Вот более краткая версия названия: Одновременное определение шести компонентов в Cistanche Tubulosa методом ближней инфракрасной спектроскопии.

1. Введение

Цистанхе (Hoffmg. Et Link) — многолетний фанерогамный род растений семейства Оробанховые. Большинство видов, принадлежащих к роду Cistanche, на протяжении тысячелетий использовались в Китае как лекарственные растения; иметь репутацию превосходного тоника; и известны как «Женьшень пустыни». Цистанхе трубчатая — облигатный паразит корней многолетнего растения Tamarix chinensis. Он зарегистрирован в Китайской фармакопее как подлинный источник.Цистанчес Херба(Китайское название: Roucongrong) из издания 2005 года. Современные фармакологические исследования видов Cistanche были начаты в 1980-х годах. Фармакологические исследования показали, что экстракты растений цистанхе обладают широким спектром действия, например, при лечении почечной недостаточности и старческих запорах, повышении способности к обучению и запоминанию, борьбе с болезнью Альцгеймера, повышении иммунитета, борьбе со старением, борьбе с усталостью и т. д. За последние три десятилетия комплексные и систематические фармакологические исследования были объединены с фитохимическими исследованиями, чтобы пролить свет на материальную основу благотворного воздействия корней растений цистанхе. Эти исследования показывают, что фенилэтаноидные гликозиды (PhG) были основными эффективными компонентами растений цистанхе, играющими ключевую роль в лечении почечной недостаточности, импотенции, борьбе со старением и болезни Альцгеймера. Содержание двух PhG (эхинакозида и вербаскозида) требовалось Китайской фармакопеей. Между тем, углеводы, такие как маннит, сахароза, глюкоза и фруктоза в растениях цистанхе, обладают слабительной функцией, а углеводные группыЦистанхе растенияиспользовались для лечения запоров.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНШ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ТЕСТОСТЕРОНА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Дикие ресурсы C. Tubeulosa в основном распространены в районе пустыни Такла-Макан на юге Синьцзянского автономного района в Китае. Подобно многим другим видам, используемым в качестве традиционных китайских лекарств (ТКМ), C. Tubeulosa имеет большую экономическую ценность и практически вымерла в дикой среде обитания из-за чрезмерного сбора. Культивирование C. Tubeulosa началось в 1990-х годах в Китае для обеспечения поставок сырья для Cistanches Herba, а также для защиты ресурсов диких растений. По состоянию на 2017 год в префектуре Хотан в Синьцзяне выращивается около 13 тысяч га культивируемых C. Tubeulosa. Для расширения выращивания, а также улучшения качества C. Tubeulosa необходимы достижения в технологии посадки.

Основная цель выращивания C. Tubeulosa — получить Cistanches Herba, богатую этими эффективными компонентами. Однако содержание эффективных компонентов вЦистанчес Херба, такие как PhG и олигосахариды, могут подвергаться значительному влиянию многих факторов во время производства. Необходимо изучить систему определения качества C. Tubeulosa в режиме реального времени. Следовательно, необходимо разработать высокопроизводительный метод, позволяющий выполнить требование анализа большого количества образцов за короткий период. Традиционно определение этих основных эффективных компонентов, таких как PhG и углеводы, в C. Tubeulosa обычно достигалось с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Несмотря на точность и надежность, сбор и обработка данных требуют много времени и усилий. Кроме того, много времени и усилий требуется для подготовки проб, которая обычно включает измельчение, экстракцию и фильтрацию анализов ВЭЖХ. Поэтому для получения относительно большого объема данных необходим четкий принцип и простой в использовании инструмент. К счастью, спектроскопия ближнего инфракрасного диапазона (NIRS) широко используется для оценки сельскохозяйственной продукции, продуктов питания, медицинских образцов и фармацевтической продукции, поскольку она быстрая и неразрушающая. Таким образом, NIRS может точно соответствовать требованиям эффективного измерения ТКМ, и неудивительно, что NIRS применяется для качественной идентификации и количественного определения соединений в ТКМ.

В этом исследовании содержание шести эффективных компонентов, в том числеэхинакозид, вербаскозид, маннит, сахароза, глюкоза и фруктозав 116 партиях образцов C. Tubeulosa, собранных в префектуре Хотан в Синьцзяне в 2013–2015 гг., впервые были определены методом ВЭЖХ. Впоследствии калибровочные модели этих шести компонентов были созданы с помощью метода частичной регрессии наименьших квадратов (PLSR). Затем эти модели были проверены с использованием коэффициентов корреляции и ошибок прогнозирования в калибровочных наборах. Результаты показали, что разработанный метод может быть использован как надежный метод количественного анализа C. Tubeulosa.

2. Результаты

2.1. ВЭЖХ-анализ

Содержаниеэхинакозид и вербаскозидбыли определены с помощью четко определенного в литературе метода ВЭЖХ-УФ, а четыре углевода (маннит, сахароза, глюкоза и фруктоза) были определены с помощью четко определенного в литературе метода ВЭЖХ-ELSD для всех 116 образцов. Методы подготовки проб и определения описаны в разделах 3.1 и 3.3. На рис. 1 представлены характеристические хроматограммы смешанных стандартов. Видно, что все шесть эффективных компонентов были разделены по базовой линии и, следовательно, могли быть оценены количественно. Метод ВЭЖХ был проверен перед тестированием образца. Основные результаты метода ВЭЖХ приведены в таблице 1. В результатах показаны благоприятная линейная зависимость (r=0,9998) и выход (98,5%) метода определения эхинакозида, тот же результат, что и для всех пяти компоненты. Таким образом, можно точно определить содержание шести эффективных компонентов. Все определенные диапазоны содержания суммированы в таблице 1.

2.2. NIRS-анализ

На рис. 2 представлены БИК-спектры (4000–10,000 см–1) образцов C. Tubeulosa. Во всех образцах наблюдались значимые пики поглощения в диапазоне от 4000 см–1 до 7500 см–1, а слабые колебания – в диапазоне от 7500 см–1 до 10 000 см–1. Дрейф базовой линии БИК-спектров произошел потому, что на образец легко влияли такие факторы, как размер частиц и цвет (рис. 2А). Чтобы в некоторой степени уменьшить влияние ненужной информации, использовалась математическая предварительная обработка спектров. Математическая предварительная обработка включала первый вывод (1-й вывод), второй вывод (2-й вывод), стандартное нормальное разнообразие (SNV) и коррекцию мультипликативного рассеяния (MSC). На рис. 2Б показан второй вывод БИК-спектров C. Tubeulosa, при этом наблюдаются значительные вариации, происходящие в трех областях: 4000–4500 см–1, 5000–5500 см–1 и 7000–7500 см–1.

2.3. Создание моделей количественной калибровки

Регрессия частичных наименьших квадратов (PLSR) является классическим методом моделирования и широко применяется в количественных моделях из-за высокого качества результатов. К преимуществам PLSR относятся его хорошие возможности прогнозирования и относительная простота. PLSR также широко применялся при создании моделей количественной калибровки ТКМ [25]. На основе предварительно обработанных NIR-спектров была создана модель количественного анализа NIR для шести эффективных компонентов C. Tubeulosa с использованием метода PLSR с данными анализа HPLC в качестве истинных значений. 116 образцов были случайным образом разделены на наборы для калибровки и проверки в соотношении 3:1. Наиболее подходящие условия для калибровки были выбраны по низкому RMSEC и высокому коэффициенту корреляции.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Выбор диапазона волн для калибровочных моделей

Выбор подходящего диапазона волн был важным шагом при построении калибровочной модели. В этом исследовании сравнивались интервальные спектры NIR 4000–7500 см–1 (рекомендованные программным обеспечением TQ Analytics) и 4000–10 000 см–1. Было замечено, что этот диапазон непригоден для калибровки в интервале между 4000 см-1 и 7500 см-1 из таблицы 2. Следовательно, в текущем исследовании все спектральные интервалы для шести химических составляющих были выбраны из интервала от 4000 до 10 000 см-1 путем сравнения характеристик RMSEC и коэффициента корреляции.

2.3.2. Выбор оптимального числа факторов для калибровочных моделей

PLSR объясняет максимальную изменчивость данных за счет уменьшения размерности данных спектров путем расчета коэффициентов. Проблема «недооснащенности» возникла из-за недостаточности информации, вызванной ограниченным числом факторов; однако выбор факторов, превышающих оптимальные значения, введенные в модель, приведет к проблеме «переоснащенности». Либо «недооснащенность», либо «переоснащенность» снизят предсказательную силу установленных моделей [22]. На рисунке 3 показана связь между RMSECV и факторами для всех шести соединений. Поэтому мы выбрали те факторы, которые соответствуют наименьшим значениям RMSECV. Оптимальный выбор факторов для калибровочных моделей приведен в таблице 3.

2.3.3. Выбор спектральной предварительной обработки для калибровочных моделей

Еще одним важным фактором, влияющим на калибровочные модели, является предварительная спектральная обработка, целью которой является уменьшение влияния рассеяния и дрейфа базовой линии, улучшение отношения сигнал/шум и устранение нерегулярных изменений. Для устранения влияния рассеяния излучения использовались методы мультипликативной коррекции рассеяния (MSC) и стандартных нормальных переменных (SNV). Для устранения эффектов дрейфа базовой линии сравнивались спектры 1-й и 2-й производных и был выбран 2-й вывод. Для достижения желаемого эффекта мы сглаживали спектры с помощью алгоритма фильтра Савицкого-Голея (SG) перед выводом, чтобы предотвратить увеличение шума. В таблице 3 представлена ​​информация о спектральной предварительной обработке и ее результатах для калибровочных моделей.

2.4. Оценка существующих моделей

Хорошая калибровочная модель NIRS должна иметь низкие значения RMSEC и RMSEP, а также высокий коэффициент корреляции (r) и небольшие различия между RMSEC и RMSEP. Калибровочные модели шести выбранных соединений были созданы в соответствии с процедурами, упомянутыми выше (таблица 3). Значения RMSEC и r для калибровочного набора эхинакозида составляли 27,6 и 0,9808 соответственно. Параметры производительности других моделей химических соединений перечислены в таблице 3, из которой мы можем сделать вывод, что установленные модели дают удовлетворительные результаты прогнозирования и могут использоваться для быстрого количественного анализа C. Tubeulosa. Диаграммы рассеяния шести химических соединений показаны на рисунке 4, чтобы сделать калибровочные модели более наглядными и наблюдаемыми визуально. Как показано на рисунке 4, между прогнозируемыми и измеренными значениями возникли незначительные различия, поскольку большинство точек было распределено вокруг регрессионной кривой с уравнением как y=x. Таким образом, на рисунке 4 наблюдаются отличные прогнозные характеристики.

3. Материалы и методы.

3.1. Подготовка проб

Сто шестнадцать образцов C. Tubeulosa были собраны в префектуре Хотан Синьцзянского автономного района в период с 2013 по 2015 год. Все образцы были культивированы, но они были собраны на разных стадиях роста. Свежая масса образцов колебалась от 20 г до 1000 г. После сушки на солнце высушенные образцы измельчали ​​и просеивали через сито 60-.

3.2. Сбор данных NIR-спектроскопии

БИК-спектры образцов были собраны с интервалом 8 см-1 в спектральной области 4000–10 000 см-1 с помощью системы Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Мэдисон, Висконсин, США), оснащенной портативный волоконно-оптический адаптер отражения. Каждый спектр был получен путем усреднения 64 сканирований. Всем образцам давали возможность уравновеситься до комнатной температуры (25 ◦C) перед сканированием БИК-спектров, чтобы гарантировать, что образцы анализировались при одинаковой температуре. Влажность в лаборатории поддерживалась на уровне окружающей среды.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНШ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ФУНКЦИИ ПОЧЕК PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. Сбор данных ВЭЖХ

3.3.1. Подготовка к экстракции

Один грамм порошка C. Tubeulosa экстрагировали 50 мл 50% метанола в конической колбе с помощью ультразвука (500 Вт, 40 кГц) в течение 30 минут. Экстракт хранили при температуре 4 ◦С. Супернатант экстракта фильтровали для получения образца для анализа ВЭЖХ.

3.3.2. Одновременное определение эхинакозида и вербаскозида с помощью ВЭЖХ-УФ

Жидкостный хроматографический анализ проводился на системе UHPLC Shimadzu (Shimadzu, Киото, Япония), состоящей из двух блоков подачи растворителя LC-20ADXR, насоса LC-20AD, автоматического устройства SIL-20ACXR. пробоотборник, колоночная печь CTO-20AC, детектор SPD-M20A DAD, дегазатор DGU-20A3R и контроллер CBM-20A.

Колонку Grace Prevail Carbodrive ES (150 × 2,1 мм, 2,7 мм), используемую для хроматографического разделения, поддерживали при 35 ◦C. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила (А) и 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (В) и подавалась по градиентной программе следующим образом: 0–7 мин, линейный градиент 10–20%. А; 7–15 мин, 20% А; 15–20 мин – линейный градиент 20–10 % А. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,4 мл/мин. УФ-мониторинг проводили при длине волны 330 нм.

3.3.3. Одновременное определение маннита, сахарозы, глюкозы и фруктозы с помощью ВЭЖХ-ЭЛСД

ВЭЖХ выполняли на системе ЖХ Agilent серии 1100 (Пало-Альто, Калифорния, США), состоящей из дегазатора G1322A, четвертичного насоса G1311A, автосамплера G1311A, контроллера температуры колонки G1316A и детектора G1315B DAD.

Колонку Sigma Prevail Carbodrive ES (4,6 × 250 мм, 5 мкм) использовали для хроматографического разделения и поддерживали температуру колонки 25 ◦C. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды (77:23, по объему) и подавалась изократически со скоростью потока 0,7 мл/мин. Сточные воды контролировались с помощью детектора испарительного светорассеяния (ELSD) с параметрами по умолчанию.

3.4. Обработка данных

TQ Analyst (версия 8.0, Thermo Scientific, Мэдисон, Висконсин, США) использовался для разделения наборов калибровки и проверки, математической предварительной обработки спектров, создания моделей калибровки и других вычислений. . Для изготовления фигурок использовался Origin (версия 9.1).

4. Выводы

В данном исследовании мы предложили быстрый и неразрушающий метод одновременного анализаэхинакозид, вербаскозид, маннит, сахароза, глюкоза и фруктозау C. Tubeulosa по данным NIRS. Анализ значений RMSEC, коэффициента корреляции, RMSEP и Rp показал, что установленные количественные модели NIR можно использовать для точного прогнозирования содержания шести выбранных эффективных компонентов в C. Tubeulosa. По сравнению с ВЭЖХ метод NIRS, описанный в этом исследовании, может сэкономить значительную рабочую силу и время, сохраняя при этом удовлетворительные возможности количественного анализа. Таким образом, описанный здесь метод имеет потенциал для использования при контроле качества C. Tubeulosa и, таким образом, в качестве руководства для разработки технологии выращивания и обработки C. Tubeulosa.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%