20,25]. В предыдущем сравнении модели регенерации после дистальной аксотомии и шва седалищного нерва с нашей моделью дегенеративного РА мы наблюдали, что сигнальные события были сходными до 7 дней на дюйм, когда после РА возникали дивергентные продегенеративные события [20,25].

Анализ постъядерных фракций из сегментов спинного мозга L4-L5 без меток методом ЖХ-МС/МС привел к идентификации 1420 белков, по крайней мере, с двумя пептидами на белок, как сообщалось ранее для других образцов и исследований [25]. .

В общей сложности 566 и 732 белка или пептида были значительно изменены из-за сверхэкспрессии Ad-GRP78 или Ad-β-Gal соответственно у животных, пораженных РА, по сравнению с животными, пораженными РА, не инфицированными вирусом (p < 0 .05) (Таблицы S1 и S2).

Мы сравнили оба списка и обнаружили, что 22 0 были уникальным образом изменены из-за сверхэкспрессии Ad-GRP78 (таблица S3). Функциональная аннотация этих белков с использованием инструмента базы данных для аннотаций, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID) позволила нам идентифицировать наиболее значимые биологические функции в наборе данных (FDR <0,05) [34,35].

Сверхэкспрессия GRP78 привела к различиям в уровнях белков, участвующих в митохондриальных процессах, функциях и компонентах (таблица S4A-C, рисунок S1A-C). Термины Gene Ontology (GO) и анализ обогащения пути KEGG этих данных показали, что у животных, инфицированных Ad-GRP78, наблюдалось значительное снижение уровней многих белков с митохондриальными функциями, включая белки внешней и внутренней поверхности митохондрий, белки дыхательного комплекса, и матричные белки.

Мы подтвердили различия в уровнях белков, выявленных в протеомном списке, таких как GRP75, уровень которого был повышен (p < 0.05), и субъединицы комплекса V (CV), уровень которого снижен (p=0.03). в группах GRP78, как и ожидалось (рис. 1А).

Во всем списке наиболее сильно снижена активность 2-оксоглутарата/белка-переносчика малата OGC (SCL25A11), MT-ND3 (опухолевого супрессора, который участвует в темалат-аспартатном шаттле и регенерирует пул НАДН в митохондриальном матриксе для обеспечения возможности комплекса I функция), субъединица 3 НАДН-дегидрогеназы комплекса I, аминотрансфераза гамма-аминомасляной кислоты ABAT и субъединица убихинол-цитохром-С-редуктазы комплекса III. Напротив, очень немногие белки были активированы (рис. 1B).

Как и ожидалось, одним из белков с повышенной регуляцией был GRP78, а другими белками с повышенной регуляцией были переносчик аминокислот EAAT2, который в основном расположен в плазматической мембране, а иногда и в митохондриях в возбуждающих синапсах, и гидроксиацил-КоА-дегидрогеназа HADHA, которая катализирует последние три стадии митохондриальной бета-версии. -окисление длинноцепочечных жирных кислот.

Мы расширили анализ, чтобы выяснить, были ли модифицированы другие белки в митохондриях или белки, связанные с функцией митохондрий, из протеомного списка, чтобы подтвердить функциональное поражение митохондрий (рис. 1C).

Мы наблюдали, что митохондриальная консервативная динамин-связанная оптическая атрофия 1 ГТФазы (OPA1), которая участвует в слиянии [36], подавляется (p < 0.1); LONP1, АТФ-зависимая протеаза, которая опосредует селективную деградацию неправильно свернутых полипептидов, имела тенденцию к увеличению, но не наблюдалось различий в уровнях убихинона NDUFA9, транскрипционного фактора NRF2, который регулирует гены, содержащие элементы антиоксидантного ответа, или других динаминов. -родственная ГТФаза, участвующая в инфузии, такая как митофузин 2 (MFN2) [36].

Подробное описание изменений, обнаруженных в митохондриях, показано на схеме на рисунке 1D. Динамика митохондрий важна для реакций на стресс, поскольку поврежденные митохондрии могут сливаться для обмена веществом, а деление митохондрий обеспечивает сегрегацию поврежденных митохондрий и последующую митофагию [37].

Учитывая, что основное количество белков с пониженной регуляцией локализуется в митохондриях и не наблюдалось явных изменений в отношении активности слияния митохондрий при анализе MFN2 и соотношения форм L/S OPA1 (рис. 1C), мы исследовали маркеры, связанные с митофагией.

Классически зависимая от аутофагии деградация митохондрий происходит после деполяризации и обычно запускается повышенным накоплением полной длины фосфатазы и тензиномомолога (PTEN) предполагаемой киназы 1 (PINK1) на внешней митохондриальной мембране.

Впоследствии убиквитин-протеинлигаза Паркин между кольцами E3 привлекается для маркировки белка внешней мембраны митохондрий деполяризованных митохондрий посредством убиквитилирования [38-41]. Верхняя часть рисунка 2А не показывает никаких изменений в уровнях Паркина, но значительное снижение полноразмерного PINK1, вызванного РА-повреждением в ипсилатеральном сегменте спинного мозга L4-L5, по сравнению с контролем на 7 dpi. Напротив, сверхэкспрессия GRP78 снижала уровень Паркина, но удваивала уровни PINK1 после РА по сравнению с контрольной экспрессией несвязанного белка -Gal (рис. 2А, внизу).

Повышение регуляции полноразмерного PINK1 согласуется с индукцией митофагии [42], а снижение паркина может быть связано с продвинутым состоянием демонтажа органелл, что наблюдается у остальных белков митохондрий.

Мы далее исследуем совместную локализацию митохондрий и ассоциированных с микротрубочками белков 1A/1B легкой цепи 3 (LC3)-положительных точек, ключевого компонента основного механизма макроаутофагии и необходимого для процесса митофагии [43].

Используя конфокальную микроскопию, мы наблюдали значительное увеличение совместной локализации митохондрий, меченных с помощью анти-ЦОГ IV, с LC3-положительными точками после РА только в поврежденных МН, сверхэкспрессирующих GRP78 при 7 dpi (рис. 2B).

Существование митофагии в вырванных МН мы подтвердили только при сверхэкспрессии GRP78 путем анализа образцов с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.

Мы наблюдали обильные вакуоли с поглощенными митохондриями, признак митофагии [37], напоминающие митофагосомы, и несколько ERцистерн в тесной связи с митохондриями внутри МН у животных Ad-GRP78, но мы не обнаружили их у Ad- -Gal, поврежденных RA. образцы крыс при разрешении 5 dpi (рис. 2C).

Рисунок 1. Сверхэкспрессия GRP78 у животных, пораженных РА, нацелена на митохондриальные белки. (A) Иммуноблоттинг и гистограммы, показывающие средние кратные изменения (± SEM) уровней белка GRP78, GRP75 и CV в сегментах спинного мозга L4-L5 в GRP78 по сравнению с

-Гал сверхэкспрессирует крыс, пораженных РА, на 7 dpi. Уровни были нормализованы по значениям актина (n=4; * p < 0,05 против Ad- -Gal, t-критерий Стьюдента). (B) Гистограмма изменений складок митохондриального белка, полученная с помощью протеомного анализа сегментов спинного мозга L4-L5 у животных, пострадавших от РА, которые сверхэкспрессируют GRP78 по сравнению с группой Ad- -Gal на 7 dpi. (C) Иммуноблоттинг и гистограммы, показывающие средние кратные изменения (± SEM) NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1, нормализованные по актину. (Нет существенных различий между группами. Т-критерий Стьюдента). (D) Схематические митохондрии с белками, измененными в результате сверхэкспрессии GRP78 в сегментах спинного мозга L4-L5 животных, пораженных РА, выделены желтым (уменьшение) или синим (увеличение) при разрешении 7 точек на дюйм.

Рисунок 2. Митофагия модулируется in vivo после РА у крыс, которые сверхэкспрессируют GRP78. (A) Иммуноблоты и соответствующие гистограммы для анализа кратных изменений PINK1 и PARK уровней белка (средние значения ± SEM), нормализованных к уровням актина, в сегментах спинного мозга L4-L5 крыс, пораженных РА, по сравнению с

контрольный (вверху) или из групп Ad{{0}}Gal и Ad-GRP78 (внизу) на 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, t-критерий Стьюдента). (B) Слева: микрофотографии репрезентативных МН на ипсилатеральном участке от животных, пострадавших от РА, которым интратекально вводили группы AAVrh10-GFP или AAVrh10-GRP78 при 7 dpi. Образцы окрашивали на COX IV (красный) и LC3 (зеленый) и докрашивали флуоресцентным Нисслем (синий).

Масштабная линейка=10 мкм и цифровое увеличение на вставках 10-кратное.

Обратите внимание, что совместная локализация наблюдается только в группе AAVrh10-GRP78. Справа: гистограмма, показывающая анализ % точек совместной локализации COX IV и LC3. Среднее значение ± SEM совместной локализации COX IV и LC3 (n=4; ** p < 0.01, t-критерий Стьюдента). (C) Репрезентативные изображения трансмиссионной электронной микроскопии, на которых митохондрии различаются в МН спинного мозга: а - изображение цитоплазмы МН, показывающее митохондрии у контрольного животного; б — изображение цитоплазмы МН пораженной РА крысы из группы Ad- -gal; в — изображение цитоплазмы МН крысы, пораженной РА, из группы Ad-GRP78 с некоторыми поглощенными митохондриями, отмеченными красными звездочками; d, изображение с большим увеличением показано на (C), указывающее на большие митохондрии и контакт ER. Масштабные линейки указаны на рисунках.

В целом, эти результаты позволяют предположить, что сверхэкспрессия GRP78 может индуцировать МН, отключенные от митофагина, после РА, и это может способствовать нейропротекции.

3.1.2. Сверхэкспрессия GRP78 восстанавливает поврежденную функцию митохондрий

Затем мы дополнительно исследовали влияние сверхэкспрессии GRP78 на митохондрии, используя модель стресса ER in vitro, поскольку это повреждение появляется рано после повреждения РА in vivoa, о котором сообщалось ранее [20,26], и это надежный метод скрининга новых нейропротекторных агентов [2,44] ].

В этой модели используется туникомицин (Tun), который является индуктором ER-стресса, который вызывает образование промежуточных соединений N-ацетилглюкозамин-липид, тем самым предотвращая гликозилирование вновь синтезированных белков и приводя к неправильному сворачиванию белков. Мы использовали это, поскольку сообщалось, что остановка секреторного пути играет ключевую роль в нейродегенеративном процессе после РА [26].

Сначала мы подтвердили, что нуклеофекция мотонейроноподобных клеток NSC34 соответствующим вектором приводит к образованию GRP78 (рис. 3А). В этих клетках экспрессия GRP78 значительно повышала выживаемость в среде, содержащей Tun (рис. 3B).

Хотя лечение Tun обычно индуцирует сам GRP78, эта эндогенная сверхэкспрессия происходит довольно поздно (на 24 часа) (рис. S2). Мы также задавались вопросом, сможем ли мы определить, оказывает ли сверхэкспрессия GRP78 нейропротекторное действие в другой модели in vitro, которая, как мы ранее сообщали, воспроизводила некоторые характеристики смерти MN после повреждения РА [26].

Эта модель основана на повреждении цитоскелета, индуцированном нокодазолом, который препятствует полимеризации микротрубочек. Экспрессия GRP78 также повышала жизнеспособность клеток, культивируемых в присутствии нокодазола (рис. 3B).

Затем мы оценили функцию митохондрий путем измерения образования активных форм кислорода (АФК) в митохондриях с использованием MitoSOX, потенциала митохондриальной мембраны (∆ψm) с использованием метилового эфира тетраметилродамина (TMRM) и скорости потребления O2 в наших клетках NSC34, подвергнутых стрессу ER. со сверхэкспрессией GRP78 или без нее.

В качестве положительного контроля мы использовали эфавиренз (EFV), митотоксический агент, который изменяет все три параметра [45]. Мы заметили, что уровни MitoSOX постепенно увеличивались после добавления Tun, достигая статистической значимости через 24 часа, и что генерация АФК значительно увеличивалась в клетках, обработанных EFV, с первого часа после обработки по сравнению с контрольными клетками, обработанными носителем (рис. S3A).

Сверхэкспрессия GRP78 приводила к значительно более низким уровням ROS в митохондриях по сравнению с клетками, экспрессирующими GFP, через 24 часа после обработки Tun или EFV (рис. 3C). ∆ψm снизился после 5 и 24 часов лечения Tun и после 24 часов лечения EFV (рис. S3B). Восстановление этого параметра было достигнуто за счет сверхэкспрессии GRP78 в клетках, обработанных Tun или EFV (рис. 3D).

Скорость потребления O2 снижалась в течение 80 мин анализа после добавления Tun в клетках, экспрессирующих GFP (наклон −0.063,R2=0.98), но потребление O2 было стабилен в клетках, сверхэкспрессирующих GRP78-, несмотря на присутствие Tun (наклон -0,221, R2=0.99) (рис. 3E, слева).

Через 5 часов дыхание нормализовалось в клетках, сверхэкспрессирующих GRP78-, и сильно ухудшалось в клетках, экспрессирующих GFP (рис. 3E, справа). В целом эти результаты позволяют предположить, что GRP78 ослабляет митохондриальную дисфункцию, вызванную стрессом ER или митотоксичностью.

For more information:1950477648nn@gmail.com