Абстрактный

Интерес потребителей к продуктам косметической промышленности с эффектом осветления кожи повысил спрос на препараты, снижающие меланогенез. Ряд антимеланогенных препаратов известен своими побочными эффектами, такими как контактный дерматит, высокая токсичность и плохое проникновение через кожу. Значительные недавние исследования были сосредоточены на продуктах растительного происхождения как на альтернативах химиотерапевтическим препаратам с меньшим количеством побочных эффектов.

В настоящем исследовании мы изучили антимеланогенное действие внеклеточных везикул (ВВ), извлеченных из листвы и стеблей патогенного дендропанакса. Работая с помощью спектрофотометрических и биохимических методов, мы обнаружили, что внеклеточные везикулы листового происхождения (LEV) и внеклеточные везикулы стеблевого происхождения (SEV) снижают содержание меланина и активность тирозиназы (TYR) в зависимости от концентрации в линии клеток меланомы мыши B16BL6. Электронно-микроскопический анализ также показал, что LEV и SEV вызывают зависимое от концентрации снижение содержания меланина в клетках меланомы. По сравнению с арбутином в качестве положительного контроля LEV и SEV показали более сильный отбеливающий эффект на клетки меланомы, а отбеливающий эффект LEV был сильнее. Примечательно, что ни LEV, ни SEV не вызывали значительной цитотоксичности. Мы также изучили влияние EV растительного происхождения на экспрессию белков, связанных с тирозиназой (TRP), в клетках меланомы. LEV ингибировали экспрессию генов и белков, связанных с меланогенезом, включая фактор транскрипции, связанный с микрофтальмом (MITF), TYR, TRP-1 и TRP-2. В модели эпидермиса человека LEV ингибировали меланогенез сильнее, чем арбутин. В совокупности наши данные позволяют предположить, что лев из патогенов D. может быть новым природным веществом-кандидатом для использования в качестве антимеланогенного агента в фармацевтических препаратах.

ключевые слова:электромобили растительного происхождения; LEV иСЭВ; антимеланогенный; ТИРактивность; содержание меланина иПреимущества экстракта цистанхе

Нажмите здесь, чтобы получитьПреимущества Cistanche для отбеливания кожиидействие экстракта цистанхе

Введение

Меланин, важная часть системы пигментации волос, глаз и кожи человека, вырабатывается меланоцитами посредством процедуры, называемой меланогенезом. Аберрантное накопление меланина может привести к кожным заболеваниям, таким как веснушки, солнечные веснушки и меланодермия, а также может вызвать рак и витилиго. Таким образом, регуляция меланогенеза является жизненно важной стратегией лечения гиперпигментированных заболеваний. Например, гидрохинон, гидроксифенильное соединение, препятствующее активности TYR, используется в качестве средства для отбеливания кожи в косметической промышленности. Тем не менее, гидрохинон может вызывать побочные эффекты, такие как контактный дерматит и экзогенное потемнение кожи. Va-кислота — еще один синтетический агент, ингибирующий активность TYR, но его применение связано с высокой частотой возникновения отека или раздражения.

Растет интерес к выявлению альтернативных препаратов из природных источников против меланогенеза, учитывая ограничения существующих химических соединений, что отражает тот факт, что косметические продукты, изготовленные из растений и трав, имеют тенденцию быть более мягкими, более биоразлагаемыми и демонстрируют более низкую токсичность, чем синтетические. соединения. Было показано, что экстракты листьев дендробиума ингибируют выработку меланина, взаимодействуя непосредственно с внутриклеточной активацией TYR и экспрессией ферментов, участвующих в биосинтезе меланина. Аналогичным образом экстракт листьев Croton officinalis подавлял содержание меланина и клеточную активность TYR, ингибируя фактор транскрипции, связанный с меланогенезом (MITF) и меланогенные ферменты. Кроме того, листья шелковицы оказывали ингибирующее действие на активность TYR и образование меланина в клетках мелан-А. P-кумаровая кислота из листьев женьшеня была идентифицирована как основной ингибитор TYR.

Херба Цистанхе

Несмотря на то, что в лекарственных косметических препаратах используется широкий спектр растительных соединений, их низкая растворимость, низкое сродство к мишеням и умеренное осветляющее действие препятствуют прогрессу в улучшении терапевтических эффектов растительной косметики. Это мотивировало поиск новых и прогрессивных методов повышения эффективности лекарственных и биоактивных соединений и повышения эффективности их доставки в кожу. Например, был успешно разработан ряд технологий нанодоставки, в том числе нано-лавли для эффективного ухода за кожей, нано-кверцетин для замедления повреждения клеток, вызванного ультрафиолетовым (УФ) излучением, нано-фуллерены для регенерации коллагена и предотвращения старения кожи. , нано-лютеолин для поддержания антиоксидантной активности и нано-ресвератрол для защиты кожи от УФ-излучения.

В настоящем исследовании мы концентрируемся на роли внеклеточных везикул (EV) растительного происхождения. Недавние исследования показали, что EV растительного происхождения имеют структуру, аналогичную структуре изолированных экзосом млекопитающих, и действуют как внеклеточные мессенджеры, опосредующие межклеточную коммуникацию. Кроме того, эти везикулы способны транслоцировать мРНК, микроРНК (миРНК), биоактивные липиды и белки в клетки животных.

Тем временем мы изучили ингибирующее действие ЭВ, полученных из листьев и стеблей больных бобовых, на меланогенез. Мы охарактеризовали размер и свойства внеклеточных везикул, полученных из листьев (LEV), и внеклеточных везикул, полученных из стеблей (SEV), извлеченных из листьев и стеблей больных бобовых, и показали, что эти EV легко поглощаются клетками меланомы и не были цитотоксическими. Чтобы продемонстрировать антимеланогенные эффекты LEV и SUV, мы исследовали содержание меланина и активность TYR в клетках меланомы. Далее мы оценили влияние электромобилей на сложный процесс синтеза меланина, отслеживая изменения уровней различных белков и ферментов.

Гормон, стабилизирующий альфа-меланоциты (-MSH), связывается с рецептором меланокортина 1 (MC1R) на поверхности клетки и активирует аденилатциклазу, что приводит к повышению внутриклеточного уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). цАМФ опосредуется через цАМФ-зависимую протеинкиназу А, что приводит к фосфорилированию белка, связывающего элемент ответа цАМФ (CREB). Активированный CREB индуцирует MITF, который экспрессируется в меланоцитах и ​​играет ключевую роль в дифференцировке и развитии меланоцитов. -TRP1 необходим для правильного переноса TYR на синтез меланина, а TRP2 играет важную роль в каталитической активности TRP на ранних стадиях синтеза меланина. Эти три взаимодействуют в клетках меланомы (дополнительная рис. 1).

Мы обнаружили сниженную экспрессию MITF в клетках меланомы, обработанных LEV, с последующим снижением экспрессии TYR, TRP-1 и TRP-2, и подтвердили с помощью электронной микроскопии, что синтез меланина был снижен в этих клетках на ультраструктурный уровень. Мы также подтвердили антимеланогенный эффект LEV с использованием реконструированной модели эпидермиса человека. Для количественной оценки ингибирующего действия ЛЕВ на клеточный синтез меланина готовили стандартные растворы из тканей и измеряли содержание меланина с помощью колориметра. Пятна меланина были уменьшены в срезах тканей, окрашенных по Фонтана-Массону. LEV ингибировали выработку меланина более эффективно, чем ингибитор TYR арбутин, который использовали в качестве положительного контроля.

Таким образом, эти результаты показывают, что использование электромобилей, полученных из натуральных веществ, для лечения гиперпигментации является возможным будущим подходом для фармацевтической промышленности. Кроме того, ожидается, что электромобили растительного происхождения, обладающие преимуществами небольшого размера, низкой токсичности, высокой усвояемости и экологической безопасности, станут следующим поколением терапевтических систем доставки для лечения других заболеваний. Примечательно, что электромобили растительного происхождения обладают хорошим антимеланогенным действием на реконструированную ткань кожи человека (аналогично человеческому эпидермису), что создает основу для будущих клинических испытаний.

Цистанхе добавка

Материалы и методы

1. Выделение ЛЕВов и внедорожников D. morbifera.

Свежие листья и стебли были собраны с острова Погэ, Гуандао-гун и Чолла-Намдо. ЭВ выделяли из 50 г листьев и стебля соответственно путем измельчения с помощью экстрактора и пропускания полученного сока через фильтровальную бумагу и центрифугирования при 10,000 × g в течение 10 мин. Крупный мусор удаляли путем фильтрации супернатанта через мембрану 0,22 мкм с последующим центрифугированием с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra-4 PL 100 K (Merck Millipore, Дармштадт, Германия) для концентрирования ЭВ путем центрифугирования образцов при 5000× г в течение 10 мин при 4 град. После центрифугирования концентрацию белка EV определяли с использованием набора для анализа белка бисхинолиновой кислоты (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

2. Размерная характеристика изолированных электромобилей

Гидродинамический размер изолированных электромобилей измеряли с помощью динамического рассеяния света (DLS), метода, используемого для определения распределения мелких частиц по размерам в суспензии с использованием системы Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Малверн, Великобритания). Собранные электромобили помещались в камеру с постоянной температурой 20 градусов. Распределение частиц по размерам и среднее значение z, используемые для определения гидродинамического распределения частиц по размерам, определяли путем измерения автокорреляционной функции интенсивности рассеяния. Изолированные ЭВ разбавляли пузырьковой водой без везикул, а затем подвергали анализу слежения за наночастицами (NTA) (Nanosight; с использованием лазера с длиной волны 488 нм при 25 градусах).

3. Трансмиссионная электронная микроскопия электромобилей.

5 мкл раствора образца наносили на углеродную пленку с медным сетчатым покрытием для анализа с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). После адсорбции образца в течение 1 мин сетки промывали каплей чистой воды, а затем отрицательно окрашивали 1%-ным уранилацетатом в течение 1 мин. Избыток красителя удаляли фильтровальной бумагой и сетки сушили на воздухе. Образцы были визуализированы в фокусе между 0.8 - 1.5 мкм с использованием просвечивающего электронного микроскопа JEM- 1400 Plus (JEOL Ltd., Токио, Япония), оснащенного пушкой Lab6, работающей на 120 кВ. . Изображения записывали с помощью CMOS-камеры UltraScan OneView (Gatan, Плезантон, Калифорния, США).

Цистанхе трубчатая

4. Подготовка липосом

Смеси липосом готовили с использованием соотношения 95:5 (моль/моль) DMPC (1,2-стеароил-sn-глицерин-3-фосфохолин) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) с DSPE-mPEG (1,2-стеароил-sn-глицерин-3-фосфоэтаноламин-[метокси(полиэтиленгликоль)- 2000] (Avanti полярные липиды) для приготовления смесей липосом в качестве липидных мембран. гидрофобный флуоресцентный краситель 1,1-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлорат (DiI, Invitrogen, Waltham, MA, USA) смешивали с EV, 725,49 мкг DMPC, 151,64 мкг DSPE-PEG. и 15 мкг DiI. После выпаривания органического растворителя мембрану, содержащую смесь липидов и DiI, гидратировали 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), затем с помощью экструдера (Avanti Polar) готовили липосомы размером 100 нм. Липиды).

5. Культура клеток и анализ жизнеспособности

Клетки меланомы B16BL6 культивировали в альфа-минимальной основной среде (альфа-MEM), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (Rocky Mountain Biologicals, Missoula, MT, USA) и 1% пенициллина/стрептомицина (Lonza, Базель, Швейцария) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) в культуре. Клетки инкубировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2. 100 мкл клеток меланомы B16BL6 инокулировали в 96-луночные планшеты (5 × 104 клеток/лунку) для анализа жизнеспособности клеток. После инкубации в течение 24 ч клетки обрабатывали LEV и SEV в концентрациях 1, 5 и 10 мкг/мл соответственно в течение 24 ч. Концентрации липосом и арбутина составляли 10 мкг/мл и 70 мкг/мл соответственно для всех экспериментов. Затем в каждую лунку добавляли 10 мкл реагента EZ-Cytox (Daeil Lab Service, Сеул, Корея). Планшеты инкубировали в течение 1 часа. Затем планшеты осторожно встряхивали и затем измеряли оптическую плотность при 450 нм с использованием ферментного маркера (BioTek, Winooski, VT, USA).

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

[1] Мередит П., Сарна Т. Физические и химические свойства эумеланина. Пигментные клетки Res. 2006;19(6):572–594.

[2] ЧП Граймс. Мелазма: этиологические и терапевтические соображения. Арка Дерматол. 1995;131(12):1453–1457.

[3] Тодд М.М., Раллис Т.М., Гервелс Дж.В. и др. Сравнение 3 лазеров и жидкого азота при лечении солнечных лентиго: рандомизированное контролируемое сравнительное исследование. Арка Дерматол. 2000;136(7):841–846.

[4] Кавалек А.З., Спенсер Дж.М., Фелпс Р.Г. Комбинированный эксимерный лазер и местный такролимус для лечения витилиго: пилотное исследование. Дерматол Хирург. 2004;30(2):130–135.

[5] Bastiens M, Ter Huurne J, Gruis N, et al. Ген меланокортин-1-рецептора является основным геном веснушек. Хум Мол Жене. 2001;10(16):1701–1708.

[6] Пиллаяр Т., Маникам М., Юнг Ш. Подавление меланогенеза: открытие лекарств и терапевтические возможности. Наркотиков Дисков Сегодня. 2017;22(2):282–298.

[7] Hu ZM, Zhou Q, Lei TC, et al. Влияние гидрохинона и его производных глюкозидов на меланогенез и антиоксидантное действие: биобезопасность в качестве средств для отбеливания кожи. J Дерматол Sci. 2009;55(3):179–184.

[8] Westerhof W, Kooyers T. Гидрохинон и его аналоги в дерматологии – потенциальный риск для здоровья. J Космет Дерматол. 2005;4(2):55–59.

[9] Пикардо М., Каррера М. Новые и экспериментальные методы лечения хлоазмы и другого гипомеланоза. Дерматол клин. 2007;25(3):353–362.

[10] Шин Дж. В., Парк KC. Текущее клиническое использование депигментирующих агентов. Дерматол Син. 2014;32(4):205–210.

[11] Чайта Э., Ламбринидис Г., Хеймониди С. и др. Антимеланогенные свойства греческих растений. Новый депигментирующий агент из древесины Morus alba. Молекулы. 2017;22(4):1–14.

[12] Парк С.А., Парк Дж., Парк С.И. и др. Клеточная антиоксидантная активность и отбеливающие эффекты экстрактов листьев Dendropanax morbifera. Microbiol Biotechnol Lett. 2013;41(4):407–415.

[13] Чататикун М., Ямаути Т., Ямасаки К. и др. Антимеланогенный эффект листьев Croton roxburghii и Croton sublyratus в стимулированных -MSH клетках B16F10. J Tradit Комплемент Мед. 2019;9(1):66–72.

[14] Lee SH, Choi SY, Kim H, et al. Малберозид F, выделенный из листьев Morus alba, ингибирует биосинтез меланина. Биол Фарм Бык. 2002;25(8):1045–1048.

[15] Lim JY, Ishiguro K, Kubo I. P-кумаровая кислота, ингибирующая тирозиназу, из листьев женьшеня. Фитотер Рез. 1999;13(5):371–375.

[16] Chanchal D, Swarnlata S. Новые подходы в растительной косметике. J Космет Дерматол. 2008;7(2):89–95.

[17] Ганесан П., Чой Д.К. Современное применение нанокосмецевтиков на основе фитосоединений для красоты и терапии кожи. Int J Наномедицина. 2016;11 (11):1987–2007.

[18] Такахаши М., Китамото Д., Асикин Ю. и др. Липосомы, содержащие экстракт геля листьев алоэ вера, значительно усиливают пролиферацию и синтез коллагена в клеточных линиях кожи человека. J Oleo Sci. 2009;58(12):643–650.

[19] Бозе С., Ду Ю., Тахистов П. и др. Оптимизация состава и местная доставка кверцетина из твердых наносистем на основе липидов. Инт Дж Фарм. 2013;441(30):56–66.

[20] Нган С.Л., Басри М., Трипати М. и соавт. Вмешательство наноэмульсии, интегрированной с фуллеренами, в регенерацию структуры и коллагена против старения кожи. Eur J Pharm Sci. 2015;70(5):22–28.

[21] Митри К., Шегокар Р., Гохла С. и др. Липидные наноносители для кожной доставки лютеина: подготовка, характеристика, стабильность и эффективность. Инт Дж Фарм. 2011; 414 (1–2): 267–275.

[22] Юшкайте В., Раманаускене К., Бриедис В. Разработка и разработка оптимизированных микроэмульсий для кожной доставки ресвератрола. Комплемент на основе Evid Alternat Med. 2015;2015:1–10.

[23] Чжан М., Вьеннуа Э., Сюй С. и др. Съедобные наночастицы растительного происхождения как новый терапевтический подход к болезням. Тканевые барьеры. 2016;4(2):1–9.

[24] Criton M, Le Mellay-Hamon V. Аналоги N-гидрокси-N'-фенилтиомочевины и N-гидрокси-N'-фенилмочевины в качестве ингибиторов образования тирозиназы и меланина. Bioorg Med Chem Lett. 2008;18 (12):3607–3610.

[25] Кобаяши Т., Слушание VJ. Прямое взаимодействие тирозиназы с Tyrp1 с образованием гетеродимерных комплексов in vivo. Дж. Клеточные науки. 2007;120(24):4261–4268.

[26] Д'Мелло С., Финлей Г., Багули Б. и др. Сигнальные пути в меланогенезе. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.

[27] Fang D, Tsuji Y, Setaluri V. Избирательное подавление гена семейства тирозиназ TYRP1 путем ингибирования активности фактора транскрипции меланоцитов, MITF. Нуклеиновые Кислоты Res. 2002;30(14):3096–3106.

[28] О М.Дж., Хамид М.А., Нгадиран С. и др. Экстракт Ficus deltoidea (Mascotek) проявлял антимеланогенную активность, предотвращая активность тирозиназы in vitro и подавляя экспрессию гена тирозиназы в клетках меланомы B16F1. Арка Дерматол Рез. 2011;303(3):161–170.

[29] Jang EJ, Shin Y, Park HJ и др. Антимеланогенная активность фитосфингозина посредством модуляции сигнального пути фактора транскрипции, связанного с микрофтальмом. J Дерматол Sci. 2017;87(1):19–28.

[30] Тойофуку К., Вада И., Валенсия Дж. К. и др. Кожно-глазный альбинизм типов 1 и 3 являются заболеваниями задержки ER: мутация тирозиназы или Tyrp1 может влиять на процессинг как мутантных, так и белков дикого типа. Фасеб Дж. 2001; 15: 2149–2161.

[31] Сюэ Л., Ли Ю., Чжао Б. и др. TRP-2 опосредует пигментацию окраски шерсти овец. Mol Med Rep. 2018;17:5869–5877.

[32] Mu J, Zhuang X, Wang Q и др. Межвидовая связь между клетками-хозяевами кишечника растений и мышей посредством экзосомоподобных наночастиц, полученных из съедобных растений. Мол Нутр Фуд Рез. 2014;58(7):1561–1573.