Экспрессия иммунных генов и функциональные сети в различных классах волчаночного нефрита Ⅰ

АБСТРАКТНЫЙ

Цель: изучить возможности платформы NanoString ввыяснение почкииммунные транскрипты для волчаночного нефрита (ВН) классов III, IV и V с использованием ретроспективной когортыфиксированный формалином залитый в парафин(FFPE) ткань биопсии почки.

Методы. Анализ транскриптов иммунных генов проводился с использованием платформы NanoString nCounter на РНК от ЛН (n=55), болезни тонкой базальной мембраны (ТБМ) (n=14) и мембранозной нефропатии (МН) (n{ {2}}) ФФПЭбиопсия почкисалфетка. Образцы LN состояли из отдельных биопсий классов III (n=11), IV (n=23) и V (n=21) без смешанных поражений. Дифференциальную экспрессию генов осуществляли с помощью NanoString nSolver с визуализацией вулканических графиков и тепловых карт, созданных в R. Значительные транскрипты были опрошены для идентификации функциональных сетей с использованием терминов STRING и генной онтогенеза.

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПОЛУЧИТЬ ТРАВЯНУЮ ФОРМУЛУ ЦИСТАНША ДЛЯ ПОЧЕК

Результаты. По сравнению с TBM мы идентифицировали 52 значительно дифференциально экспрессируемых гена, общих для всех трех классов LN. Анализ путей показал обогащение путей передачи сигналов интерферона I типа (IFN), комплемента и MHC II, при этом большинство из них демонстрировали самую высокую экспрессию в LN класса IV. Наши биопсии ЛУ класса IV также показали значительное усиление передачи сигналов NF-κB и иммунологическое обогащение по сравнению с биопсией ЛУ класса V. Транскрипты пути IFN типа I отличают LN класса V от MN.

Заключение: Наш транскриптомный анализ всего среза почки позволил получить представление о молекулярном профиле ВН классов III, IV и V. Данные выявили важные пути, общие для всех трех классов, и пути, обогащенные нашими биопсиями LN класса IV. Способность выявлять молекулярные пути в ВН с использованием цельных срезов биопсии FFPE может иметь клиническую ценность при выборе лечения ВН.

ВВЕДЕНИЕ

Волчаночный нефрит(ЛН) является важным проявлением системногоКрасная волчанка(СКВ) и развивается примерно у 40% пациентов.1 На ее распространенность влияют возраст (более высокий уровень при СКВ, начавшийся в детстве) и этническая принадлежность (более высокий уровень у пациентов неевропейского происхождения) и обратно пропорциональная социально-экономическому статусу.2биопсия почкиявляется важной частью лечения ВН3 4, и были предприняты значительные усилия, чтобы связать изменения, наблюдаемые в биопсии, с патогенезом, выбором лечения и прогнозом.1 Решающее значение для этого имела разработка системы классификации ВН, которая включала стандартизированные определения биопсийных поражений для уменьшения межотчетной вариабельности.

Согласованная классификация LN5 Международного общества нефрологов/почечной патологии (ISN/RPS) 2003 г. описывает шесть классов: минимальный мезангиальный LN (класс I); мезангиальный пролиферативный ЛН (класс II); очаговый ЛН (класс III); диффузный ЛН, который далее можно разделить на диффузный сегментарный (класс IV-S) и диффузный глобальный (класс IV-G) пролиферативный ЛН; мембранозный ЛУ (класс V) и прогрессирующий склерозирующий ЛУ (класс VI). Активные (А, например, эндокапиллярная гиперклеточность, фибриноидный некроз, клеточные и микроклеточные полулуния) и хронические (С, например, гломерулярный склероз, фиброзные полулуния) поражения клубочков также определялись и обозначались при описании классов III и IV. Например, класс IV-G (А) описывал диффузный глобальный пролиферативный ЛН с активными поражениями. Было предложено обновить эту классификацию.6 Рекомендации включали исключение подразделений классов IV-S и IV-G, поскольку они не влияют на результат. В метаанализе возникновение либотерминальная стадия заболевания почекилиудвоение уровня креатинина в сывороткене различались между классами IV-S и IV-G.7 Было также предложено заменить активные и хронические дескрипторы индексами активности и хроничности, полученными на основе системы оценки активности волчанки NIH8, что позволит количественно оценить активность (а от 0 до 24) и хроническое течение (от 0 до 12).

Класс LN имеет решающее значение для информирования руководства.3 Иммуносупрессия рекомендуется при активном ВН III и IV классов, но не при ВН класса II. Решение о начале иммуносупрессии при ВН класса V зависит от степени протеинурии и ее реакции на ренин-ангиотензин-альдостероновую блокаду. Неспособность контролировать протеинурию через 12 месяцев после лечения связана с прогрессированием хронической болезни почек9–11, поэтому целью лечения является снижение протеинурии с целью достижения полного клинического ответа (<0.5–0.7 g per 24 hours).

Сам по себе класс LN менее надежен в плане информирования о результатах, посколькуФакторы риска развития хронической болезни почеквключатьКлинические особенностии потому, что они включают гистологические особенности, не отраженные в определениях класса LN. К ним относятся степень интерстициального фиброза и канальцевой атрофии (IFTA) и специфические поражения клубочков, такие как фибриноидный некроз и фиброзные полулуния.12 Количественная оценка отдельных и четко определенных поражений почек может дать информацию о прогнозе. Это очевидно при IgA-нефропатии, где было показано, что оценка мезангиальной клеточности, эндокапиллярной гиперклеточности, сегментарного склероза, тубулярной атрофии, интерстициального фиброза и полулуний для формирования шкалы MEST-C помогает прогнозировать риск.13–15 Предлагаемые изменения к ISN Согласованная классификация LN /RPS 2003 могла бы устранить эти недостатки6, но она по-прежнему основана на использовании морфологии. Следовательно, существует необходимость изучить молекулярные пути в биопсиях ЛУ и понять, как они связаны с классами ЛУ16 17 и результатами лечения.18 19 С точки зрения клинической полезности, транскриптомный анализ биопсии почек является наиболее эффективным. продвинулись в диагностике антитело-опосредованного отторжения почек, когда к подтвержденным морфологическим критериям было добавлено увеличение экспрессии транскриптов генов в биопсийной ткани.20 Чтобы определить полезность использования транскриптомных данных для улучшения клинической полезности почек. При биопсии при СКВ мы использовали технологию NanoString для изучения экспрессии 750 иммунных и связанных с воспалением транскриптов в фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE) срезах из 55 биопсий LN, 14 биопсий с заболеванием тонкой базальной мембраны (TBM) и 9 биопсий с мембранозная нефропатия (МН).

МЕТОДЫ

Образцы: ткань биопсии почки FFPE была получена из архивных образцов LN, TBM и MN, избыточных для клинического использования и при наличии достаточного количества ткани для анализа. Биопсии волчанки со смешанными поражениями или значительными рубцами были исключены. ТБМ использовался в качестве средства контроля заболевания из-за отсутствия биопсии нормальной почки. Клинические параметры были собраны из медицинских записей ретроспективно. Матрицу оценок интерферона (ИФН) получали, как сообщалось ранее.21 Полный ответ определялся как соотношение белок/креатинин в моче (uPCR)<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% через 1 год после биопсии. Частичный ответ определялся как uPCR.<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

экстракция РНК

С помощью микротома из каждого блока FFPE получали шесть срезов цельной ткани толщиной 10 мкм после удаления двух срезов толщиной 4 мкм. Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение, оборудование очищали с помощью RNase Away между пробами, а для каждого образца использовали свежее лезвие. Выделение РНК из цельной ткани осуществляли в тот же день с использованием набора RNeasy FFPE (Qiagen, #73504), а концентрацию РНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США; дополнительные онлайн-данные S1).

Транскриптомный анализ

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >двойное (среднее+2 стандартное отклонение) зондов отрицательного контроля. Подсчеты были нормализованы к среднему геометрическому значению 10 генов домашнего хозяйства (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB и ZC3H14), выбранных по мере их экспрессии во всех типах образцов. Нормализованные значения для всех образцов указаны в дополнительных онлайн-данных S2.

статистический анализ

Дифференциальную экспрессию генов (DGE) проводили с использованием алгоритма расширенного анализа решателя (V.4) Fast/Approximate, который использует упрощенную модель отрицательного бинома для всех зондов, за исключением тех случаев, когда алгоритм не сходится и используется метод линейной регрессии. LN, MN или класс LN (III, IV и V) использовались в качестве независимых переменных, а TBM в качестве нашей контрольной группы. Пороговое количество было установлено на уровне 100, а частота наблюдений в выборках установлена ​​на уровне 8%; Значение P было скорректировано с использованием метода Бенджамини-Хохберга с порогом ложного обнаружения, установленным на уровне 0,05. Графики вулканов были созданы с использованием пакета Enhanced Volcano (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) в R.22. Визуализация функциональной сети белковых ассоциаций выполнялась с использованием базы данных STRING (https://string-db.org/). , используя всю сеть STRING. Края сети определялись достоверностью, а взаимодействиям присваивался наивысший балл достоверности взаимодействия (больше или равный 0,9). Отключенные узлы внутри сетей не отображались. Значительно дифференциально экспрессируемые гены были оценены на предмет обогащения терминов онтологии генов (GO) (биологические процессы, молекулярные функции, клеточный компонент), путей реактома и кластеров локальной сети STRING. Сети визуального взаимодействия были созданы с функциональными расширениями в терминах GO (биологические процессы) и анализа STRING. Пропорциональная по площади диаграмма Венна перекрывающихся дифференциально экспрессируемых генов между подклассами LN была создана с помощью BioVenn (www.biovenn. nl).23 Данные из программного обеспечения расширенного анализа были считаны в статистическую среду R, а визуализация данных выполнялась с использованием коробчатых диаграмм, анализа главных компонентов, графики вулканов и тепловые карты. Тепловые карты были созданы с использованием Z-оценок нормализованных подсчетов и тепловой карты в R. Кластеры анализировались с использованием точного критерия Фишера. Для сравнения нескольких групп использовался дисперсионный анализ с помощью теста множественных сравнений Сидака. Данные анализировали с помощью GraphPad Prism (V.8.0).

Заявление об участии пациентов и общественности (PPI)

Это исследование проводилось в рамках консорциума MASTERPLANS, и сотрудники-пациенты участвовали во всех направлениях работы, включая это исследование. PPI подготовил глоссарий терминов, чтобы обеспечить дальнейшее взаимодействие с более широким сообществом пациентов, а результаты исследований были включены в дни обзора непрофессионалов. Обзоры публикаций публикуются на веб-сайте MASTERPLANS (https://sites.manchester.ac.uk/masterplans).

Служба поддержки Wecistanche-крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Магазин для получения дополнительных технических характеристик:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ПОЛУЧИТЕ НАТУРАЛЬНЫЙ ОРГАНИЧЕСКИЙ ЭКСТРАКТ ЦИСТАНШИ С 25% ЭХИНАКОЗИДА И 9% АКТЕОЗИДА ДЛЯ ПОЧЕК