Иммуностимулирующая активность водоэкстрагируемых полисахаридов из Cistanche Deserticola в качестве растительного адъюванта in vitro

Чтобы получить больше информации:ali.ma@wecistanche.com

Айлиан Чжан, Сюмэй Ян, Цюаньсяо Ли, Ю Ян, Ган Чжао, Бинь Ван, Даочэн Ву

1 Синьцзянская ключевая лаборатория биологических ресурсов и генной инженерии, Колледж естественных наук и технологий, Синьцзянский университет, Урумчи, Синьцзян, Китай,

2 Ключевая лаборатория медицинской молекулярной вирусологии, Школа фундаментальных медицинских наук, Шанхайский медицинский колледж, Университет Фудань, Шанхай, Китай,

3 Колледж биологических наук и технологий Сианьского университета Цзяотун, Сиань, Шаньси, Китай

Абстрактный

Безопасный и эффективный вакцинный адъювант играет важную роль в современных вакцинах. Различные китайскиетравяные полисахаридыможет активировать иммунную систему.Цистанхе пустынная(CD) является традиционной китайской травой и кандидатом в адъюванты. Здесь мы подтвердили, чтоводоэкстрагируемые полисахаридыCD (WPCD) может модулировать иммунные ответы in vitro и in vivo. В зависимости от дозы WPCD значительно способствует созреванию и функционированию дендритных клеток костного мозга мышей (BM-DC) посредством повышения уровня экспрессии MHC -II, CD86, CD80 и CD40, аллогенная пролиферация Т-клеток и выход IL-12 и TNF- через толл-подобный рецептор4 (TLR4), как показано в экспериментах in vitro. Кроме того, его иммуномодулирующая активность наблюдалась и у мышей. WPCD эффективно улучшал титры IgG, IgG1 и IgG2a и заметно повышал пролиферацию Т- и В-клеток, продукцию IFN- и IL-4 в CD4 плюс Т-клетках, а также уровень экспрессии IFN- в CD8. плюс Т-клетки лучше, чем квасцы. Кроме того, WPCD может заметно повышать уровень экспрессии CD40 и CD80 на ДК в селезенке и понижать частоту Treg. Исследование предполагает, что полисахариды цистанхе пустынной являются безопасным и эффективным адъювантом вакцины для индукции как гуморального, так и клеточного иммунитета путем активации DC через сигнальный путь TLR4.

Нажмите, чтобы просмотреть продукты из стеблей цистанхе

Введение

Вакцины важны для контроля или предотвращения болезней. Вновь созданные и разрабатываемые в настоящее время вакцины представляют собой высокоочищенные рекомбинантныеантигеныс более высокой безопасностью, но очищенные антигены не могут стимулировать удовлетворительнуюиммунная реакцияпо сравнению с аттенуированными или инактивированными препаратами возбудителя. С помощью адъювантов вакцины могут вызывать стойкиеиммунные реакции[1,2]. Новые мощные адъюванты широко используются как для разработки вакцин, так и для здоровья человека. На сегодняшний день идентифицированы и широко изучены различные адъюванты. Эти адъюванты наделяют вакцины несколькими преимуществами, включая снижение необходимого количества антигенов, минимизацию количества иммунизаций, необходимых для нормального иммунного ответа, и индукцию более быстрого, широкого и сильного действия.иммунные реакции[3–5]. Хотя было разработано много сильнодействующих адъювантов, таких как липополисахарид (LPS) и полный адъювант Фрейнда (FCA), они не получили широкого применения из-за своей токсичности. Следовательно, только несколько адъювантов, таких как квасцы, лицензированы для клинического применения [6]. В целом, необходимо разработать более эффективные и безопасные адъюванты для продвижения более качественных профилактических и терапевтических вакцин против инфекционных и неинфекционных заболеваний.

Безопасность является важным фактором при разработке адъювантов. Китайские травяные компоненты включают питательные вещества и важные активные соединения, такие как фенольные соединения и полисахариды, которые могут действовать как мощные иммуностимуляторы [7-9]. Среди них широко исследованы полисахариды из традиционных китайских трав благодаря их иммуностимулирующей активности и низкой токсичности. Например, инулин является иммунным адъювантом без токсичности других адъювантов, таких как FCA. Адъювант дельта-инулина AdvaxTM также успешно повышает иммуногенность вакцин [10,11]. Астрагал, также известный как Huangqi на китайском языке и Radix Astragali на латыни, широко распространен по всему миру. Полисахарид является одним из его основных активных ингредиентов, отвечающих за иммуномодулирующую активность. Экспериментальные исследования показали, что полисахарид астрагала обладает сильным иммуномодулирующим действием как in vitro, так и in vivo [12, 13]. Полисахариды Lycium barbarum в качестве адъюванта вакцины также показали хорошие улучшения и стимулирующие эффекты [14, 15]. Эти исследования показали, что полисахариды китайских трав являются идеальными кандидатами для разработки адъювантов.

Цистанхе пустынная YC Ma(CD, «Rou Cong Rong» на китайском языке) — это ценное традиционное китайское растение, которое обычно называют «женьшенем пустынь» из-за его превосходного тонизирующего действия. Он распространен в засушливых или полузасушливых районах Синьцзяна. В Китае его высушенный мясистый стебель использовался в качестве тонизирующего продукта на протяжении сотен лет [16, 17]. В течение многих лет вареный компакт-диск использовался в качестве тонизирующей пищи для лечения нарушений, вызванных перенапряжением, что позволяет предположить, что он безопасен для перорального приема. Это растение широко известно из-за его широких лечебных функций. Недавние фитохимические и фармакологические исследования показали, что полисахариды являются основными биологически активными компонентами и обладают разнообразными биологическими эффектами, включая иммуномодулирующую активность, антиоксидантный эффект и противовоспалительное действие [18-21]. Однако редко сообщалось об иммуностимулирующей активности водоэкстрагируемых полисахаридов из C. Deserticola в Синьцзяне.

Хорошо известно, что ДК являются важными антигенпрезентирующими клетками (АПК), обеспечивающими сигналы, необходимые для инициации иммунных ответов и модуляции врожденных и адаптивных клеток. Некоторые адъюванты, улучшающие поглощение антигена дендритными клетками, могут увеличивать костимулирующие молекулы или молекулы главного комплекса гистосовместимости и повышать иммунитет. Когда начинается созревание ДК, вырабатывается больше костимулирующих молекул и цитокинов, и ДК демонстрируют различные фенотипы [22, 23].

В этом исследовании мы впервые использовали, может ли WPCD способствовать активации DC через сигнальный путь TLR4 in vivo. Поскольку ДК были связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунными ответами, мы предположили, что активация ДК, стимулированная WPCD, будет влиять на результат адаптивного иммунитета. Мы исследовали специфический иммунный ответ на овальбумин (OVA) у мышей, получавших WPCD, включая титры подклассов IgG, IgG1 и IgG2a, Т- и В-пролиферацию и продукцию цитокинов. Мы исследовали, повысит ли лечение WPCD активность DC и Treg-клеток в селезенке этих мышей. Наши результаты подтвердили потенциальную иммуномодулирующую активность природных полисахаридов из C. Deserticola и расширили область их применения.

материалы и методы

Животные

Самок мышей C57BL/6, BALB/c или ICR в возрасте от восьми до десяти недель приобретали в FirstHospital Синьцзянского медицинского университета (Урумчи, Синьцзян, Китай). Мышей содержали в условиях, свободных от патогенов, в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных (ACUC) Синьцзянского университета здоровья и благополучия животных. Процедуры экспериментов на животных были одобрены AUCC Синьцзянского университета.

Экстракция водных экстрактов

C. Deserticola — растение из провинции Синьцзян в Китае. Неочищенный полисахарид получали водной экстракцией и осаждением этанолом. Вкратце, 100 г высушенной C. Deserticola измельчали ​​в порошок, а затем фильтровали. Порошок повторно кипятили с петролейным эфиром при комнатной температуре, а затем кипятили с безводным этанолом в течение 1 часа для удаления окрашенных ингредиентов и липидов. Остатки трижды экстрагировали кипящей водой, экстракты объединяли, центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин и кипятили с обратным холодильником при 60°С в течение 4 ч. В раствор добавляли четырехкратный объем 95-процентного этанола для осаждения неочищенных полисахаридов. Неочищенные полисахариды повторно растворяли в дистиллированной воде и обрабатывали реактивом Сэвиджа для удаления белков. Экстракты растворяли в PBS и стерилизовали через фильтр 0,{9}} мкм. Наконец, общее содержание сахара в WPCD составило 59,58%, как показал фенол-сернокислотный анализ [24].

Генерация DC

BM-DC генерировали по ранее описанному методу с небольшими модификациями [25]. DC костного мозга от мышей C57BL/6 промывали полной средой RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone). Собранные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 50 мкМ меркаптоэтанола (Sigma, Сент-Луис, Миссури) и 20 нг/мл мышиного GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) и инкубировали при 37°С. C в атмосфере с 5% CO2. Половину культуральной среды заменяли свежей средой, содержащей ГМ-КСФ, каждые 1–2 дня. Клетки собирали на 6-й день, обрабатывали различными дозами WPCD, LPS (100 нг/мл) (Sigma, Сент-Луис, Миссури) в течение 24 ч, а затем оценивали с помощью проточной цитометрии.

Обнаружение созревания ДК и активации Т-клеток in vitro

Влияние WPCD на созревание in vitro на BM-DC оценивали на основании результатов фенотипического анализа с помощью FAC. На 7-й день BM-DC из C57BL/6 индуцировали в присутствии GM-CSF, а затем обрабатывали различными концентрациями WPCD (0.01, 0.{{11 }}2, 0.05, 0,1 и 0,2 мг/мл) в течение 12 ч в трех повторностях. ЛПС (100 нг/мл) использовали в качестве положительного контроля. После того, как BM-DC промывали в PBS и использовали Fc Block (BD Biosciences, CA) для предотвращения неспецифического связывания антител, клетки окрашивали в PBS с использованием соответствующих FITC-, PE- или APC-конъюгированных CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80 и антитела MHC-II (BD) в течение 20 мин при 37°C. Окрашенные клетки выявляли с помощью FACs Calibur (BD). Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star).

В эксперименте по созреванию DCS in vitro супернатанты клеточных культур также собирали для анализа IL-12 и TNF- с использованием наборов для анализа цитокинов (Boster, Ухань, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью планшет-ридера ELISA (Bio-Rad, США). Количество цитокинов в образцах рассчитывали по стандартным кривым рекомбинантных цитокинов по методу линейной регрессии.

Чтобы проверить их аллогенную стимулирующую активность, эксперимент со смешанной лимфоцитарной реакцией (MLR) был проведен в соответствии с предыдущим методом [26] с помощью анализа MTT (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Вкратце, BM-DC от мышей C57BL/6, используемых в качестве клеток-стимуляторов, выделяли на 7-й день в среде RPMI-1640 плюс GM-CSF и обрабатывали различными концентрациями WPCD в течение 12 часов при 37°C. Клетки промывали и повторно суспендировали в среде RPMI-1640 перед посевом в 24-луночный планшет. Суспензию одиночных пленоцитов в качестве клеток-респондеров выделяли из мышей BALB/c. КМ-ДК смешивали со спленоцитами в соотношении 1:5 и 1:10. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере с 5% СО2 в течение трех дней в трех повторностях. Обработку LPS использовали в качестве положительного контроля. Затем к культурам добавляли 20 мкл МТТ для заключительного 4- ч культивирования. Поглощение при измерительной длине волны (490 нм) и эталонной длине волны (650 нм) измеряли для анализа пролиферации Т-клеток. Все образцы измеряли относительно фонового контроля.

Лечение ингибитором TLR4 in vitro

КМ-ДК предварительно обрабатывали 5 мкМ TAK-242 (ингибитор TLR4, Medchemexpress Inc., США) в течение 1 ч, а затем совместно культивировали с различными концентрациями WPCD (100 и 200 мкг/мл) в течение 12 ч. при наличии или отсутствии остановки Гольджи в трехкратной повторности. В положительном контроле добавляли LPS. Клетки и супернатанты выявляли с помощью FAC для анализа поверхностных маркеров CD86 и CD40 и с помощью ELISA для анализа цитокинов TNF-a и IL-12 соответственно.

Протокол иммунизации

Тест на острую токсичность. В тесте на острую пероральную токсичность в этом исследовании использовались 4 0 здоровых взрослых мышей ICR. Мышей ICR не кормили (пища, но не вода в течение ночи) перед введением дозы. WPCD вводили перорально соответственно в дозах 0, 50, 500 или 5000 мг/кг массы тела каждому животному в течение 7 дней. В контрольную группу были включены мыши, получавшие физиологический раствор и обработанные квасцами. За животными наблюдали ежедневно в течение 14 дней подряд. За мышами индивидуально наблюдали, чтобы зарегистрировать смертность и клинические признаки. Кроме того, на протяжении всего эксперимента измеряли массу тела и потребление ими пищи и воды. На 14-й день индекс селезенки или тимуса рассчитывали как (масса селезенки или тимуса/масса тела) × 10.

Обнаружение иммуномодулирующей активности WPCD in vivo. Чтобы выяснить, обладает ли WPCD иммуномодулирующей активностью, в качестве модельного антигена использовали овальбумин (OVA) (Sigma), а самок мышей ICR случайным образом разделили на 7 групп (группа отрицательного контроля (0,9% NaCl и WPCD 400 мкг) и положительный контроль (квасцы 200 мкг с OVA)). Мышам дважды подкожно вводили 10 мкг только OVA или WPCD с OVA в дозе 20, 100 или 400 мкг с интервалом в 2-недель. Образцы крови и селезенки были получены после бустерной вакцинации для определения титров IgG, подклассов IgG, пролиферации спленоцитов и цитокинов, поверхностных маркеров ДК и частоты Treg.

Обнаружение OVA-специфических антител

Титры и подклассы OVA-специфических IgG исследовали с помощью ИФА по предыдущей методике [27]. Планшеты для ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) покрывали в течение ночи и затем блокировали. Образцы сыворотки последовательно разбавляли для анализа титра IgG или обнаружения IgG1 и IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Затем планшеты инкубировали с PBST, содержащим HRP-конъюгированные антимышиные IgG, IgG1 и IgG2a, в течение 1 ч при 37°C. Колориметрическую реакцию проводили с тетраметилбензидином (ТМБ), а затем измеряли оптическую плотность при 450 нм/655 нм и выражали в единицах оптической плотности (ОП).

Обнаружение пролиферации спленоцитов и цитокинов

Пролиферацию спленоцитов определяли с помощью анализа МТТ. На 21-й день после первой вакцинации получали однократную суспензию спленоцитов. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 в96-луночных планшетах в концентрации 1×106 клеток/лунку в трехкратной повторности. Культуры стимулировали OVA (конечная концентрация 10 мкг/мл), ConA (конечная концентрация 5 мкг/мл) (Sigma, Сент-Луис, Миссури) и LPS (конечная концентрация 100 нг/мл) в течение 48 ч при 37°C. . Клетки культивировали в течение 48 часов, в каждую лунку добавляли 20 мкл (5 мг/мл) МТТ (Sigma, Сент-Луис, Миссури) и инкубировали еще 4 часа. После добавления 50 мкл ДМСО в каждую лунку для остановки развития окраски (Sigma) планшеты считывали при 570 нм с помощью устройства для считывания микротитрационных планшетов (Bio-Rad, Калифорния, США). Пролиферацию спленоцитов выражали в виде индекса стимуляции (SI), который представлял собой отношение OD570 нм стимулированной лунки к нестимулированной лунке.

Выходы IL-4 и IFN- в Т-клетках измеряли окрашиванием внутриклеточных цитокинов в соответствии с опубликованным протоколом с небольшими изменениями [27, 28]. Однократную суспензию спленоцитов готовили на 21-й день после первой вакцинации. После лизиса эритроцитов спленоциты (2×106 клеток/мл) инкубировали с OVA (10 мкг/мл) в течение 4- часов стимуляции, а затем добавляли остановку Гольджи (BD) на 12 часов инкубации, РМА в качестве положительный контроль. Клетки собирали, промывали PBS, окрашивали CD4-FITC/CD8-FITC, фиксировали и пермеабилизировали с помощью набора Cyto fix/Cytoperm (BD) в соответствии с инструкциями производителя. Окрашивание внутриклеточных цитокинов проводили с соответствующей концентрацией антител к IL-4-PE или IFN- -APC при 4°C в течение 20 мин. Окрашенные клетки выявляли с помощью FAC. Анализ данных проводился в программе FlowJo.

Оценка созревания ДК и клеток Treg в селезенке

Для анализа созревания ДК из спленоцитов у мышей проводили окрашивание клеточной поверхности антителами к CD11c-PE, CD40-FITC и CD80-APC. На 3-й день после первой вакцинации получали однократную суспензию спленоцитов (1×106 клеток/мл) и подвергали двойному окрашиванию клеток. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FACs Calibur, а измеренные данные анализировали с помощью FlowJo.

Чтобы наблюдать, может ли WPCD снижать частоту клеток CD4, CD25, Foxp3 и Treg. Однократную суспензию спленоцитов готовили на 7-е сутки после второй вакцинации. Спленоцит (2×106 клеток/мл) подвергали окрашиванию клеточной поверхности антителом CD4-APC с последующим окрашиванием ядерных цитокинов соответствующими антителами CD25-FITC и Foxp3-PE с набор для окрашивания регуляторных Т-клеток мыши (eBios ciences) в соответствии с инструкциями производителя. Частоту клеток CD4 плюс CD25 плюс Foxp3 плюс Treg тестировали на FAC. Анализ данных проводился в программе FlowJo.

статистический анализ

Тесты однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) (тест множественного сравнения Тьюки) были выполнены для анализа различий между несколькими экспериментальными группами. Все значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. п< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Полученные результаты

WPCD способствовал созреванию и функционированию BM-DC in vitro.

Адаптивный иммунитет определяется активацией ДК, в том числе типами костимулирующих молекул и цитокинов [29, 30]. Первоначально мы исследовали, может ли WPCD способствовать экспрессии костимулирующих молекул. В соответствии с различными дозами WPCD вводили BM-DC из C57BL/6. Были проанализированы уровни экспрессии CD11c, CD86, CD80, CD40 и MHC-II в клетках (рис. 1). Клетки, закрытые SSC и FSC, показали, что обработка различными дозами WPCD не изменяет морфологию BM-DC (данные не показаны). Уровни экспрессии CD86, CD80 и CD40 значительно повышались дозозависимым образом по сравнению с группой, не получавшей лечения, и достигали плато при дозе 20 мкг/мл WPCD, но разница была незначительно по сравнению с группой LPS (рис. 1A–1C). Уровень экспрессии MHC-II был значительно повышен до максимального значения при дозе 50 мкг/мл (рис. 1D). Результаты анализа маркеров клеточной поверхности показали, что ДК, обработанные LPS или WPCD, показали значительно повышенные уровни экспрессии CD86, CD80, CD40 и MHC-II и способствовали фенотипическому созреванию.

Некоторые адъюванты могут увеличивать костимулирующие молекулы на ДК или напрямую индуцировать секрецию цитокинов. IL-12 и TNF- являются основными цитокинами для активации иммунного ответа Th1. Мы проанализировали выход цитокинов в КМ-ДК при обработке WPCD. После того как ДК КМ-обрабатывали различным содержанием WPCD в течение 12 ч, собирали супернатант для определения содержания IL-12 и TNF- с помощью набора ELISA. WPCD может дозозависимо увеличивать продукцию IL -12 (рис. 2A) и TNF- (рис. 2B). Результаты показали, что WPCD может индуцировать функциональное созревание ДК.

При иммунном ответе необходимо функционально активировать ДК. Затем более высокий уровень пролиферации аллогенных Т-клеток индуцировали полностью зрелые ДК. Поэтому функциональная реакция ДК на WPCD была исследована с помощью MLR. Аллостимулирующая способность ДК, индуцированных WPCD, подобно ЛПС, резко усиливалась дозозависимым образом при указанном соотношении (рис. 2C и 2D). Результаты показали, что WPCD улучшает презентацию антигена и оптимизирует Т-клеточный ответ с помощью MLR in vitro.

WPCD способствовал созреванию DC через путь TLR4

Из приведенных выше результатов можно сделать вывод, что BM-DC, активированные WPCD, показали сходную экспрессию поверхностных молекул DC с LPS (лигандом TLR4). Таким образом, мы предположили, что BM-DC активируются WPCD через путь TLR4. После предварительной обработки BM-DC TAK-242 (ингибитором TLR4) и совместного культивирования с WPCD и LPS в течение 12 часов экспрессия CD40, CD86, TNF-a или IL{{12 }} были обнаружены с помощью FAC или ELISA. Как показано на рис. 3A и 3B, лечение TAK-242 приводило к значительному снижению экспрессии CD40 и CD86, индуцированной LPS или WPCD, и продукции цитокинов IL-12 или TNF-α также был значительно снижен (рис. 3C и 3D). Результаты показали, что WPCD может активировать созревание DC через путь TLR4.

WPCD усиливает гуморальный и клеточный иммунитет

С целью сравнения мы оценили влияние WPCD на индукцию гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных OVA. Перед вакцинацией и на 14, 21, 35 и 49 сутки после первой вакцинации брали кровь для определения титра IgG и подклассов IgG в сыворотке методом ИФА. Реакция антител IgG на OVA увеличивалась с увеличением дозы введения WPCD (100 и 400 мкг) дозозависимым образом (фиг. 4). Оптимальная концентрация составляла 100 мкг/мл WPCD и увеличивала ответы IgG в два раза по сравнению с одним OVA на 21, 35 и 49 дни (рис. 4А). Было получено значительное увеличение уровней OVA-специфических антител IgG1 и IgG2a при введении 20 и 100 мкг WPCD по сравнению с группой OVA в сыворотке на 35-й день (фиг. 4B). Между тем, квасцы повышали только уровни экспрессии OVA-специфических антител IgG и IgG1 у иммунизированных мышей. WPCD сам по себе не запускал OVA-специфические антитела. Приведенные выше результаты, очевидно, указывают на то, что WPCD продуцирует более высокие титры антител и более сбалансированные ответы Th1/Th2, чем квасцы.

Пролиферация спленоцитов является еще одним индикатором клеточного иммунитета. ConA стимулирует T-клетки, а LPS стимулирует пролиферацию B-клеток. На 21-й день после первой вакцинации получали суспензию отдельных спленоцитов и стимулировали соответственно пептидом OVA (10 мкг/мл), OVA323-339 (10 мкг/мл), ConA (5 мкг/мл) и LPS (5 мкг/мл). мкг/мл) в течение 48 часов. Затем методом МТТ измеряли пролиферацию Т-клеток. WPCD мог значительно стимулировать пролиферацию спленоцитов, стимулированную OVA-антигеном, Con A-митогеном и митогеном LPS, у мышей, иммунизированных OVA и WPCD (рис. 5), а оптимальная концентрация WPCD составляла 100 мкг/мл. Эти данные показали, что WPCD в качестве вакцинного адъюванта у мышей, иммунизированных OVA, может более эффективно индуцировать активацию Т-клеток и В-клеток, чем квасцы.

Все протестированные адъюванты WCPD, приготовленные с вакцинами OVA, генерировали одинаково сильный гуморальный и клеточный иммунитет (рис. 4 и 5). На основании этих данных для дальнейшей оценки влияния WPCD на ответ специфических для OVA Т-хелперов (Th) мы дополнительно проанализировали экспрессию цитокинов в CD8 плюс и CD4 плюс Т-клетках с помощью проточной цитометрии (рис. 6). На 21-й день после первой вакцинации выделяли один спленоцит мышей и затем совместно культивировали с OVA (10 мкг/мл). Выход IL-4 в CD4 плюс Т-клетках в группе, которой вводили 100 мкг OVA/WPCD, был значительно выше, чем в группе OVA/квасцов и группе OVA, и аналогичен таковому в группе PMA (фиг. 6A). Кроме того, выход IFN- в CD8 плюс и CD4 плюс Т-клетки также был значительно повышен у мышей, которым вводили OVA/WPCD (20, 100 и 400 мкг) (фиг. 6B и 6C). По сравнению с адъювантом из квасцов, WPCD продемонстрировал лучшую способность индуцировать секрецию IL-4 и IFN- из Т-клеток.

WPCD стимулирует созревание DC и снижает частоту Treg in vivo.

DCS признаны наиболее мощными APC, участвующими в инициации первичных иммунных ответов. Таким образом, на 3-й день после первой вакцинации мы также исследовали влияние WPCD на CD40 и CD80 на ДК в селезенке у мышей (рис. 7А и 7В). Мыши в группе 100- мкг OVA/WPCD продуцировали значительно более высокие уровни CD40 и CD80 на ДК, чем мыши в группе OVA/квасцы. Эти данные показали, что WPCD может активировать дендритные клетки и индуцировать созревание дендритных клеток у мышей. Клетки Treg могут сбалансировать толерантность и иммунный ответ. Для дальнейшего изучения того, как WPCD модулирует иммунный ответ, Treg-клетки в селезенке мышей окрашивали с помощью набора для окрашивания регуляторных Т-клеток мыши. На 21-й день после первой вакцинации наблюдалось снижение частоты CD25 плюс Foxp3 плюс Treg-клетки в общем количестве CD4 плюс Т-клетки (фиг. 7C). По сравнению с группами OVA и OVA/Alum группа WPCD показала значительно сниженную частоту Treg.

Оценка безопасности WPCD у мышей

Для оценки острой оральной токсичности мы провели тест на острую токсичность. У мышей, которым перорально вводили дозу 5000 мг/кг массы тела, не было выявлено аномального поведения или побочных эффектов, и в тесте по оценке токсичности не было обнаружено летальных исходов. Между различными группами мышей, которым вводили разные дозы WPCD, достоверных различий в приросте массы тела, показателях тимуса и индекса селезенки не наблюдалось и не имело достоверных различий (табл. 1). Летальности через 14 дней не наблюдалось. Следовательно, значение LD50 WPCD составляло более 5000 мг на кг массы тела.

Чтобы проверить, оказывает ли WPCD негативное влияние на рост мышей, до и после подкожной вакцинации для каждой мыши соответственно определяли массу тела (таблица 2). При последующем наблюдении за мышами побочных эффектов или аномального поведения не наблюдалось. Кроме того, масса тела мышей, которым вводили WPCD, и мышей, которым вводили физиологический раствор или OVA/квасцы, не показала существенной разницы. Эти результаты наблюдения показали, что введение WPCD было безопасным.

Обсуждение

Адъюванты являются ключевыми компонентами вакцин [31]. Благодаря достижениям в области геномики и протеомики выявляется все больше и больше рекомбинантных и синтетических молекул вакцин. Следовательно, требуется больше адъювантов и композиций. Некоторые сильнодействующие адъюванты обычно связаны с повышенной токсичностью, например, FCA. Следовательно, необходимо найти безопасную форму, содержащую различные синергетические компоненты, в конечном итоге вызывающие желаемый иммунный ответ. Полисахариды из китайских трав нетоксичны и не вызывают значительных побочных эффектов [32,28]. Для определенной вакцины требуется безопасный адъювант.

Цистанхе пустынная является важным тонизирующим растением и широко распространена в засушливых землях и теплых пустынях на северо-западе Китая. Цистанхе пустынная широко известна благодаря своей биологической активности, включая иммуномодулирующее, антиоксидантное, антибактериальное и противоопухолевое действие [20,21]. Некоторый прогресс был достигнут в структурной характеристике и иммунологической активности цистанхе пустынного, который является хорошим кандидатом для разработки адъювантов. Мы экспериментально оценили адъювантные эффекты и механизм WPCD in vitro и in vivo. Подкожное введение WPCD значительно стимулировало гуморальный и клеточный иммунный ответ за счет увеличения сывороточных антител и пролиферации лимфоцитов, усиления экспрессии цитокинов, усиления созревания ДК и снижения частоты CD4, CD25, Foxp3 и Treg-клеток.

DCS являются ключевыми APC для праймирования наивных Т-клеток. Активация DC важна для адъювантов. DCS, особенно мышиные DC, полученные из костного мозга, часто используются для оценки адъювантов и вакцин. Проточная цитометрия позволяет отличить клетки, которые были активированы после захвата антигена из окружающих клеток. В анализе FCM степень агрегации стимулированных клеток является косвенным показателем оценки безопасности иммуномодуляторов [3]. Таким образом, данные об активности адъюванта WPCD в ДК in vitro могут предоставить ценную информацию для моделей на животных. На основе модели BM-DC уровни экспрессии MHC-II, CD86, CD80 и CD40, продукции цитокинов и пролиферации аллогенных Т-клеток были обнаружены в оптимальном диапазоне концентраций WPCD. Уровни экспрессии MHC-II, CD86, CD80 и CD40 повышались в BM-DC, а выходы TNF-α и IL-12 повышались дозозависимым образом. Наблюдалась аллогенная пролиферация Т-клеток. Морфология BM-DC не изменена. Индуцируя активацию BM-DC и секрецию воспалительных цитокинов in vitro, адъювант WPCD может значительно увеличить количество антигена и количество APC и стимулировать Т-клетки к секреции IFN-, что способствует усилению иммуномодулирующей активности.

Различные китайские травяные полисахариды способны активировать иммунную систему и обладают превосходными адъювантными способностями за счет стимуляции созревания дендритных клеток по пути TLR4 [33,28]. Таким образом, мы предполагаем, что TLR4 участвует в сигнальном пути созревания ДК, индуцированного WPCD. Как и ожидалось, лечение ингибитором TLR4 привело к значительному снижению TNF-a и IL-12. Кроме того, ингибирование пути TLR4 также препятствовало экспрессии CD 40 и CD80 на DC, указывая на то, что созревание DC зависит от TLR4. Таким образом, очевидно, что TLR4 участвует в созревании ДК, индуцированных WPCD.

Оптимальная доза адъювантов и состава вакцины определяется эмпирически во многих экспериментах. Чтобы изучить взаимосвязь доза-реакция адъюванта WPCD и антигенов OVA у мышей, мы выбрали различные дозы WPCD на основе ранее полученных данных от BM-DC in vitro для двукратного подкожного введения мышам ICR. Мы обнаружили, что WPCD значительно увеличивает выход OVA-специфических антител и индуцирует сбалансированный иммунный ответ Th1/Th2 с повышением уровней IgG1 и IgG2a. В частности, уровень IgG2a был выше, чем при лечении квасцами в оптимальной дозе. Следовательно, WPCD приводил к более высоким уровням специфических антител и более высокой эффективности при меньшем количестве инъекций.

Новые вакцины требуют индукции сильного клеточного ответа, который включает антитела, Т-хелперные (Th) клетки и цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ). Терапевтическая вакцина направлена ​​на то, чтобы вызвать более сильный ответ Т-клеток. Идеальный адъювант повышает активность вакцины и способствует клеточно-опосредованному иммунитету, не вызывая токсических эффектов [34]. Среди наблюдений на моделях иммунизированных мышей WPCD приводил к увеличению OVA-специфической и неспецифической пролиферации спленоцитов по сравнению с квасцами. Некоторые адъюванты усиливают цитокины и иммунную систему. Например, сапонины могут стимулировать клеточно-опосредованные иммунные ответы на антиген, который обычно индуцирует только антитела. Мы выбрали IL-4 и IFN- в качестве индикаторов для косвенной оценки уровней иммунитета у мышей. WPCD может вызывать большую секрецию IL-4 и IFN-, чем Alum. Таким образом, в результате вакцинации WPCD наблюдались сильные ответы хелперных Т-клеток и секреция цитокинов, что позволяет предположить, что WPCD может более эффективно стимулировать лимфоциты к секреции цитокина Th1-типа и цитокина Th2-типа, чем квасцы.

Адъюванты, влияющие на презентацию антигена, могут воздействовать на сложные иммунные процессы. Клетки Treg могут модулировать ответы Th1 и Th2 [35]. Соответствующая доза WPCD может способствовать созреванию DCs у мышей за счет увеличения уровней экспрессии CD80 и CD40 и усиления способности презентации антигена OVA в раннем иммунном ответе. Экспериментальные результаты активации DCS и частоты Treg показали, что WPCD индуцирует созревание DCs и снижает частоту Treg в селезенке у мышей. Эти результаты доказали, что WPCD повышает эффективность вакцин OVA за счет увеличения нацеливания на антиген-презентирующие клетки и стимулирования специфической активации Т-клеток.

При разработке адъювантов трудно селективно индуцировать соответствующий иммунный ответ против соответствующей инфекции. Подходящий адъювант должен иметь низкие побочные эффекты и токсичность для человека или животных. Таким образом, следует учитывать безопасность WPCD, включая непосредственные и долгосрочные побочные эффекты. В этом исследовании мы изучали острую токсичность WPCD и негативное влияние WPCD на показатели роста мышей в течение 110 дней. Результаты острой токсичности WPCD показали, что масса тела, индекс тимуса или индекс селезенки не имели существенной разницы. Значение LD50 WPCD составляло более 5000 мг на кг массы тела. На протяжении всего экспериментального последующего наблюдения за мышами не было обнаружено никаких побочных эффектов или аномального поведения у мышей. Эти результаты показали, что WPCD был безопасным.

В заключение, в этом исследовании WPCD, неочищенный полисахарид, экстрагированный из C. Deserticola из Синьцзяна, проявлял некоторые свойства адъювантов. Например, WPCD усиливал ответы как Th1, так и Th2, активируя DC, увеличивая ответы антител, улучшая продукцию цитокинов. Кроме того, мы исследовали механизм эффективности WPCD, анализируя созревание и функционирование ДК через путь TLR4 in vitro. У мышей, получавших только WPCD, явных побочных эффектов не наблюдалось. Следовательно, WPCD обладал более высокой иммуностимулирующей активностью в клеточном и гуморальном иммунных ответах. Адъюванты представляют собой смесь нескольких соединений. Смесь нескольких сырых экстрактов может иметь более выраженный положительный эффект, чем экстракт одного растения. Необходимо систематически исследовать экстракты WPCD, проверять их эффективность и безопасность, а также выяснять механизмы их действия.

Вспомогательная информация

Файл S1. ПРИБЫТИЕ Контрольный список. (DOCX)

Благодарности

Выражаем особую благодарность Bing Wang и Daocheng Wu за хорошие идеи в экспериментах.

Вклад автора

Концептуализация: Айлиан Чжан, Бинь Ван, Даочэн Ву.

Курирование данных: Сюмэй Ян, Ю Ян. Формальный анализ: Айлиан Чжан, Цюаньсяо Ли.

Получение финансирования: Айлиан Чжан. Администрация проекта: Айлиан Чжан.

Ресурсы: Ailian Zhang, Gan Zhao. Написание – оригинальный проект: Ailian Zhang.

Написание – рецензирование и редактирование: Айлиан Чжан, Даочэн Ву.