Идентификация и функциональный анализ бифавона как нового ингибитора транзиторного рецепторного потенциала ваниллоид-4-зависимых атерогенных процессов

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comзнать больше

Мазен О. Альхарби, Бидиша Датта, Ришов Госвами, Швета Шарма, Кайе. Лей и Шейк О. Рахаман

Атеросклероз, прогрессирующее воспалительное заболевание крупных артерий, вносит основной вклад в растущее бремя смертности и заболеваемости, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, во всем мире1. Основным инициирующим событием, которое приводит к атеросклерозу, является задержка модифицированных частиц липопротеинов низкой плотности (оксЛПНП) в субэндотелиальных интимных пространствах аорты, прежде всего в точках артериальных ветвей2. Во время раннего атерогенеза, после эндотелиальной дисфункции, моноциты циркулирующей крови трансмигрируют в области интимы и дифференцируются в тканевые макрофаги3. В интимных пространствах аорты связывание и поглощение oxLDL макрофагами с помощью рецепторов-мусорщиков, таких как SRA и CD36, создает атеровоспалительную петлю с прямой связью, приводящую к развитию насыщенных липидами пенистых клеток, что является критическим процессом при атеросклерозе 2-8. Каскады воспалительных явлений, спровоцированных пенистыми клетками, приводят к формированию ранней жировой полоски и, в конечном итоге, к появлению прогрессирующих атеросклеротических поражений, характеризующихся наличием фиброзной капсулы, кальцифицированной ткани, иммунных клеток, белков матрикса и липидов2-10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) подсемейства TRPV, неселективный, полимодальный катионный канал, проницаемый для Са2+, повсеместно экспрессируется в различных типах клеток, включая макрофаги11-24. Ранее известный как осмосенсор, теперь известно, что TRPV4 реагирует на разнообразные биохимические и биомеханические стимулы, включая тепло, жесткость матрикса, осмолярность, факторы роста, рН и 4 форболовых эфира11–24. Сообщается, что TRPV4 опосредует несколько физиологических функций, таких как болевые ощущения при воспалении и невропатиях18,22,23, дифференцировку и миграцию миофибробластов17,25,26 и дифференцировку остеокластов в кости27. Мутации TRPV4 связаны с несколькими каналопатиями28–31. Недавние исследования, проведенные нашей группой и другими исследователями, выявили возможную роль этого канала в бесчисленном множестве патологических состояний, таких как повреждения легких22,32, образование пенистых клеток14,16, фиброз тканей17,33, реакция на инородное тело13 и рак34,35. Ранее была показана атеропротективная роль TRPV4, при этом было показано, что индуцированная химическим агонистом функция TRPV4 в эндотелиальных клетках связана с активацией eNOS и ингибированием адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам36. Напротив, дефицит функций TRPV4 был связан с многочисленными атеровоспалительными реакциями, включая дисфункцию эндотелия, снижение образования пенистых клеток макрофагов и сосудистые заболевания14,16,37-39. Наша лаборатория недавно определила проатерогенную роль TRPV4, посредством чего он регулирует индуцированное oxLDL образование пенистых клеток макрофагов. Механически мы показали, что TRPV4 влияет на поглощение, но не на связывание oxLDL в макрофагах, 36-независимо от CD14. В другом исследовании мы сообщили о 4-зависимом от TRPV обострении индуцированного oxLDL образования пенистых клеток в присутствии липополисахарида и увеличения жесткости матрикса, тем самым установив связь между механосенсорным восприятием и риском атеросклероза16. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что TRPV4 является привлекательной мишенью при атеросклерозе и других заболеваниях, что стимулирует открытие низкомолекулярных ингибиторов TRPV4, которые могут быть преобразованы в клинически эффективные терапевтические средства. Использование природных соединений в терапии приобрело известность, в первую очередь из-за потребности в экономически эффективных и биосовместимых соединениях по сравнению с существующими в настоящее время синтетическими лекарствами. Природные соединения, такие какфлавоноидыалкалоиды,полифенолыи куркуминоиды влияют на сердечно-сосудистые заболевания с помощью различных механизмов, таких как ингибированиепровоспалительныйсигналы, сенсибилизация к инсулину и улучшение профилей липидов в крови путем нацеливания на пути AMPK, COX1/2, eNOS и Nrf240–45. Недавние исследования нескольких групп выявили два флавоноида, берберин и апигенин, как потенциальные модуляторы активности TRPV446,47. Мы разработали и использовали полувысокопроизводительный метод скрининга для выявления потенциальных антагонистов TRPV4 из библиотеки природных соединений с использованием анализа притока Ca2 plus на основе флуорометрического считывателя изображений (FLIPR). Здесь мы сообщаем об идентификации и функциональном анализе Linkedin, флавона, в качестве нового ингибитора TRPV4-зависимых атерогенных процессов в макрофагах, тем самым закладывая основу для дальнейших исследований этого природного соединения в качестве естественного антиатеросклеротического небольшого молекулярное соединение. Сообщается, что Linkedin проявляет нейропротекторное,антиканцерогенный, а такжепротивовоспалительное средствороли48,49. Мы сообщаем о механизме действия Linkedin против TRPV4 в условиях образования пенистых клеток макрофагов с использованием многочисленных биохимических и клеточных анализов.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Материалы и методы Животные и клеточные культуры

Мы приобрели конгенных мышей C57BL/6 дикого типа (WT) от Charles River Laboratories (Уилмингтон, Массачусетс, США). Руководящие принципы Комитета по уходу и использованию животных Мэрилендского университета соблюдались во всех экспериментах на животных, и авторы соблюдали руководящие принципы ARRIVE. Для выделения мышиных резидентных макрофагов (MRM), индуцированных тиогликолатом, перитонеальный лаваж собирали после 4 дней внутрибрюшинной инъекции тиогликолата, а клетки поддерживали в 10-процентной фетальной бычьей сыворотке (FBS), содержащей DMEM7,14,16. Линию мышиных макрофагов (RAW264.7) и кожные фибробласты человека (HDF) приобретали у ATCC (Манассас, Вирджиния) и культивировали, соответственно, с DMEM или MEM (Gibco, Waltham, MA). Макрофаги костного мозга мышей (BMDM) собирали у мышей от 6- до 7-недельных мышей, как описано ранее14,50,51. Вкратце, бедренные кости мышей WT и TRPV4 KO собирали и костный мозг бедренных костей промывали полной средой DMEM с 10% FBS. Суспензированные клетки костного мозга фильтровали через сито с размером ячеек 70 мкм (BD bioscience), центрифугировали и выдерживали в среде DMEM с добавлением M-CSF (25 нг/мл) в течение 7–8 дней при 37°, чтобы обеспечить дифференцировку в макрофаги.

Реагенты

Linkedin и GSK1016790A (GSK101) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури), а набор для анализа FLIPR Calcium 6 был получен у Molecular Device (Саннивейл, Калифорния). Нативные ЛПНП человека (ЛПОНП) были приобретены у Stemcell Technologies (Ванкувер, Канада). Мы инкубировали ЛНП с 5 мкМ CuSO4 в течение 12 часов при 37 градусах, чтобы получить окисленные медью ЛПНП (оксЛНП)7,14,16. Меченый флуоресцентным красителем DiI-oxLDL был приобретен у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния), а MCSF у R&D (Миннеаполис, Миннесота). Антитела для анализа FACS представляли собой: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 и TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-конъюгированные вторичные антитела были получены от R&D (Миннеаполис, Миннесота), а PE-конъюгированные изотипические контроли были получены от BD (Franklin Lake, NJ). Для количественной полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) мы использовали набор RNeasy от QIAGEN (Редвуд-Сити, Калифорния). Все праймеры были приобретены у Bio-Rad (Hercules, CA). Среды для культивирования клеток, продукты, относящиеся к клеточным культурам, и реагенты для вестерн-блоттинга были получены от Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Цистанхе против усталости

Полувысокопроизводительный скрининг

Мы провели полувысокопроизводительный скрининг антагонистов Trpv4 из библиотеки из 2000 природных соединений (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) с использованием анализа притока кальция на основе флуорометрического считывателя изображений (FLIPR)14,17. Мы идентифицировали гинкгетин (GGT) как новый антагонист TRPV4. Первичный и вторичный скрининг был проведен с RAW264.7, HDF и BMDM для оценки способности Linkedin и других кандидатов ингибировать TRPV 4-вызываемый Ca2 плюс приток14,17. В качестве контроля мы использовали A23187, ионофор кальция, BMDM с нулевым TRPV4 и GSK219, селективный антагонист TRPV417. После вторичного скрининга мы идентифицировали шесть соединений, демонстрирующих более чем трехкратное ингибирование TRPV4-опосредованного притока Са2 плюс по сравнению с контрольным носителем. Linkedin был идентифицирован как наиболее мощный ингибитор активности TRPV4. BMDM (5×104 клеток/лунку) высевали в покрытые коллагеном (10 мкг/мл) 96-лунки с прозрачным дном и черным планшетом и инкубировали при 37°, 5% CO2. В день эксперимента клетки нагружали красителем кальция 6 в HBSS, 20 мМ HEPES, 2,5 мМ пробенецидом и инкубировали в течение 45 мин при 37°С. После инкубации в каждую лунку добавляли соединения из библиотеки до конечной концентрации 2 мкМ. Планшеты инкубировали еще 45 мин при 37°С. Приток Са2 плюс индуцировали добавлением 10 нМ агониста TRPV4 GSK1016790A в клетки, предварительно обработанные носителем или соединением, и регистрировали путем измерения ΔF/F (Макс-Мин), как описано ранее17. Данные представлены в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ).

Иммуноблоты

Вызванные тиогликолатом перитонеальные макрофаги высевали в 10% FBS, содержащую DMEM, и инкубировали в течение ночи. Неприлипшие клетки отмывали и добавляли в планшет 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), содержащий DMEM, и инкубировали в течение 3 ч перед обработкой Linkedin. Для определения экспрессии белков CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 и GAPDH готовили лизаты цельных клеток из клеток, обработанных в течение ночи линкедином (1 и 5 мкМ) или носителем в присутствии или в отсутствие оксЛНП (25 мкг/мл). ). Для определения уровней экспрессии p-JNK и JNK, запускаемых LPS, клетки предварительно обрабатывали Linkedin (5 и 10 мкМ) в течение 3 часов, а затем стимулировали LPS E. coli в течение 30 минут. Лизаты цельных клеток готовили из дважды промытых клеток (охлажденный льдом PBS) с использованием буфера RIPA с добавлением смеси ингибиторов протеазы (Thermo Scientific, MA). Блоты исследовали кроличьим анти-TRPV4 (Alomone Lab, Иерусалим, Израиль), анти-мышиным CD36 (R&D, Миннеаполис, Миннесота), кроличьим анти-TLR4, кроличьим анти-TLR6, кроличьим анти-JNK и кроличьим анти-p-рецептором. Первичные антитела JNK (Cell Signaling, Дэнверс, Массачусетс), а затем вторичные антитела против кроличьего и мышиного HRP, конъюгированные с HRP (R&D, Миннеаполис, Миннесота). Блоты удаляли и повторно исследовали с помощью анти-GAPDH IgG (1:2000; Санта-Крус, Даллас, Техас) для контроля загрузки.

Образование пенных ячеек.MRM, активируемые тиогликолатом, высевали на покровные стекла в 12-луночный планшет с DMEM, 10% FBS и инкубировали при 37°С, 5% CO2 в течение 2 часов. К клеткам добавляли ГГТ (1 или 10 мкМ), через 3 ч инкубации добавляли оксЛНП (50 мкг/мл) и инкубировали культуры в течение ночи при 37°С. Нативный ЛПНП (50 мкг/мл) добавляли в лунки контрольной группы и инкубировали в течение ночи. Клетки фиксировали в 4-процентном параформальдегиде с последующим окрашиванием Oil Red O для количественной оценки образования пенистых клеток.

Трансдукция аденовирусного вектора.Мы собрали аденовирусные конструкции для экспрессии Ad(RGD)-мышиного TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 БОЕ/мл) и пустой вектор аденовируса Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 БОЕ/мл) из Vector Biolabs, Малверн, Пенсильвания. Мы использовали 1×108 БОЕ/мл для всех экспериментов. Для исследований образования пенистых клеток мышиные перитонеальные макрофаги инкубировали с Ade-TRPV4 или Ade-Vec в среде DMEM в течение 72 ч перед добавлением oxLDL для образования пенистых клеток макрофагов.

Связывание и поглощение ox-LDL.Для оценки связывания перитонеальные макрофаги обрабатывали двумя дозами (1 или 10 мкМ) Linkedin или носителя в течение 3 часов и инкубировали с DiI-oxLDL при 4 градусах в течение одного часа. После предварительной обработки Linkedin или носителем клетки инкубировали с DiI-oxLDL при 37°С в течение 30 мин для оценки поглощения. Изображения были получены с помощью флуоресцентной микроскопии (63x), а изображение J использовалось для количественной оценки результатов.

Проточная цитометрия.Вызванные тиогликолатом перитонеальные макрофаги культивировали в DMEM, 10% FBS в течение 24 часов. Неприлипшие клетки отмывали, добавляли среду без сыворотки и клетки инкубировали в течение 2 часов с последующим добавлением 5 мкМ GGT или носителя и продолжали инкубацию в течение 3 часов. Обработанные клетки соскребали с планшета и ресуспендировали в PBS, 2% BSA. Клетки инкубировали с первичными антителами в течение 45 мин, а затем инкубировали в течение 30 мин с PE-конъюгированными вторичными антителами. Для получения данных использовали проточный цитометр FACSCantoII (BD Bioscience, Онтарио, Канада). Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения FlowJo.

кРВ-ПЦР.Индуцированные тиогликолатом макрофаги обрабатывали 5 мкМ Linkedin или носителем в течение 3 часов; К клеткам, обработанным носителем или Linkedin, добавляли 25 мкг/мл oxLDL и продолжали инкубацию в течение ночи. Набор RNeasy Micro Kit (#74004) от QIAGEN использовали для выделения тотальной РНК, а универсальный набор SYBR Green One-Step от Bio-Rad использовали для обратной транскрипции РНК. Для сбора данных использовали термоциклер C1000 Touch (Bio-Rad). Экспрессию гена определяли как количество ген-специфичной мРНК по отношению к мРНК GAPDH с использованием сравнительного метода CT, описанного в бюллетене пользователя системы qRT-PCR Bio-Rad.

Статистический анализ.Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех биологических повторов. Использовалась программа GraphPad Prism 7.0, и расчеты проводились с использованием t-критерия Стьюдента для двух групп или однофакторного дисперсионного анализа для нескольких групп.

Этическое одобрение.Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) и были одобрены Комитетом по обзору Университета Мэриленд-Колледж-Парк.

Полученные результаты in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>тройной; п<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Рисунок 1. Идентификация на основе полувысокопроизводительного скрининга Linkedin как нового ингибитора TRPV4 из библиотеки природных соединений. (A) Блок-схема, показывающая рабочий процесс, приводящий к идентификации гинкгетина как потенциального ингибитора TRPV4 из библиотеки из 2000 природных соединений. (B) Репрезентативная запись FlexStation 3, показывающая ингибирующее действие 6 природных соединений на индуцированный агонистом TRPV4 (GSK1016790A) приток Ca2 plus в BMDM, нагруженные красителем кальция 6, во время вторичного скрининга. Предварительная обработка всеми 6 соединениями показала ингибирующее действие на 4-зависимый от TRPV приток Са2 плюс по сравнению с клетками, предварительно обработанными носителем (отрицательный контроль; носитель плюс GSK1016790A (10 нМ)) или ионофором кальция (A23187, 2 мкМ). Мы использовали селективный антагонист TRPV4, GSK2193874 (10 нМ), в качестве отрицательного контроля. Все эксперименты повторяли трижды в четырехкратной повторности. RFU: относительная единица флуоресценции.

Ингибирование TRPV4 с помощью GGT отменяет образование пенистых клеток макрофагов, вызванное oxLDL.Наши предыдущие исследования показали, что TRPV4-вызванный притоком Ca2 плюс участвует в опосредованном oxLDL образовании пенистых клеток 14,16. Поэтому мы оценили возможность того, что образование пенистых клеток было ингибировано опосредованным GGT антагонизмом активности TRPV4. Мышиные перитонеальные макрофаги дикого типа инкубировали с oxLDL, чтобы вызвать образование пенистых клеток в присутствии или в отсутствие GGT, и анализировали с помощью окрашивания Oil Red O. Как и ожидалось, мы обнаружили, что образование пенистых клеток увеличилось в пять раз в макрофагах, обработанных oxLDL, по сравнению с нативными LDL (рис. 2A, B). Однако обработка макрофагов ГГТ (1 или 10 мкМ) перед стимуляцией оксЛНП значительно снижала процент пенистых клеток (рис. 2А, В). В совокупности эти данные свидетельствуют об ингибирующем влиянии GGT на образование пенистых клеток макрофагов, возможно, нацеленных на TRPV 4-вызванный притоком Ca2 плюс. Кроме того, мы сверхэкспрессировали TRPV4 в нулевых по TRPV4 макрофагах с помощью аденовирусной конструкции, а затем индуцировали образование пенистых клеток с помощью oxLDL в присутствии GGT. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия TRPV4 увеличивала образование пенистых клеток, которое было заблокировано, когда мы предварительно обрабатывали клетки GGT, что позволяет предположить, что ингибирование образования проатерогенных пенистых клеток с помощью GGT зависит от TRPV4 (рис. 2C, D).

ГГТ не блокирует базальный уровень экспрессии TRPV4 и воспалительных рецепторов.Рецептор-мусорщик CD36 играет важную роль в поглощении и связывании oxLDL и образовании пенистых клеток, критических процессах при атеросклерозе 4–7,54,55. В последнее время появляется все больше данных, свидетельствующих об участии толл-подобных рецепторов в развитии атеросклероза2,4,56. Чтобы выяснить, блокирует ли GGT образование пенистых клеток, влияя на экспрессию CD36, TLR4, TLR6 и TRPV4, мы провели иммуноблот-анализ при двух концентрациях GGT (1 или 5 мкМ). Мы обнаружили аналогичные уровни экспрессии CD36, TRPV4, TLR6 и TLR4 по сравнению с необработанным контролем (рис. 3A-D). Проточный цитометрический анализ также не выявил существенной разницы в экспрессии белков на клеточной поверхности с обработкой GGT или без нее (рис. 3E-H, I-L). Учитывая все вместе, эти результаты предполагают, что GGT блокирует образование пенистых клеток макрофагов, не ингибируя базальные уровни поверхностной экспрессии TRPV4, CD36, TLR4 и TLR6.

Рисунок 2. Ингибирование TRPV4 с помощью Linkedin устраняет индуцированное oxLDL образование пенистых клеток макрофагов. (A) Индуцированные тиогликолатом мышиные перитонеальные макрофаги обрабатывали в течение ночи 50 мкг/мл oxLDL с последующей 3-часовой преинкубацией с носителем или 1 или 10 мкМ Linkedin. Клетки обрабатывали 50 мкг/мл нативного ЛПНП (ЛПОНП) в качестве контроля. Оригинальное увеличение: 40x. (B) Количественная оценка результатов показана в (A). n=500 ячеек/условие. критерий Стьюдента; ***п<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Поглощение oxLDL, но не связывается макрофагами, подавляется ГГТ. Поскольку ранее было показано, что TRPV4 играет роль в поглощении oxLDL и образовании пенистых клеток14,16, мы оценили, вызывает ли лечение GGT нарушение связывания oxLDL на поверхности макрофагов. Перитонеальные макрофаги WT обрабатывали GGT перед инкубацией с DiI-oxLDL при 4 степени и оценивали связывание. Результаты показывают, что связывание oxLDL на поверхности макрофагов не препятствовало значительно обработке GGT (1 или 10 мкМ) по сравнению с контрольным носителем (рис. 5A-C). Установив, что GGT не ингибирует связывание oxLDL, мы затем стремились определить, было ли нарушено поглощение oxLDL макрофагами при лечении GGT. Интересно, что наши результаты показали значительное ингибирование поглощения oxLDL макрофагами в клетках, предварительно обработанных GGT, по сравнению с группой, обработанной носителем (рис. 6A, B). Учитывая все вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что ГГТ блокирует поглощение оксЛНП, но не связывается с ними в макрофагах.

GGT блокирует индуцированную oxLDL экспрессию TRPV4 в макрофагах.

Поскольку наши ранее опубликованные исследования показали, что TRPV4-вырабатывает Ca2 plus, играет роль в опосредованном oxLDL образовании пенистых клеток макрофагов14,16, мы стремились определить, блокирует ли GGT образование пенистых клеток посредством подавления индуцированной oxLDL экспрессии CD36, TLR2, TLR4, TLR6 или TRPV4. Мы обнаружили, что ночная стимуляция макрофагов oxLDL приводила к значительному повышению экспрессии белков TRPV4 по сравнению с LDL, в то время как экспрессия других рецепторов (CD36, TLR2, TLR4 и TLR6) оставалась неизменной (рис. 4A–F). Предварительная обработка клеток GGT перед стимуляцией oxLDL селективно снижала уровень экспрессии белков TRPV4 по сравнению с обработкой носителем (рис. 4A-F). В совокупности эти данные свидетельствуют об ингибирующем эффекте GGT на экспрессию белка TRPV4, который может быть частично связан с подавлением образования пенистых клеток с помощью GGT.

Рисунок 3. Лечение линкедином не изменяет общий белок или поверхностную экспрессию TRPV4, CD36 и TLR в макрофагах. (A-D) Иммуноблоты лизатов цельных клеток макрофагов после ночной обработки 1 или 5 мкМ линкедина или носителя. Репрезентативные иммуноблоты показывают экспрессию общего белка CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) и TLR4 (D) в обработанных Linkedin и необработанных клетках. Было выполнено три независимых биологических повтора и три экспериментальных повтора для каждой серии экспериментов. (E–H) Проточный цитометрический анализ макрофагов, обработанных в течение ночи 5 мкМ Linkedin или необработанных, показывает поверхностную экспрессию TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) и TLR6 (G) в необработанных и обработанных Linkedin клетках. Были проанализированы три независимых биологических повтора и 30 000 клеток на условие. (I–L) Количественный анализ результатов (E–H). Проанализировано с помощью двустороннего t-критерия с 99-процентным доверительным интервалом. Количество клеток за эксперимент, 30,000; две экспериментальные повторности.

ГГТ блокирует проатерогенную активацию JNK2 и воспаление в макрофагах. Опубликованные отчеты нашей и других лабораторий показали, что активация JNK2 играет решающую роль в формировании пенистых клеток и атеросклерозе7,57. Чтобы определить, может ли GGT ингибировать активацию JNK1/2, макрофаги обрабатывали GGT с последующей стимуляцией LPS или oxLDL. Результаты иммуноблоттинга показали, что обработка GGT значительно подавляла индуцированное oxLDL или LPS фосфорилирование JNK1/2 по сравнению с необработанным или обработанным нативным LDL контролем (рис. 7A-D). Было показано, что активация JNK в макрофагах индуцирует транскрипцию провоспалительных медиаторов, связанных с атеросклерозом58-60. Чтобы определить, может ли GGT потенциально блокировать экспрессию этих провоспалительных регуляторов в макрофагах, клетки, предварительно обработанные GGT, стимулировали oxLDL, а уровни экспрессии мРНК TNF, IL-6, IL-12, IL-1 и MCP1 определяли количественно с помощью анализа qRT-PCR. Мы обнаружили значительное снижение индуцированных oxLDL уровней экспрессии мРНК TNF, IL12, IL1 и MCP1 в клетках, обработанных GGT, по сравнению с контрольными клетками, обработанными носителем (рис. 7E-I). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что ГГТ блокирует проатерогенную активацию JNK2 и экспрессию воспалительных генов в ответ на стимуляцию oxLDL в макрофагах. Обсуждение Известно, что природные соединения, такие как флавоноиды и полифенолы, модулируют сердечно-сосудистые реакции с помощью различных механизмов, таких как ингибирование провоспалительных сигналов, повышение чувствительности к инсулину, окислительный статус и улучшение липидного профиля крови40–45. Здесь мы сообщаем об идентификации и функциональной характеристике Linkedin, флавона, на основе полувысокопроизводительного скрининга, как нового ингибитора TRPV4-зависимых протерогенных/воспалительных процессов в макрофагах. Мы специально показали, что i) гинкгетин блокирует опосредованный TRPV 4- приток Ca2 плюс в макрофаги, ii) блокада гинкгетином функции TRPV4 заметно снижает образование пенистых клеток, индуцированное oxLDL, путем подавления поглощения oxLDL макрофагами, и iii) гинкгетин блокирует Индуцированное LPS и oxLDL фосфорилирование JNK1/2, экспрессия белков TRPV4 и экспрессия воспалительных генов. В совокупности результаты нашего исследования показали, что гинкгетин ингибирует проатерогенную/воспалительную функцию макрофагов 4-зависимым от TRPV образом. Атеросклероз, заболевание аорты, первоначально подпитывается воспалением и переполнением макрофагов оксЛПНП, вызывая образование пенистых клеток макрофагов, которые впоследствии прогрессируют с образованием атеромы2-10. Поскольку образование пенистых клеток является критическим процессом в атерогенезе, понимание и управление формированием пенистых клеток может иметь терапевтический потенциал. Известно, что макрофаги экспрессируют множество проникающих через мембрану ионных каналов и насосов, в том числе TRPV4, механочувствительный полимодальный Са2 плюс проницаемый ионный канал, который активируется как физическими, так и биохимическими стимулами11-24. Опубликованные исследования нашей и других лабораторий выявили роль TRPV4 в воспалении макрофагов и индуцированном oxLDL образовании пенистых клеток14–16,26. Таким образом, TRPV4 может служить жизнеспособной мишенью для ослабления проатерогенных процессов.

Рисунок 5. Linkedin не подавляет связывание DiI-oxLDL с макрофагами. Макрофаги предварительно обрабатывали носителем или линкедином (1 или 10 мкМ) в течение 3 ч с последующей инкубацией с меченым DiI oxLDL (2,5 мкг/мл) в течение 1 ч при 4°С. (A) Типичные флуоресцентные микроскопические изображения (исходное увеличение, 63×) связывания DiI-oxLDL на поверхности мембраны макрофагов (n =20 клеток/состояние). (B) Результаты эксперимента A показаны в виде профиля графика с использованием программного обеспечения NIH ImageJ. (C) Количественный анализ результатов A. n=20 клеток/состояние. в улучшении атеросклероза за счет снижения MMP-2 и MMP-9 и повышения уровней NO и NOS в грудной аорте крыс52. В настоящем исследовании мы показали, что гинкгетин блокирует TRPV4-вызывающий приток Са2+ в макрофаги. Механически мы показали, что гинкгетин блокирует поглощение oxLDL, но не связывание, в макрофагах. Исследования, проведенные in vivo и in vitro, показали критическую роль CD36 как основного рецептора-мусорщика в поглощении oxLDL и образовании пенистых клеток макрофагов 2-7. Было показано, что мыши с нулевым CD36, у которых отсутствует ApoE или LDLR, менее склонны к развитию атеросклеротических поражений5,6. Предыдущие исследования нашей группы выявили важную роль сигнального каскада CD36-JNK в формировании пенистых клеток макрофагов7. Толл-подобные рецепторы TLR2, TLR4 и TLR6 действуют как корецепторы, взаимодействуя с CD36, и было показано, что они участвуют в атерогенезе2,56,63. Мы исследовали возможность того, что отсутствие образования пенистых клеток, наблюдаемое в макрофагах, обработанных Linkedin, было связано со снижением экспрессии белков CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 или TLR6. Интересно, что лечение Linkedin не приводило к значительному снижению экспрессии белков CD36, TLR2, TLR4 или TLR6 на базовом уровне или в условиях стимуляции oxLDL. Однако Linkedin специфически блокировал индуцированную oxLDL активацию экспрессии белков TRPV4, в то время как его экспрессия на базовом уровне оставалась неизменной. Учитывая все вместе, эти результаты позволяют предположить, что гинкгетин блокирует индуцированное oxLDL образование пенистых клеток посредством механизма, независимого от экспрессии CD36 и TLR, но зависящего от TRPV4. Предыдущие исследования нашей и других групп показали, что активация JNK2 участвует в формировании пенистых клеток и развитии атеросклеротических поражений7,57. Также сообщалось, что JNK участвует в модуляции MMP-9 и MMP-13, которые сверхэкспрессируются при атеросклеротических поражениях64-68. Учитывая признанную связь JNK с атерогенными процессами, мы хотели определить, может ли гинкгетин ингибировать активацию JNK. В соответствии с предыдущими отчетами наши результаты также показали, что гинкгетин блокирует индуцированное воспалительным стимулом фосфорилирование JNK2 в макрофагах. Этот результат указывает на возможный механизм, с помощью которого Linkedin блокирует образование пенистых клеток. Кроме того, мы обнаружили значительное снижение индуцированной oxLDL экспрессии мРНК TNF, IL12, IL1 и MCP1 в клетках, обработанных гинкгетином, по сравнению с контрольным носителем, что подчеркивает потенциальную противовоспалительную роль гинкгетина в ответ на oxLDL. Таким образом, наши результаты показали, что гинкгетин ингибирует проатерогенную и воспалительную функцию макрофагов 4-зависимым от TRPV образом. Таким образом, эти результаты усиливают обоснование использования природных соединений при разработке потенциальных терапевтических и/или химиопрофилактических реагентов.

использованная литература
1. Баркера С. и соавт. Глобальный обзор эпидемиологии атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний. Арка Мед. Рез. 46, 328–338 (2015).
2. Мур, К.Дж. и Табас, И. Теория клеточной биологии макрофагов при атеросклерозе. Ячейка 145, 341–355 (2011).
3. Либби П. Воспаление при атеросклерозе. Природа 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Цитокины, метаболизм липидов макрофагов и пенистые клетки: значение для терапии сердечно-сосудистых заболеваний. прог. Липид Рез. 50, 331–347 (2011).
5. Феббрайо М. и соавт. Направленное разрушение рецептора поглотителя класса B CD36 защищает от развития атеросклеротического поражения у мышей. Дж. Клин. Инвестировать. 105, 1049–1056 (2000).
6. Куньятур В.В. и соавт. Рецепторы-мусорщики класса AI/II и CD36 являются основными рецепторами, ответственными за поглощение модифицированного липопротеина низкой плотности, что приводит к липидной нагрузке в макрофагах. Дж. Биол. хим. 277, 49982–49988 (2002).
7. Рахаман С.О. и соавт. CD 36-зависимый сигнальный каскад необходим для образования пенистых клеток макрофагов. Клеточный метаб. 4, 211–221 (2006).
8. Росс, Р. Атеросклероз — воспалительное заболевание. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Либби П. Молекулярные механизмы тромботических осложнений атеросклероза. Дж. Стажер. Мед. 517–527, 2008 г.
10. Лусис, А.Дж. Атеросклероз. Природа 407, 233–241 (2000).
11. Мэтьюз Б.Д. и соавт. Сверхбыстрая активация ионных каналов TRPV4 механическими силами, воздействующими на бета1-интегрины клеточной поверхности. Целое. биол. (Кэмб). 2(9), 435–442 (2010).
12. Шарма С., Госвами Р. и Рахаман С.О. Сигнальная ось механотрансдукции Te TRPV4-TAZ при эпителиально-мезенхимальном переходе, индуцированном жесткостью матрикса и TGF 1-. Ячейка Мол. Биоинж.12, 139–152 (2019).
13. Госвами Р., Арья Р.К., Бисвас Д., Чжу Х. и Рахаман С.О. Переходный рецепторный потенциал ваниллоида 4 необходим для ответа на инородное тело и образования гигантских клеток. Являюсь. Дж. Патол. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Госвами Р. и др. Проницаемый для кальция канал TRPV4 является новым регулятором образования пенистых клеток макрофагов, индуцированного окисленным ЛПНП. Свободный Радик. биол. Мед. 110, 142–150 (2017).