Дизайн In Silico беспорядочной химерной мультиэпитопной вакцины против Mycobacterium Tuberculosis Часть 2

 2.15. Обзор конструкции мультиэпитопной вакцины

На рис. 1 обобщена общая концепция конструкции этой многоэпитопной вакцины. Вкратце, мы проанализировали антигенность белков M.tuberculosis, полученных из IEDB, и отобрали восемь антигенов-кандидатов для создания мультиэпитопной вакцины с учетом их функциональной классификации и субклеточной локализации. Затем мы предсказали антигенные эпитопы этих восьми белков и выбрали 15 эпитопов CTL, 16 эпитопов HTL и 10 эпитопов B-клеток, которые были дополнительно связаны с адъювантом HBHA и PADRE через подходящие линкеры. Кроме того, мы предсказали антигенность, аллергенность, физико-химические свойства и иммуногенный профиль разработанной мультиэпитопной вакцины. Между тем, мы также предсказали вторичную и третичную структуры вакцины и проанализировали ее потенциальное взаимодействие с иммунным рецептором TLR4.

Микобактерии туберкулеза – распространенный возбудитель туберкулеза. Белок Mycobacterium tuberculosis является одним из основных компонентов Mycobacterium tuberculosis, который очень важен для функции иммунной системы человека.

Белок микобактерии туберкулеза может активировать иммунную систему человека и повысить иммунитет организма. При заражении организма микобактериями туберкулеза иммунная система человека вызывает ряд иммунных реакций, включая активацию и пролиферацию специфических Т- и В-клеток. Эти клетки могут высвобождать различные иммунные факторы, такие как интерферон, интерлейкин и т. д., а также антитела, помогающие организму сопротивляться вторжению микобактерий туберкулеза.

Кроме того, белок Mycobacterium tuberculosis также может регулировать баланс иммунной системы и предотвращать иммунные повреждения, вызванные чрезмерной активацией иммунного ответа организма. В последние годы исследования и разработки противотуберкулезных вакцин также в основном были сосредоточены на применении белка Mycobacterium tuberculosis, который может повышать иммунитет иммунной системы человека посредством вакцинации и эффективно предотвращать возникновение и распространение туберкулеза.

Поэтому белок Mycobacterium tuberculosis очень важен для воздействия на иммунитет человека. Активно укрепляя иммунную систему, с помощью правильных физических упражнений и разумного питания, вы сможете лучше предотвратить туберкулез и другие инфекционные заболевания и сохранить хорошее здоровье. С этой точки зрения нам необходимо повышать свой иммунитет. Цистанхе может значительно улучшить иммунитет, потому что полисахариды в мясе могут регулировать иммунный ответ иммунной системы человека, улучшать стрессоустойчивость иммунных клеток и повышать иммунитет иммунных клеток. Бактерицидный эффект.

Нажмите Цистанхе пустынная добавка

3. Результаты

3.1. Извлечение белков M.tuberculosis для конструирования мультиэпитопной вакцины

Для создания мультиэпитопной вакцины против туберкулеза мы сначала проанализировали антигенность белков M. tuberculosis H37Rv. Всего из базы данных IEDB было получено 492 белка с подтвержденными иммунологическими свойствами, из которых 402 белка (81,70%) были предсказаны как антигенные. Для функциональной характеристики этих 492 белков 353 были добавлены в базу данных DAVID, а 139 — нет. Анализ локализации показал, что 97 из 353 обогащенных белков были локализованы во внеклеточном компартменте, пространстве за пределами клеточной поверхности. Белки, локализованные во внеклеточном компартменте, включают белки внешней мембраны и секретируемые белки.

Среди 97 белков 49 являются белками секреции. Дальнейшее обогащение 49 секретируемых белков показало, что пять белков секретируются во внеклеточное пространство и пять необходимы для патогенеза (экспериментально подтверждено BioCyc) [48]. Более того, когда эти десять белков были сопоставлены с общими белками H. sapiens, два белка (Mpt83 и Mpt70) оказались очень похожими на белки H. sapiens. Поэтому оставшиеся восемь белков, не сходных с белками H. sapiens (табл. 1), считались окончательными кандидатами на создание мультиэпитопной вакцины.

3.2. Прогнозирование Т-клеточных и В-клеточных эпитопов белков-кандидатов

Перед предсказанием эпитопов идентифицировали сигнальные пептиды и удаляли их из белков-кандидатов. NetMHCpan предсказал в общей сложности 623 эпитопа CTL из восьми белков-кандидатов со 135 сильными связывателями (16 из A1, 40 из A2, 22 из A3, 19 из A24 и 38 из супертипов B7 MHC класса I).{{12} }.1 сервер (рис. 2А, Б). Среди 135 сильных связующих 36 были как антигенными, так и иммуногенными. Наконец, мы выбрали 15 из 36 эпитопов CTL в соответствии со следующими критериями: три эпитопа на супертип и по крайней мере один на белок-кандидат (Примечание: EsxA не имел сильного связывающего вещества, которое было бы одновременно антигенным и иммуногенным) (таблица 2).

Более того, мы предсказали их эпитопы HTL (эпитопы MHC класса II). Эпитопы {{0}}mer из четырех аллелей (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ и H-2-I) с процентное ранжирование Меньше или равно 2.0 считались сильными связующими и ранжировались от самого низкого до самого высокого балла. Аллели HLA-DR имели наибольшее количество связывателей MHC II (2990), а HLA-DP - наименьшее (601) (рис. 2C, D). Следует отметить, что в иммунном ответе при гранулематозных заболеваниях, таких как туберкулез, лепра и саркоидоз, преобладают IFN-продуцирующие Т-хелперные -1 (Th1) клетки [97]. Кроме того, в предыдущих сообщениях было показано, что у больных туберкулезом снижается экспрессия цитокинов Th1 (IFN- и IL2) [98]. Поэтому для стимуляции клеток Th1 мы предсказали 15-mer IFN- -индуцирующие пептиды этих белков. Всего с использованием NetMHCIIpan 4.0 было предсказано 534 эпитопа с IFN-индуцирующей активностью, из которых 315 эпитопов являются антигенными. Из этих 315 эпитопов 103 проявляли сильную связывающую активность по крайней мере с одним аллелем HLA.

Кроме того, полиморфизм аллелей HLA приводит к аллельным вариациям, что приводит к широко различающимся специфичностям связывания пептидов [55]. В результате мы выбрали один эпитоп с самой сильной связывающей активностью (самый неразборчивый эпитоп) из каждого из восьми белков-кандидатов. Кроме того, оставшиеся 95 эпитопов ранжировали на основе силы связывания, а затем отбирали дополнительные восемь эпитопов, максимум два эпитопа на белок-кандидат. Наконец, мы выбрали 16 из 103 эпитопов HTL в соответствии со следующими критериями: по крайней мере один эпитоп и максимум три эпитопа на белок-кандидат, самая сильная связывающая активность на белок-кандидат и наиболее антигенная и IFN-индуцирующая. Затем мы использовали их для создания этой многоэпитопной вакцины (таблица 2).

Что касается предсказания линейного В-клеточного эпитопа, использовали два сервера (BepiPred2.0 и ABCpred) и получили 166 эпитопов. Мы предсказали антигенность первых пяти эпитопов для каждого белка, а затем выбрали десять антигенных эпитопов (16-mer, по крайней мере, один из каждого белка-кандидата) (таблица 2).

3.3. Создание многоэпитопной вакцины

Для конструирования мультиэпитопной вакцины эпитопы HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL и 10 линейных B-клеток (16-mer) соединяли через соответствующие линкеры и заканчивали His. × 6 тег (рис. 3). Адъюванты являются важными компонентами вакцин, которые могут усиливать врожденный и адаптивный иммунный ответ [99]. Многие белки M. tuberculosis обладают адъювантными свойствами и использовались для создания вакцин [17, 27, 87, 100–105]. Одним из наиболее широко используемых является HBHA [100–105], который является мощным иммуностимулятором, индуцирующим созревание дендритных клеток (DC) посредством процессинга TLR4 [105,106]. Было обнаружено, что DC, обработанные HBHA, активируют наивные Т-клетки, поляризуют CD4 плюс и CD8 плюс Т-клетки для секреции IFN- и индуцируют цитотоксичность, опосредованную Т-клетками [47].

В этом исследовании мы поместили HBHA в качестве белкового адъюванта на N-конце, потому что он подходит для инициации синтеза вакцинной конструкции из HBHA, встречающегося в природе белка. HBHA ранее помещали на N-конец некоторых мультиэпитопных вакцин в качестве адъюванта [105, 107]. В дополнение к адъювантам PADRE, который безопасен для человека, может значительно повысить иммуногенность вакцины, поскольку он с высокой аффинностью связывается с несколькими аллелями MHC-II мыши и человека с высокой аффинностью, чтобы индуцировать опосредованные Th-клетками ответы [47,62]. HBHA и PADRE были соединены спиральным линкером PEAK, который обеспечивает жесткость при разделении двух белковых компонентов для повышения эффективности и уменьшения интерференции. Кроме того, солевой мостик Glu-Lys, образованный внутри сегментов, стабилизировал линкер.

Поскольку PADRE может усиливать активность эпитопов вакцинных HTL [54], мы поместили 16 эпитопов HTL после PADRE. Линкер GPGPG использовался для связывания эпитопов HTL друг с другом и с PADRE, поскольку он способствует прогрессированию иммунных клеток и представлению эпитопов [108, 109]. Кроме того, GPGPG индуцирует иммунный ответ HTL, который может нарушать иммуногенность соединения и восстанавливать иммуногенность отдельных эпитопов после процессинга [108].

Для 15 эпитопов CTL к отдельному эпитопу присоединен линкер AAY, который помогает эпитопу создавать подходящие сайты для связывания с транспортером TAP и усиливать презентацию эпитопа [47]. Кроме того, всю субъединицу эпитопа CTL связывали с расположенными выше эпитопами HTL через линкер HEYGAEALERAG, который имеет пять соответствующих сайтов расщепления (A7-L8, A5-E6, Y3-G4, R 10-A11 и L8-E9), необходимые для эукариотических протеасомных и лизосомных систем деградации. У эукариот протеасомы и лизосомы являются наиболее важными протеолитическими механизмами, которые используют убиквитин-протеасомную систему (UPS) и путь аутофагии соответственно [110].

Линкер HEYGAEALERAG также использовали для связывания субъединицы эпитопа CTL с 10 расположенными ниже линейными эпитопами B-клеток, связанными вместе линкерами KK. Согласно предыдущим исследованиям, линкер KK предотвращает индукцию антител в аминокислотную последовательность, полученную в результате комбинации двух пептидов, тем самым облегчая специфическое отображение каждого пептида на антителе [111]. Наконец, к С-концу последнего линейного В-клеточного эпитопа прикрепляли метку His×6 для последующей очистки и характеристики вакцины (фиг. 3).

Конечный химерный белок состоит из 933 аминокислотных остатков, начиная с адъюванта HBHA, за которым следует 41 эпитоп и заканчивая меткой His×6 (рис. 3). Поскольку этот химерный белок состоит из мультиэпитопных антигенов из восьми белков, мы назвали его MTBV8, мультиэпитопная противотуберкулезная вакцина, полученная из 8 белков-кандидатов.

3.4. Анализ антигенности, аллергенности и физико-химических показателей MTBV8

Предыдущие исследования показали, что антигенность необходима вакцинам для человека, чтобы вызывать гуморальные иммунные ответы, приводящие к образованию клеток памяти, направленных против эпитопов инфекционных агентов [112]. Таким образом, мы предсказали антигенность мультиэпитопной вакцины MTBV8 с помощью сервера VaxiJen 2.0 и получили антигенность 0,97, что значительно превышает пороговое значение ({{7}). }.4) [45,46] для того, чтобы бактериальный белок считался антигенным. Примечательно, что MTBV8 был более антигенным, чем все составляющие его белки (рис. 4), что позволяет предположить, что он может эффективно стимулировать иммунный ответ хозяина.

Кроме того, сообщалось, что многие микробные макромолекулы могут вызывать реакции гиперчувствительности у людей [113]. Чтобы проанализировать проблему гиперчувствительности MTBV8 и восьми составляющих белков, мы предсказали их аллергенность с помощью сервера AllerTOP 2.0. Было предсказано, что два из восьми компонентов белка (LprA и EspC) являются аллергенами (таблица 1). Следует отметить, что хотя разработанная мультиэпитопная вакцина (MTBV8) содержала десять эпитопов, полученных из этих двух белков, было предсказано, что она не вызывает аллергии, что указывает на безопасность этой вакцины.

Чтобы дополнительно охарактеризовать MTBV8, мы проанализировали его физико-химические свойства с помощью сервера ExPASy ProtParam. Рекомбинантный белок имеет молекулярную массу 94,84 кДа и изоэлектрическую точку 8,91. Более того, белок считался стабильным с расчетным индексом нестабильности (II) 26,44 (нестабильными считались белки с индексом нестабильности > 40) [64]. Предполагаемый период полувыведения in vitro составляет 30 ч в ретикулоцитах млекопитающих, больше, чем 20 ч в естественных условиях в дрожжах и 10 ч в естественных условиях в E. coli. Кроме того, алифатический индекс MTBV8 составлял 71,91, а общее среднее значение гидрофильности (GRAVY) составляло -0,32, что указывает на гидрофильность рекомбинантного белка. Наконец, значение пропорциональной растворимости для MTBV8 (0,54) было выше, чем среднее значение для набора данных населения (0,45), что указывает на то, что вакцина-кандидат была более растворима, чем половина белков E. coli [114]. Приведенные выше результаты показали, что MTBV8 обладает хорошими физическими и химическими свойствами и подходит для использования в качестве вакцины.

3.5. Иммуногенный профиль MTBV8

Чтобы оценить профиль иммуногенности MTBV8, мы проанализировали иммунные ответы in silico с помощью иммунного сервера C-IMMSIM. Как показано на фиг. 5А, титры IgM и IgG1 существенно повышались после вторичной иммунной стимуляции MTBV8. При этом уровень активных В-клеток увеличивался и оставался на высоком уровне после каждой иммунизации (фиг. 5Б). Даже для В-клеток в плазме изотипы В IgM и IgG1 оставались высокими после иммунизации (дополнительная рис. 1А, В). Что касается влияния на Т-клетки, уровни Th-клеток памяти (y2) (дополнительная рис. 1C) и активных Th-клеток (рис. 5C) быстро увеличивались после первичной иммунизации и значительно повышались после вторичной иммунизации. Регуляторные Т-клетки (преимущественно активные клетки) стимулировались при начальной иммунизации, а затем быстро снижались (дополнительная рис. 1D). Интересно, что уровень активных цитотоксических Т (Тс)-клеток быстро увеличивался после первичной иммунизации, оставался высоким при второй иммунизации, а затем неуклонно снижался, тогда как покоящиеся Тс-клетки демонстрировали обратную тенденцию по сравнению с активными Тс-клетками (рис. 5D). Напротив, уровни анергических (y2) Tc-клеток (рис. 5D) и клеток памяти Tc (дополнительная рис. 1E) оставались неизменными после иммунизации. Кроме того, следует отметить, что уровни иммунных факторов IFN- и IL-2, секретируемых Т-клетками, которые являются критическими для иммунного ответа против M.tuberculosis [115], также значительно повышались после иммунизации MTBV8 (рис. 5Е).

Кроме того, мы предсказали влияние вакцинации MTBV8 на популяции клеток врожденного иммунитета (рис. 5F и дополнительный рис. 1FH). Представление -2 клеток в DC и макрофагах быстро увеличивалось при первой иммунизации, тогда как после второй иммунизации наблюдалось лишь небольшое увеличение (рис. 5F и дополнительная рис. 1G). Кроме того, в макрофагах первая иммунизация приводила к одновременному увеличению или уменьшению количества активных и покоящихся макрофагов. Через несколько недель после второй иммунизации количество активных макрофагов быстро уменьшалось, тогда как количество покоящихся макрофагов быстро увеличивалось. (Дополнительный рис. 1G). Примечательно, что естественные клетки-киллеры и популяции активных эпителиальных клеток демонстрировали довольно постоянный характер после иммунизации. (Дополнительный рис. 1F, H). В совокупности эти прогнозы предполагают, что MTBV8 может сильно стимулировать как врожденный, так и адаптивный иммунный ответ, что делает его потенциально эффективным кандидатом на вакцину.

3.6. Прогнозируемые вторичные и третичные структуры MTBV8

Чтобы лучше охарактеризовать MTBV8, мы предсказали его вторичную и третичную структуры с последующим уточнением его третичной структуры. Вторичная структура MTBV8 состояла из 42,12% спиралей, 11,79% нитей и 46,09% катушек (дополнительная рис. 2). Согласно предсказаниям DISOPRED3, 27,11% аминокислотных остатков были разупорядочены.

Третичная структура MTBV8 была предсказана сервером I-TASSER, и было получено 5 моделей с хорошими C-показателями. C-оценка находится в диапазоне от -5,0 до 2,0 и пропорциональна надежности прогноза. Эти модели были подвергнуты анализу ProSA-web, и модель 4 была выбрана из-за следующих характеристик; Оценка C=-3,8, оценка Z=-4,4. Анализ графика Рамачандрана этой третичной структуры показал, что менее 70,0 процентов остатков находились в предпочтительных областях, поэтому требуется дальнейшее уточнение третичной структуры.

Третичная структура, полученная I-TASSER, была уточнена сервером ModRefiner, а затем сервером GalaxyRefine для создания пяти моделей. Среди пяти уточненных моделей модель 2 имела наилучшую структуру при рассмотрении следующих параметров: высокая точность теста глобального расстояния (0,89), RMSD (0,58), MolProbity (2,31), коллизия оценка (14,8), плохая оценка ротамера ({{10}},80) и оценка графика Рамачандрана (86,5 процента) (рис. 6А). Анализ графика Рамачандрана этой структуры с использованием PROCHECK показал, что из 753 неглициновых, непролиновых и неконцевых остатков 78,9% находились в наиболее благоприятной области [A, B, L], 17,3% находились в наиболее благоприятной области [A, B, L]. дополнительно разрешенная область [a, b, l, p] и 1,5 % в общеразрешенной области [∼a, ∼b, ∼l, ∼p] и только 2,4 % в запрещенной области (рис. 6B). При анализе графика Рамачандрана уточненной структуры с помощью Molprobity мы обнаружили, что 86,5% аминокислотных остатков расположены в благоприятной области, что соответствует данным, полученным сервером GalaxyRefine (рис. 6C). . Кроме того, 98,0% остатков находились в допустимой области, а 19 остатков были выбросами (phi, psi) (рис. 6C). Хотя уточненная модель имеет больше остатков в предпочтительной области по сравнению с моделью, созданной I-TASSER, она нуждается в дальнейшей проверке.

Проверка модели является ключевым шагом в процессе построения модели, поскольку она может выявить потенциальные ошибки в прогнозируемых 3D-моделях [116]. Для проверки уточненной модели MTBV8 были проведены анализы ProSA-web и ERRAT. Анализ ProSA-web показал Z-показатель -5,76 для MTBV8 (рис. 6D), что немного выходит за пределы экспериментально определенного диапазона значений для белков аналогичного размера. Однако анализ ERRAT показал общий коэффициент качества 70,94 для уточненного MTBV8. Поскольку показатель ERRAT выше 50 представляет собой модель хорошего качества [117], показатель 70,94 указывает на высокую степень достоверности смоделированной структуры для последующего анализа.

3.7. Молекулярная стыковка MTBV8 с рецепторами иммунных клеток

Сильное сродство вакцин к рецепторам иммунных клеток вызывает стабильный иммунный ответ [118]. Чтобы получить представление о потенциальных взаимодействиях между MTBV8 и рецепторами иммунных клеток, мы провели молекулярную стыковку между MTBV8 и иммунным рецептором TLR4 (рис. 7A и B). Предыдущие исследования показали, что лиганды TLR4 могут активировать DC, которые, в свою очередь, активируют наивные Т-клетки, эффективно поляризуют Т-клетки (CD4 плюс и CD8 плюс клетки) для секреции IFN и индукции опосредованной Т-клетками цитотоксичности [106]. Эти процессы приведут к увеличению пула эффекторных клеток памяти [119]. Поскольку взаимодействие TLR4 с антигенными пептидами приводит к ответу на туберкулезную инфекцию, мы сосредоточились на взаимодействии между MTBV8 и TLR4 (рис. 7А). Результаты молекулярного докинга от Firedock показали, что наиболее предпочтительная уточненная модель имеет глобальную энергию -40,28, энергию Ван-дер-Ваальса притяжения (aVdW) -19,86, энергию отталкивания (красный) 2,19, энергию атомного контакта. 4,70 и вклад водородной связи (HB) -1,03 (рис. 7B). Кроме того, Prodigy предсказал, что энергия связи между TLR4 и MTBV8 составит -8,6 ккал/моль. Приведенные выше результаты показали, что MTBV8 имеет сильное сродство к TLR4, что позволяет ему генерировать стабильный иммунный ответ.

3.8. Моделирование молекулярной динамики

Молекулярно-динамическое моделирование использовалось для анализа движения атомов в вакцине [120]. Деформируемость основной цепи показывает, в какой степени молекула может деформироваться по каждому составляющему остатку. Области высокой деформации указывали на положение «шарнира» цепи (рис. 7C), а экспериментальный коэффициент B был получен из соответствующего банка данных PDB, а расчет выполнялся путем умножения подвижности NMA на 8pi ^ 2 (рис. 7D). ). Собственное значение, присвоенное каждой нормальной моде, является мерой жесткости движения, которая напрямую связана с энергией деформации всей конструкции. Собственное значение прямо пропорционально легкости деформации (рис. 7Е). Дисперсия каждой нормальной моды обратно пропорциональна собственному значению. Индивидуальные отклонения окрашены в коричневый цвет, а совокупные отклонения окрашены в зеленый цвет) (рис. 7F). В ковариационной матрице существует связь между парами остатков, и были отображены коррелированные (красный), некоррелированные (белый) и антикоррелированные (синий) движения (рис. 7G). Сеть эластичности представляла собой пары атомов, соединенных пружинками, а каждая точка представляла пружинку между соответствующими парами атомов. Цвет точек означал их жесткость; более темные серые точки иллюстрируют более жесткие пружины и наоборот (рис. 7H). Моделирование молекулярной динамики с использованием сервера iMODS показало, что стыковочный комплекс между MTBV8 и TLR4 был стабильным.

3.9. Оптимизация in silico и клонирование MTBV8

Синтез белка является необходимым условием его активности [121]. В соответствии с этим повышенная транскрипционная и трансляционная эффективность вакцины необходима для ее сверхэкспрессии в клетках E. coli посредством самореплицирующейся плазмиды pET28a(plus) [103]. Таким образом, его оптимизация была достигнута за счет индекса адаптации кодонов (CAI) 0,99 и содержания GC (54,81 процента) от 30 до 70 процентов, которые обычно считаются благоприятными для экспрессии белка в организме хозяина. Фрагмент ДНК mtbv8 может быть клонирован в вектор pET-28a(plus) между сайтами рестрикции NcoI и XhoI с использованием SnapGene для создания рекомбинантной плазмиды pET-28a(plus)-mtbv8 (дополнительная рис. .3).

4. Дискуссия

4.1. Появление многоэпитопных вакцин против туберкулеза

Вакцинация – самый надежный способ борьбы с туберкулезной инфекцией. На протяжении многих лет ученые выявляли множество многообещающих вакцин-кандидатов, которые могли бы заменить БЦЖ, единственную одобренную противотуберкулезную вакцину [8100, 122–125]. В последнее время все большее внимание уделяется рекомбинантным противотуберкулезным вакцинам. Несколько рекомбинантных вакцин продемонстрировали эффективность в доклинических и клинических испытаниях, в том числе ID93/GLA-SE, состоящая из четырех вакцин-кандидатов Rv2608 (семейство PE/PPE), Rv1813 (экспрессируется в условиях стресса/гипоксии), ESXV и ESXW, которые являются многообещающими в доклинические испытания на мышах [122]. Что касается клинических испытаний, GamTBvac, полученный путем слияния Ag85a и ESAT6-CFP10, был успешным в испытаниях фазы I [125], в то время как M72, состоящий из двух кандидатов [Mtb39A (PPE18) и Mtb32A], показал значительную эффективность в фазе II испытания [123].

Успешные испытания этих рекомбинантных вакцин указывают на большую эффективность вакцин на основе эпитопов, которые просто включают иммунологические свойства различных белков-кандидатов в синтетический белок [124]. Примечательно, что несколько противотуберкулезных субъединичных вакцин были получены из большого числа вакцин-кандидатов, и они стали потенциально привлекательными кандидатами в исследованиях на животных моделях [100]. Например, MP3RT, многоэпитопная пептидная противотуберкулезная вакцина-кандидат, состоящая из шести иммуногенных пептидов HTL, индуцировала значительно более высокие уровни IFN- и CD3 плюс IFN- плюс Т-лимфоциты и более низкие колониеобразующие единицы (КОЕ) в легких и селезенке гуманизированных мышей, чем мыши дикого типа [8]. В дальнейшем исследования по повышению эффективности этих вакцин привели к обогащению потенциальных белков-кандидатов.

Кроме того, белки, секретируемые M. tuberculosis, также учитывались при разработке MTBV8 (таблица 1), поскольку они важны для патогенеза и вирулентности ТБ [126]. Кроме того, полезными антигенами могут служить некоторые секретируемые белки наружных слоев клеток М.tuberculosis. Например, EsxA и EsxB были выделены из капсулы M.tuberculosis [127], и сохранение EsxA в капсуле было связано с цитотоксичностью [128]. Кроме того, EsxA необходим для целостности клеточной стенки бактерий [129]. В целом, секретируемые белки имеют достаточно открытые поверхности, так что они становятся мишенями иммунного ответа хозяина [130, 131].

4.2. Потенциальная стимуляция врожденной иммунной системы MTBV8

Скрининг эпитопа в белках-кандидатах включает активацию врожденной иммунной системы с последующим распознаванием антигена лимфоцитами, поскольку оба фактора необходимы для последующей активации адаптивной иммунной системы [50]. Для врожденного ответа важно образование стабильного комплекса между MTBV8 (с помощью стимулятора TLR4 HBHA в качестве адъюванта) и TLR4 DCs (рис. 5F), поскольку лиганды TLR4 могут активировать DCs, а активированные DCs могут, в свою очередь, активировать наивные Т-клетки эффективно поляризуют CD4 плюс и CD8 плюс Т-клетки для секреции IFN- и индуцируют опосредованную Т-клетками цитотоксичность [106] и впоследствии увеличивают пул эффекторных клеток памяти [119].

Этот комплекс, вероятно, способствовал увеличению популяции клеток памяти (y2) в B-лимфоцитах (дополнительная рис. 1A) и Th-лимфоцитах (дополнительная рис. 1C) по сравнению с клетками, не относящимися к памяти. Иммунная стимуляция MTBV8 сравнима со стимуляцией других многоэпитопных вакцин против туберкулеза [33,37,39] и других заболеваний [27,62,107,124,132]. Это намекало на постоянство механизма многоэпитопной вакцины.

4.3. Потенциальная стимуляция адаптивной иммунной системы MTBV8

В- и Т-лимфоциты являются первичными эффекторными клетками, которые координируют адаптивные иммунные ответы посредством гуморального или клеточно-опосредованного иммунитета путем распознавания частей вторгшихся патогенов, называемых антигенами [50]. Чтобы вызвать гуморальный адаптивный иммунный ответ, мы включили В-клеточные эпитопы с высокими показателями (таблица 2) для распознавания и разрушения антителами, экспрессируемыми и секретируемыми В-лимфоцитами [50, 133]. Вакцинная стимуляция активных B-лимфоцитов (рис. 5B), в основном IgM- и IgG 1-секретирующих B-клеток (дополнительный рис. 1A), может привести к чрезмерной секреции IgM и IgG1 (рис. 5A).

Высокая антигенность вакцины (фиг. 4) может иметь важное значение для усиления ответов антител (фиг. 5А). Действительно, клеточно-опосредованные иммунные ответы сильно зависят от способности Т-клеток распознавать антигены [134]. Для этого мы выбрали сильные антигенные и сильные MHC-связывающие эпитопы CTL и HTL (таблица 2), которые повышали стабильность комплекса пептид: MHC (pMHC), что является ключевым фактором, контролирующим иммуногенность пептида MHC [135] и играющим роль в примирование CD8 плюс и CD4 плюс Т-клеток DC, что приводит к ответам Т-лимфоцитов (рис. 5C, дополнительная рис. 1C) [136].

Включение соответствующих линкеров и синтетических олигопептидов (PADRE и HEYGAEALERAG) и точное расположение каждого компонента может облегчить процессинг и презентацию эпитопа (рис. 3). Из-за изменчивости аллелей среди людей мы выбрали эпитопы CTL на основе распознавания аллелей MHC-I основных рас человека, дополнительная таблица 1 (таблица 2), а беспорядочные эпитопы HTL были выбраны после скрининга на свойства и антигенность, индуцирующие IFN.

4.4. Перспективы развития МТБВ8

Этот дизайн вакцины in silico является важным индикатором на этапах скрининга с точки зрения синтеза и эффективности вакцин-кандидатов. Что касается синтеза, наши прогнозы показали, что он может быть синтезирован в системе E. coli, однако другие системы, такие как клетки насекомых и млекопитающих, также могут быть рассмотрены, если системы на основе E. coli представляют трудности. Влажная лабораторная валидация является следующим этапом подтверждения вакцин-кандидатов после исследований in silico. Этот метод действительно эффективно использовался в некоторых вакцинах-кандидатах, которые также сначала были разработаны in silico, а затем доказали свою эффективность на экспериментальной фазе [137].

5. Вывод

Ключевой поддержкой Цели устойчивого развития ВОЗ по полной ликвидации ТБ является доступ к эффективной вакцине для предотвращения заражения M.tuberculosis. Предыдущие исследования показали, что химерные мультиэпитопные вакцины могут использовать иммунные/антигенные свойства определенных белков для повышения иммунной эффективности. В этом исследовании мы использовали подход in silico для разработки химерной вакцины (MTBV8) путем интеграции 41 случайного эпитопа, полученного из восьми антигенных белков, секретируемых M. tuberculosis H37Rv. Предполагалось, что MTBV8 будет стабильным, растворимым, безопасным, высокоантигенным и иммуногенным.

Иммуноинформатический анализ показал, что MTBV8 проявляет хорошее сродство к основному рецептору иммунных клеток TLR4. Важно отметить, что вакцинация, стимуляция MTBV8, может значительно увеличить уровни В-клеток, Т-клеток и популяций врожденных иммунных клеток и стимулировать выработку иммуноглобулинов (IgG1, IgM и т. д.), а также иммунных факторов (IFN-, IL {{6). }}, и т. д). В совокупности мультиэпитопная вакцина MTBV8 является важным показателем на этапе разработки противотуберкулезных вакцин и может стать краеугольным камнем в реализации «Стратегии ликвидации туберкулеза».

Заявление об авторском вкладе

Бинда Т. Андонгма: концептуализация, методология, программное обеспечение, написание - первоначальный проект. Ячжэн Хуанг: обработка данных, программное обеспечение. Фан Чен: Программное обеспечение, визуализация. Цин Тан: сбор данных, формальный анализ. Мин Ян: Программное обеспечение, визуализация. Шан-Хо Чоу: Написание - обзор и редактирование. Xinfeng Li: концептуализация, методология, программное обеспечение, привлечение финансирования. Jin He: надзор, написание – просмотр и редактирование, привлечение финансирования.

Декларация о конкурирующих интересах

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32200026, 31900057), открытыми фондами Государственной ключевой лаборатории сельскохозяйственной микробиологии (AMLKF202108) и Китайским фондом постдокторских наук (2019M662654).

Приложение A. Дополнительная информация

Дополнительные данные, связанные с этой статьей, можно найти в онлайн-версии по адресу doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019.

Рекомендации

[1] Boineau R, Domanski M, Troutman C, Anderson J, Johnson G, Mcnulty SE, Clappchanning N, Davidson-ray LD, Fraulo ES, Fishbein DP, et al. Амиодарон или имплантируемый кардиовертер-дефибриллятор при застойной сердечной недостаточности. New Engl J Med 2005;352(3):225–37.

[2] Хошнуд С., Хейдари М., Хэйли М., Дранкур М., Дарбан-сарохалил Д., Насири М.Дж., Лохрасби В. Новые вакцины-кандидаты против Mycobacterium tuberculosis. Int J Biol Macromol 2018;120(Pt A):180–8.

[3] Kyu HH, Maddison ER, Henry NJ, Ledesma JR, Wiens KE, Reiner R, et al. Глобальное, региональное и национальное бремя туберкулеза, 1990-2016: результаты исследования глобального бремени болезней, травм и факторов риска 2016 года. Lancet Infect Dis 2018;18(12):1329–49.

[4] Всемирная организация здравоохранения (2022 г.). Доклад о глобальном туберкулезе. 〈https://www. ВОЗ. int/publications/i/item/9789240061729〉.

[5] Мирзаев Ф., Виней К., Линь Н.Н., Гонсалес-Ангуло Л., Гегиа М., Харамильо Э., Зигнол М., Касаева Т. Рекомендации Всемирной организации здравоохранения по лечению лекарственно-устойчивого туберкулеза, обновление 2020 г. Европейское дыхание J 2021;57(6):2003300.

[6] Ахмад Хан Ф., Фокс Г., Мензис Д. Лекарственно-устойчивый туберкулез. Нью-Йорк: Справочник по устойчивости к противомикробным препаратам Springer; 2017. с. 263–86.

[7] Митчисон Д., Дэвис Г. Химиотерапия туберкулеза: прошлое, настоящее и будущее. Int J Tube Lung Dis 2012;16(6):724–32.

[8] Gong W, Liang Y, Mi J, Jia Z, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sun S, Wu X. Вакцина MP3RT на основе пептидов индуцирует защитный иммунитет против инфекции Mycobacterium tuberculosis на гуманизированной мышиной модели. . Фронт Иммунол 2021;12:1–19.

[9] Lange C, Aaby P, Behr MA, Дональд PR, Kaufmann SHE, Netea MG, Mandalakas AM. 100 лет Mycobacterium bovis бацилле Кальметта-Герена. Lancet Infect Dis 2022;22(1):e2–12.

[10] Глазиу П., Флойд К., Равильоне М.С. Глобальная эпидемиология туберкулеза. Semin Respir Crit Care Med 2018;39(3):271–85.

[11] Эрнст Дж. Д. Механизмы уклонения от иммунного ответа M.tuberculosis как проблема разработки противотуберкулезной вакцины. Клеточный микроб-хозяин 2018; 24(1):34–42.

[12] Li X, Chen F, Liu X, Xiao J, Andongma BT, Tang Q, Cao X, Chou SH, Galperin MY, He J. Протеаза Clp и антисмысловая РНК совместно регулируют глобальный регулятор CarD, опосредуя ответ микобактериального голодания. eLife 2022; 11:1–22.

[13] Liu CH, Liu H, Ge B. Врожденный иммунитет при туберкулезе: защита хозяина против уклонения от патогенов. Cell Mol Immunol 2017;14(12):963–75.

[14] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, Hoang TTKT, Holst P, Thomsen AR, Andersen P, Dietrich J. Ответы Т-клеток CD4 и CD8 на M. tuberculosis Ag85B-TB10.4, стимулируемые адъювантной субъединицей, аденовектором или гетерологичной ревакцинацией. PLoS ONE 2009;4(4):e5139.

[15] Rossjohn J, Gras S, Miles JJ, Turner SJ, Godfrey DI, McCluskey J. Распознавание Т-клеточным антигенным рецептором антигенпрезентирующих молекул. Annu Rev Immunol 2015; 33:169–200.

For more information:1950477648nn@gmail.com