Введение in vivo консорциумов кишечных бактерий реплицирует метаботипы уролитина A и B на модели крыс, не продуцирующих уролитинⅠ

На протяжении десятилетий потребление эллаготаннинов (ЭТ) и эллаговой кислоты (ЭА) было связано с многочисленными биологическими эффектами, включая антиоксидантную, противораковую, противовоспалительную, антибактериальную и антирепликационную активность ВИЧ.1 Однако абсорбция и биодоступность ЭТ и ЭА очень плохие. Предыдущие исследования на людях показали, что выведение ЭА и ЭА-О-глюкуронида с мочой составляет менее 1% от поступления.2,3 Тем не менее, хотя абсорбция ЭТ и ЭА низкая, они далее метаболизируются микробиотой толстой кишки до уролитинов (Урос), которые отвечают, по крайней мере частично, за благотворное воздействие продуктов, богатых ЭТ и (или) ЭА.1,4

Нажмите, чтобы получить слабительное

Сначала ЭА высвобождается в результате гидролиза сложноэфирных связей ЭТ ферментом, известным как эллагитанза.5 ЭА подвергается дальнейшей деградации, образуя производные 6H-дибензо[b,d]пирана-6-она, называемые Урос. Этот каскад реакций начинается с расщепления лактонного кольца ферментом лактоназой, в результате чего образуется лютеиновая кислота, которая затем декарбоксилируется до пентагидрокси-Уро (Уро-М5). Последовательное дегидроксилирование превращает ее в тетрагидрокси-Урос (Уро-D, Уро-Е и Uro-M6) и тригидрокси-Uros (Uro-C, UroM7 и Uro-G), чтобы в конечном итоге получить дигидрокси-Uros (Uro-A и изоUro-A) и моногидрокси-Uro (Uro-B), причем последний обычно обнаруживается. когда также производится изоУро-А.1

Широкая вариативность метаболических профилей уро, обнаруженная у людей после употребления продуктов, богатых ЭТ, указывает на межиндивидуальные различия в микробиоте толстой кишки, ответственной за деградацию ЭТ. )фенолы.6,9 Это двустороннее взаимодействие между кишечной микробиотой и (поли)фенолами побудило научное сообщество сгруппировать популяцию на основе ихметаболический фенотип (металлический тип) для объяснения различий в эффектах полифенолов.10,11 Более конкретно, в соответствии с метаболизмом ET и EA, люди могут быть разделены на Урометаботипы (UM), связанные с составом и функциональностью микробиома кишечника.7,8,12

Три человеческих UM (UM-A, UM-B и UM-0), связанные с тремя различными профилями продукции уро, были описаны в западных и восточных популяциях.13–15 В этом отношении люди с метаботипом A (UM-A) производят несколько промежуточных уро, но только уролитин А (уро-А), основной абсорбируемый уро в этом UM, в конце микробного катаболического пути. Индивиды метаботипа B (UM-B) производят некоторое количество промежуточных уросов и три конечных уро, т.е. уролитин B (Uro-B), уролитин А (IsoUro-A) и уро-А, которые являются основными абсорбируемыми уросами в UM-B. Следовательно, промежуточные Уросы могут действовать преимущественно в кишечнике, тогда как конечные Урос могут оказывать местное и системное действие. до сих пор был обнаружен предшественник уролитин-М5, который не всасывается в кишечнике).

Различия в уропрофилях наблюдались между UM и вдоль толстой кишки, показывая преобладающую продукцию уро в дистальной области толстой кишки.16–19 Примечательно, что процент UM-0 у здоровых добровольцев из Испании и Китая составляет примерно 10% и может быть даже выше в популяция США.13–15 Бактерии родов Gordonibacter и Ellagibacter были идентифицированы как способные метаболизировать ЭА в некоторые Uros.20–23Однако было обнаружено, что некоторые промежуточные (например, Uro-D, Uro-E, Uro- M7 и Uro-G) и конечные Uros (Uro-A и Uro-B) не производятся в чистых культурах этих бактерий, что подразумевает необходимость наличия других бактерий для завершения набора Uros, которые формируют как UM-A, так и UM-B. . Недавно были идентифицированы консорциумы кишечных бактерий, участвующие в метаболизме ЭА с образованием уропродуцирующих метаботипов (UM-A и UM-B) in vitro.24

Бактериальные консорциумы, содержащие роды Gordonibacter плюс Enterocloster и Ellagibacter плюс Enterocloster, продуцировали in vitro уролитины, связанные с UM-A и UM-B соответственно.25 Однако способность этих бактериальных консорциумов воспроизводить человеческие Uro-профили, связанные с UM-A и UM-B, in vivo до сих пор неизвестно. Кроме того, безопасность употребления этих уро-продуцирующих бактерий в качестве новых пробиотиков до сих пор не определена, поскольку ранее они не тестировались на животных или людях. В настоящем исследовании вышеуказанные бактериальные консорциумы оценивались на предмет их способности колонизировать кишечник уро-непродуцирующих (UM-0-подобных) крыс и превращать их в уропродуценты, имитирующие UM-A и UM-B, соответственно. Также оценивалась безопасность этих бактериальных консорциумов. Кроме того, были разработаны две новые процедуры количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) для обнаружения и количественного определения эллагибактеров и энтероклостеров в образцах фекалий.

Материалы и методы

Химия и реагенты

Уросы были химически синтезированы и очищены компанией VillapharmaResearch SL (Технический парк Фуэнте Аламо, Мурсия, Испания). EA был куплен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Фосфатный буферный раствор (PBS) был получен от FisherScientific (США), а метанол, этанол и муравьиная кислота – от Panreac Química (Барселона, Испания). Растворители для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) были приобретены у JT Baker (Девентер, Нидерланды). На протяжении всего исследования использовалась сверхчистая вода Millipore (Бедфорд, Массачусетс, США). Все химикаты и реагенты имели аналитическую степень чистоты.

Получение бактериальных консорциумов

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T и энтероклостер CEBASS4A9, все они были выделены и идентифицированы в нашей лаборатории (CEBAS-CSIC, Испания), культивировались в анаэробных условиях в 5 мл Wilkins. - Анаэробная среда Чалгрена (WAM, Oxoid) в пробирках при 37 градусах в течение 48 часов в анаэробной камере Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Бридженд, Южный Уэльс, Великобритания) и ресуспендирована в PBS с добавлением 10% глицерина и 0,05% гидрохлорида L-цистеина (PanReac). Кимика, Барселона, Испания). После анаэробной инкубации были приготовлены консорциумы.24,25 Коротко говоря, «бактериальный консорциум А» содержал G. штаммы urolithinfaciens и E.bolteae; «бактериальный консорциум В» содержал культуры E. isourolithinifaciens и E.bolteae; и «контрольный коктейль» содержал стерильный PBS с 10% глицерина и 0,05% гидрохлорида L-цистеина. Перед введением все коктейли распределяли по аликвотам по 3,5 мл и хранили при температуре -80°С.

Животные, диеты и дизайн эксперимента

Протокол эксперимента (номер 624/2020) был одобрен местным правительством, Комитетом по биоэтике Национального исследовательского совета Испании (Мадрид, Испания) и Комитетом по этике экспериментов на животных Университета Мурсии (Испания). Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Европейского Союза относительно экспериментов на животных (Директива 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета о защите животных, используемых в научных целях). Крысы Вистар (n=18; 9 самок и 9 самцов) массой 240 ± 31 г были получены от Envigo (Барселона, Испания). Эта крысиная модель была выбрана на основании ее неспособности продуцировать урос, наблюдаемой в наших предварительных исследованиях, в которых тестировались образцы фекалий от различных крысиных моделей. Три группы (А, В и С) были сформированы путем случайного распределения по 6 животных в каждой (3 самки и 3 самца крыс). ) на группу (рис. 1).

Каждую группу крыс содержали в двух разных клетках, разделенных по полу, в помещении с контролируемой температурой (22 ± 2 градуса), относительной влажностью 55 ± 10% и контролируемым циклом света и темноты (12 часов). Крысы получали стандартный рацион (Teklad, Барселона, Испания), содержащий (%/100 г сырого веса) 14,3% белков (кукурузная клейковина), 48% углеводов (пшеничный отруб, молотая пшеница, молотая кукуруза) и 4% жиров (соевое масло). ), энергетическая плотность 2,9 ккал/г и 4,1% сырой клетчатки с добавлением порошка ЭА с чистотой не менее 95% (3,6 мг на 100 г мяса). ЭА смешивали гомогенно с измельченным стандартным кормом, повторно гранулировали и лиофилизировали. Рацион, обогащенный ЭА, хранили вдали от влаги и света. Доза ЭА, введеннаярацион крыс составлял примерно 0,72 мг на крысу в день (диета EA1x), эквивалентная доза для человека 41 мг в день -1,26. Все группы получали рацион EA 1x и водопроводную воду без ограничений на протяжении всего эксперимента ( 5 недель). Поскольку содержание ЭА, обнаруженное в образцах фекалий, было низким в течение первой недели, в последующие дни добавляли дополнительное количество ЭА. На 3-й неделе животным перорально через зонд вводили дополнительную дозу 1,5 мг ЭА на крысу в день, растворенную в воде (всего=ЭА 3× диета), которую давали только в течение 1 недели. Наконец, на 4-й неделе к рациону EA 1x добавляли ≈5 г грецких орехов на крысу в день (еще один источник ЭА) и поддерживали их до конца исследования, чтобы оценить влияние пищевой матрицы, содержащей ЭА, на способность бактерий. производить Урос. Вес, потребление пищи и воды измеряли каждый день. Консорциумы кишечных бактерий вводили перорально через желудочный зонд. Группа A получила 500 мкл бактериального коктейля A, группа B получила 500 мкл бактериального коктейля B, а группа C (контроль) получила 500 мкл PBS. Пероральный зонд проводили каждые 2 дня в течение первых двух недель и каждый день в течение следующих 2 недель. На последней неделе (дни с 28 по 32) животные продолжали получать ту же диету с добавлением ЭА и грецких орехов, но без перорального введения бактерий. В конце исследования животных умерщвляли с использованием камеры CO2.

Процедуры отбора проб

Во время исследования собирали образцы фекалий для анализа Uro с помощью UPLC-ESI-QTOF-MS/MS и микробиоты кишечника с помощью секвенирования гена 16S рРНК и кПЦР. Кровь брали в разные моменты времени (исходный уровень, 28-й день и конец исследования) для гематологического и биохимического анализа сыворотки. Образцы крови получали из хвостовой вены (≈500 мкл) и собирали в гепаринсодержащие пробирки исходно, а также на 28 и 32 дни (рис. 1). Разделение плазмы проводили сразу центрифугированием при 3000 g в течение 10 мин при 4 градусах и замораживали при - 80 градусов до дальнейшего определения серобиохимических показателей. Печень, почки и селезенку собирали, взвешивали и исследовали для выявления каких-либо морфологических различий при умерщвлении.

Разработка и оптимизация праймеров и зондов для количественного определения Ellagibacter и Enterocloster с помощью qPCR

Последовательности генов 16S рРНК Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T и E.bolted CEBAS S4A9 были получены из базы данных GenBank (база данных EMBL). Последовательности были сопоставлены с филогенетически близкими родами бактерий с помощью программного обеспечения для молекулярно-эволюционного генетического анализа (MEGA 11) и проверены на наличие областей консервативных и вариабельных последовательностей для разработки праймеров и зондов для обнаружения и количественного определения Ellagibacter и Enterocloster (таблица 1). Праймеры и зонд были разработаны и проверены с помощью инструментов Primer Questand Oligo Analyser соответственно (Integrated DNATechnologies, Inc., Бельгия). Зонд TaqMan был помечен на 5'- и 3'-концах 6-карбоксифлуоресцеиновой группой. (6FAM) и тушитель ежевики (барбекю) соответственно. qPCR выполняли с использованием системы обнаружения последовательностей ABI 7500. Конечные концентрации каждого праймера и зонда составляли 300 и 375 нМ для Ellagibacter и 200 и 500 нМ для Enterocloster. Для амплификации ДНК Ellagibacter иЭнтероклостер соответственно. Профиль нарастания Ellagibacteramplification составлял 1 цикл при 95 градусах в течение 5 минут, затем следовали 45 циклов при 95 градусах в течение 15 с, 50 ​​градусах в течение 40 с и 72 градусах в течение 31 с. Наконец, был добавлен 1 цикл при 72 градусах в течение 5 минут. . Профиль нарастания амплификации Энтероклостером составлял 1 цикл при 95 градусах в течение 5 минут, за которыми следовали 40 циклов при 95 градусах в течение 15 с, 65 градусах в течение 40 с и 72 градусах в течение 31 с. Наконец, был добавлен 1 цикл при 72 градусах в течение 5 минут.

Экстракция фекальной ДНК и микробиологический анализ кишечника

Экстракцию ДНК из образцов фекалий проводили с помощью набора для очистки тканевой ДНК NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Германия) в соответствии с инструкциями производителя с некоторыми модификациями. ДНК количественно определяли с помощью флуориметрии (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, Великобритания), а чистоту измеряли по коэффициенту поглощения при длине волны 260/280 нм (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, Великобритания). ). Состав кишечной микробиоты определяли путем секвенирования вариабельных областей V3 и V4 гена 16S рРНК в соответствии с протоколами Illumina (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) с длиной считывания 2 × 300 п.о. с парными концами (MiSeqReagent Kit v3). , Illumina Inc.). Метагеномное секвенирование проводили на платформе MiSeq-Illumina (служба секвенирования FISABIO, Испания). Обработку данных, удаление химерных последовательностей, выравнивание последовательностей и кластеризацию последовательностей генов 16S рРНК проводили, как описано в других источниках, для получения таксономической классификации.8,27 Амплификацию ДНК Gordonibacter осуществляли в системе кПЦР ABI 7500, как описано ранее.19,28 специфические праймеры и зонды, разработанные в настоящем исследовании, использовались в соответствии с протоколом кПЦР, описанным выше. Для количественного определения использовали стандартные кривые геномной ДНК Gordonibacter, Enterocloster и Ellagibacter. Все образцы фекалий анализировались в трех экземплярах.

Экстракция, обнаружение и количественное определение уролитинов в образцах фекалий.

Образцы фекалий ({{0}},2–0,5 г) экстрагировали в пропорции 1:10 раствором МеОН/H2O (8{{ 20}}/20), подкисляют 0,1% HCl и гомогенизируют путем встряхивания в течение 2 минут и встряхивания при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 10 минут в блочном нагревателе. Суспензию центрифугировали при 14 000g при 4 градусах в течение 10 минут, супернатант фильтровали через мембранный фильтр из ПВДФ 0,22 мкм (Millipore Corp., Бедфорд, Массачусетс) и разбавляли 3 раза МеОН (0,1% муравьиной кислоты). ) перед инъекцией в систему UPLC-ESI-QTOF-MS. Систему UPLC (Agilent 1290Infinity), соединенную с квадрупольной времяпролетной (QTOF) системой ВЭЖХ/МС (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Вальдбронн, Германия), использовали для анализа фекальных метаболитов с использованием метода градиентного элюирования, как описано ранее. 29,30 Вкратце, разделение осуществляли в обращенно-фазовой колонке Poroshell 120 EC-C18 с использованием воды и ацетонитрила, подкисленных 0,1% муравьиной кислотой, в качестве подвижных фаз. Скорость потока составляла 0,4 мл/мин, а объем инъекции – 5 мкл. Для обработки данных использовали программное обеспечение MassHunter Qualitative Analysis (версия B.10, Agilent Technologies, Вальдбронн, Германия). Все метаболиты были идентифицированы путем прямого сравнения со стандартами и подтверждены их молекулярной массой. Калибровочные кривые были получены для ЭА и различных Урос с хорошей линейностью (R2 > 0,99).

Гематология и клиническая химия

Гематологические переменные определяли в гепаринизированной крови с использованием автоматического гематологического анализатора со специальным программным обеспечением для образцов крови крыс (AVDIA 120, Siemens, Мюнхен, Германия). Анализируемыми переменными были средний объем эритроцитов (MCV), средний корпускулярный гемоглобин (MCH), средняя концентрация эритроцитного гемоглобина (MCHC), распределение эритроцитов (RDW), средний объем тромбоцитов (MPV), тромбоциткрит (PCT), ширина распределения тромбоцитов (PDW). средний тромбоцитарный компонент (MPC), средняя масса тромбоцитов (MPM), количество тромбоцитов (PLT), содержание гемоглобина в ретикулоцитах (CHr) и средний объем ретикулоцитов (MCVr). Биохимические показатели плазмы, кальций (Са) и фосфор (Р) анализировали с использованием химико-токсикологического анализатора Olympus AU400 (Beckman Coulter, Калифорния, США). Биохимическими переменными были общий белок (PROT), альбумин (ALBU), глобулин (GLOB), креатинин (CREA), глюкоза (GLUC), холестерин (CHOL), триглицериды (TRIGL), щелочная фосфатаза (ALP), гамма-глутамилтранспептидаза ( ГГТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ). Наконец, уровни тироксина (Т4) анализировали с использованием системы иммуноанализа IMMULITE® 1000 (Siemens).

статистический анализ

Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS версии 27.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США), и различия с p < 0,05. считались статистически значимыми. Нормальность данных оценивали с помощью теста Шапиро-Уилка. Сравнения между различными группами лечения проводились с использованием повторяющегося дисперсионного анализа (RM ANOVA) с апостериорным критерием Т3 Тьюки или Даннетта, в зависимости от того, соответствовали ли данные нормальному или ненормальному распределению соответственно. Различия между мужчинами и женщинами исследовали с использованием парного t-критерия Стьюдента или знаково-рангового критерия Уилкоксона, когда данные были нормально или ненормально распределены соответственно. Эффект размера линейного дискриминантного анализа хи-квадрат (LEfSe) использовался для выявления дифференциальных бактериальных особенностей между группами. Корреляция Пирсона использовалась для анализа возможных связей между переменными в данных с нормальным распределением, а корреляция Спирмена применялась в данных с ненормальным распределением. Графики данных были построены с использованием Sigma Plot 14.5 (Systat Software, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Натуральное растительное лекарственное средство для облегчения запоров — цистанхе

Цистанхе — род паразитических растений, принадлежащий к семейству Оробанховые. Эти растения известны своими лечебными свойствами и на протяжении веков использовались в традиционной китайской медицине (ТКМ). Виды цистанхе преимущественно встречаются в засушливых и пустынных регионах Китая, Монголии и других частях Центральной Азии. Растения цистанхе характеризуются мясистыми желтоватыми стеблями и высоко ценятся за свою потенциальную пользу для здоровья. В традиционной китайской медицине считается, что цистанхе обладает тонизирующими свойствами и обычно используется для питания почек, повышения жизненной энергии и поддержки сексуальной функции. Он также используется для решения проблем старения, усталости и общего благополучия. Хотя Цистанхе имеет долгую историю использования в традиционной медицине, научные исследования его эффективности и безопасности продолжаются и ограничены. Однако он содержит различные биологически активные соединения, такие как фенилэтаноидные гликозиды, иридоиды, лигнаны и полисахариды, которые могут способствовать его лечебным эффектам.

Wecistanche'sпорошок цистанхе, таблетки цистанхе, капсулы цистанхе,и другие продукты разрабатываются с использованиемпустыняцистанхев качестве сырья, все из которых хорошо влияют на облегчение запоров. Конкретный механизм таков: считается, что цистанхе обладает потенциальным преимуществом в облегчении запоров на основе его традиционного использования и определенных соединений, которые он содержит. Хотя научные исследования, посвященные влиянию цистанхе на запоры, ограничены, считается, что у нее есть несколько механизмов, которые могут способствовать ее способности облегчать запоры. Слабительный эффект:Цистанхеиздавна используется в традиционной китайской медицине как средство от запоров. Считается, что он обладает мягким слабительным эффектом, который может способствовать опорожнению кишечника и вызывать запоры. Этот эффект можно объяснить различными соединениями, обнаруженными в цистанхе, такими как фенилэтаноидные гликозиды и полисахариды. Увлажнение кишечника. При традиционном использовании считается, что цистанхе обладает увлажняющими свойствами, особенно воздействуя на кишечник. Содействие гидратации и смазке кишечника может помочь смягчить инструменты и облегчить его прохождение, тем самым облегчая запор. Противовоспалительный эффект: иногда запор может быть связан с воспалением пищеварительного тракта. Цистанхе содержит определенные соединения, в том числе фенилэтаноидные гликозиды и лигнаны, которые, как полагают, обладают противовоспалительными свойствами. Уменьшая воспаление в кишечнике, он может помочь улучшить регулярность дефекации и облегчить запоры.