Чувствительные к воспалению нанозимы, имитирующие каталазу, облегчают острое повреждение почек путем устранения локального окислительного стресса

Абстрактный

Предыстория:активные формы кислорода (АФК)и воспаление, важнейший фактор повреждения тканей, как хорошо известно, связано с различными заболеваниями. Почки чувствительны к гипоксии и уязвимы к АФК. Таким образом, возникает порочный круг междуокислительный стресси почечнаягипоксия критически способствуетк прогрессированиюхроническая болезнь почеки, наконец,терминальная стадия почечной недостаточности. Таким образом, доставка терапевтических агентов в очаг воспаления, богатый АФК, и высвобождение терапевтических агентов является возможным решением.

Новые травы для лечения заболеваний почек

Результаты: мы разработали универсальную наноплатформу с длительной циркуляцией, чувствительную к воспалению и улавливающую АФК, путем стабильной загрузки имитирующего каталазу 1-додекантиола, стабилизированного Mn3O4 (dMn3O4) наночастицы внутри АФК-чувствительных наноми‑клетках (PTC), в результате чего образуется АФК-чувствительный нанозим (PTC-M). Гидрофобный дМн3O4наночастицы были загружены внутрьМицеллы ПТК предотвращают преждевременное высвобождение во время кровообращения и действуют как терапевтический агент, реагируя на АФК.освобождение загруженного dMn3O4как только он достиг места воспаления.

Ключевые слова:Наночастицы Mn3O4, Нанозимы, Воспаление,Ишемия-реперфузия, Почка

Фон

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>в 1,5 раза от исходного уровня в течение семи дней или уменьшение объема мочи на<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Ишемически-реперфузионное повреждение (ИРИ)Это повреждение органа, вызванное временным уменьшением или прекращением кровотока с последующей реперфузией, которое может возникнуть в различных клинических ситуациях, таких как шок, инфаркт миокарда, ишемический инсульт, обширное хирургическое вмешательство и трансплантация органов. Почечный ИРИ является одной из ведущих причин ОПП, приводящего к быстрому снижению функции почек. Почка является органом, который особенно восприимчив к ишемическим повреждениям, и повреждение канальцевых эпителиальных клеток впоследствии приводит к нарушению выведения продуктов жизнедеятельности и регуляции водно-электролитного и кислотно-щелочного баланса [6]. Известно, что механизм повреждения клеток почечных канальцев при ИРИ включает воспаление, вызванное активными формами кислорода (АФК), образующимися во время реперфузии [6–8]. Поэтому предпринимались попытки применить очистку АФК для лечения ИРИ. Однако его реальное клиническое применение было ограничено из-за опасений по поводу системных побочных эффектов, включая реакции гиперчувствительности [9]. Введение антиоксидантов, таких как эдаравон, уже использовалось для удаления АФК при ИРИ. Однако это сопровождалось рядом побочных эффектов, в связи с чем возникла потребность в новых и эффективных антиоксидантах, таких как нанозимы (наноматериалы, обладающие природной ферментоподобной активностью) [9–13]. Яо и др. обнаружили, что наночастицы Mn3O4 обладают множественной активностью, имитирующей ферменты, т.е. активностью, имитирующей супероксиддисмутазу и каталазу, а также активностью по улавливанию гидроксильных радикалов [11]. Было показано, что Mn3O4 обладает более сильной способностью к улавливанию АФК, чем другие ферменты, такие как V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 и Fe3O4, и лучше, чем у других типов оксидов марганца (MnOx (MnO2, MnO и Mn2O3).

Рис. 1 Схематическое изображение, показывающее получение и механизм действия ПТК-М. А Синтез ПТК-М, Б. Механизм действия ПТК-М (1) внутривенное введение ПТК-М (2) введенный ПТК-М циркулирует в крови. и накапливается в месте воспаления (3) дестабилизация PTC-M из-за собственных АФК, присутствующих в месте воспаления (4) высвобождение загруженного dMn 3O4 в месте воспаления (5) высвобожденный dMn3O4 катализирует удаление АФК, что приводит к (6) уменьшение воспаления, апоптоза и фиброза (7) облегчение повреждения почек и (8) улучшение функций почек

Результаты

Синтез и характеристика наночастиц dMn3O4 и полимерных конъюгатов

НЧ Te dMn3O4 были синтезированы методом соосаждения и стабилизированы тиоловыми группами 1-додекантиола (рис. 2А). Анализ с помощью автоэмиссионной трансмиссионной электронной микроскопии (FE-TEM) показал, что НЧ dMn3O4 имели средний размер менее 2{{10}} нм (18,0±0,6 нм) (рис. 2Б). ). Дополнительный файл 1: На рисунках S1A и S1B показаны изображения и схематическое изображение приготовленного dMn3O4. Данные энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDS) показали наличие Mn из Mn3O4, а также серы и углерода из SH-C12 (рис. 2C и дополнительный файл 1: рисунок S1C). Результаты рентгенофотонного спектроскопического анализа (РФЭС) показали РФЭС-спектр Mn 2p, который состоял из двух пиков, расположенных при 641,42 эВ и 653,23 эВ, и эти пики были отнесены к Mn 2p3/2 и Mn 2p1/2 соответственно (рис. .2D и дополнительный файл 1: рисунок S2). Энергетическая щель между этими двумя пиками составила 11,81 эВ, что хорошо согласуется с литературными данными для Mn3O4. На порошковой рентгенограмме (XRD) НЧ dMn3O4, как показано на рис. 2E, все измеренные дифракционные пики хорошо соответствовали стандартной картине гаусманита Mn3O4 [ICDD: # 001–1127], подтверждая их высокую кристалличность. природа. АФК-чувствительный конъюгат ПТК получали с помощью поэтапных химических реакций, в которых сначала определяли размер тиокетального (ТК) линкера с концевой карбоксилатной группой. Карбоксильную группу линкера ТК затем конъюгировали с аминогруппой метокси-ПЭГ-амина (ПЭГ-АМ) с использованием реакции EDC/NHS с образованием ПЭГ-ТК. Наконец, другую карбоксильную группу ПЭГ-ТК снова конъюгировали с аминогруппой стеарамина посредством реакции EDC/NHS [15]. Конъюгат ПК, не реагирующий на АФК, получали путем конъюгирования стеариновой кислоты с ПЭГ-АМ. Состав ПТК и ПК анализировали с помощью 1 H-спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (дополнительный файл 1: рисунок S3). В спектрах ЯМР наблюдаются характерные пики при δ 0.83 и 1.23 м.д., соответствующие метильным и метиленовым протонам C18. Пик при δ 3,6 соответствовал O–CH2–CH2- ПЭГ. Степень замещения (DS %) С18 в ПТК и ПК составила 78% и 46% соответственно.

Получение и характеристика фермента PTC-M

Чувствительные к АФК наномицеллы (PTC) Te были загружены dMn3O4, в результате чего получился PTC-M. Для приготовления ПТК-М использовали дозу dMn3O4 (20%) ПТК. Гидродинамический диаметр, дзета-потенциал и изображения FE-TEM подготовленных PTC и PTC-M показаны на рис. 3A и в дополнительном файле 1: рисунок S4A. Изображения ПТК, полученные методом FE-TEM, продемонстрировали сферические наномицеллы с одинаковыми размерами частиц. Гидродинамический диаметр ПТК-М немного увеличился после загрузки dMn3O4 из-за упаковки dMn3O4 в гидрофобном пространстве, в то время как дзета-потенциал оставался отрицательным в обеих наномицеллах из-за экранирования ПЭГ. Изображения PTC и PTC-M, полученные методом FE-TEM, показали равномерно распределенные частицы. Содержание загрузки и эффективность инкапсуляции были рассчитаны с использованием масс-спектрометрического анализа и составили 10±3% и 17±6% соответственно. Присутствие dMn3O4 было видно на изображениях PTC-M с помощью FE-TEM (рис. 3A), что дополнительно было подтверждено EDS-анализом PTC-M, показывающим Mn из Mn3O4, серу и углерод из SH-C12 и углерод. , азот и кислород из ПЭГ (дополнительный файл 1: рисунок S5). Был проведен термогравиметрический анализ (ТГА), и рассчитанная загрузка dMn3O4 составила 12% (дополнительный файл 1: рисунок S6B). Нечувствительные к АФК мицеллы, нагруженные dMn3O4 (ПК-М), также были приготовлены в качестве контроля тем же методом.

Чтобы подтвердить роль связи TK в дестабилизации PTC-M, реагирующей на АФК, и высвобождении dMn3O4, PTC-M подвергали воздействию условий ROS путем добавления H2O2. В качестве контроля использовали нечувствительный к АФК ПК-М. И PTC-M, и PC-M имели сферическую морфологию с плотно упакованным dMn3O4 в наномицеллах, но после обработки H2O2 супра-сборка PTC-M была искажена с последующим высвобождением dMn3O4, который затем был агрегировались, как показано на изображениях FE-TEM, тогда как PC-M демонстрировал стабильные структуры даже после воздействия H2O2 (рис. 3B и дополнительный файл 1: рисунок S4B). Восприимчивость PTC-M к АФК была дополнительно подтверждена путем сравнения изменений гидродинамического диаметра и дзета-потенциала с PC-M, как показано в Дополнительном файле 1: Рисунок S7. Гидродинамический диаметр и дзета-потенциал PC-M, нечувствительного к АФК, не показали заметных различий после добавления H2O2. Однако чувствительный к АФК ПТК-М показал уменьшенные гидродинамические размеры, вероятно, из-за удаления защиты ПЭГ посредством разрушения ТК, что привело к дестабилизации структуры. После добавления H2O2 зета-потенциал изменился с отрицательного на положительный заряд, что могло быть связано с удалением ПЭГ и воздействием пара. Далее мы изучили изменение размера, проверив стабильность во времени, отслеживая гидродинамические диаметры в присутствии или в отсутствие H2O2 (рис. 3C). После добавления H2O2 гидродинамические диаметры значительно уменьшались в течение 10 с без дальнейших изменений со временем до шести дней, тогда как один ПТК-М в ходе эксперимента демонстрировал стабильные размеры, что свидетельствует о хорошей коллоидной стабильности ПТК-М. Мы также проверили стабильность в 10% FBS и заметили, что PTC-M показал хорошую стабильность в течение 4 дней (дополнительный файл 1: рисунок S9). Гидроксидинамические диаметры и изменение зета-потенциала также были подтверждены с помощью АФК-чувствительных и нечувствительных пустых наномицелл (ПТК и ПК) (дополнительный файл 1: рисунок S8). Все эти сравнительные исследования в присутствии или в отсутствие АФК продемонстрировали стабильность и чувствительность к АФК приготовленных наномолей или конечного фермента dMn3O4 PTC-M.

Рис. 2. Синтез и характеристика dMn3O4. Схематическое изображение синтеза dMn 3O4, B изображения FE-TEM, C EDS-анализ, D XPS-спектр и E XRD-диаграммы НЧ dMn3O4.

Далее мы проверили свойство элиминирования H2O2 конечного фермента PTC-M вследствие загрузки NP dMn3O4. Это было проверено с использованием терефталевой кислоты (ТА) в качестве зонда для фьючерсных центов. ТА реагирует с H2O2 с образованием 2-гидрокситерфталевой кислоты с флуоресцентным пиком при 425 нм. dMn3O4 преобразует H2O2 в воду и кислород и, следовательно, интенсивность флуоресценции снижается, что подтверждает активность каталазы, как показано на рис. 3D. Te PTC-M показал сильное снижение интенсивности флуоресценции по сравнению с PTC пустой мицеллы в присутствии H2O2 с течением времени. Каталазоподобная активность PTC-M также зависела от концентрации, как показано в Дополнительном файле 1: Рисунок S10. Способность ПТК-М продуцировать кислород была дополнительно подтверждена с использованием O2-специфического флуоресцентного зонда Ru(DDP) в присутствии H2O2. Флуоресценция в десяти городах Ru(DDP) снижается в присутствии O2, что позволяет предположить эффективное производство O2. Как показано на рис. 3E, интенсивность флуоресценции Ru(DDP) уменьшалась в присутствии H2O2 в группе PTC-M, тогда как присутствие H2O2 в группе только PTC демонстрировало незначительное снижение флуоресценции (рис. 3F). подтверждая активность каталазы, приводящую к выработке кислорода в PTC-M. Наконец, мы подтвердили способность PTC-M удалять H2O2 с помощью измерителя кислорода. Как показано на рис. 3G, выработка кислорода ПТК-М увеличивалась в начальный период времени, а затем медленно увеличивалась, тогда как пустые мицеллы ПТК не демонстрировали выработку кислорода. Диспропорционирование H2O2 наблюдалось по образованию пузырьков кислорода в группе PTC-M, как показано в Дополнительном файле 1: Рисунок S11A. Также было замечено, что PTC-M показал более высокую продукцию кислорода по сравнению с одним dMn3O4, вероятно, из-за плотной упаковки dMn3O4 в PTC-M, что делает его более доступным для реакции по сравнению со свободным dMn3O4 (Дополнительный файл 1: Рисунок С11Б). Несмотря на то, что наномицеллы разрыхлились из-за обработки H2O2, как показано с помощью FE-TEM, dMn3O4 все еще мог присутствовать внутри PTC-M, что приводило к более высокой активности каталазы по сравнению со свободным dMn3O4. Все эти результаты вместе подтвердили превосходную активность PTC-M, имитирующую каталазу.

Жизнеспособность клеток in vitro и клеточное поглощение

Чтобы подтвердить клеточное поглощение и восприимчивость к АФК внутриклеточно распределенного АФК-чувствительного ПТК, а также характер высвобождения полезной нагрузки, мы сравнили ПТК с ПК в условиях in vitro. Сначала мы проверили жизнеспособность клеток подготовленных PTC, PC, PTC-M и PC-M в клетках HK-2 с помощью анализа WST-1 (дополнительный файл 1: рисунок S12). Пустые мицеллы подвергались незначительной клеточной гибели, но после загрузки dMn3O4- жизнеспособность клеток снижалась, но это изменение не было статистически значимым. Поскольку пустые мицеллы не были цитотоксичными, небольшое изменение жизнеспособности клеток могло быть связано с адсорбированным на поверхности dMn3O4. Значение IC50 для PTC-M и PC-M составило 130,41 и 247,17 мкг/мл соответственно (рис. 4А). Для дальнейшего изучения внутриклеточного поглощения и распределения наномицелл IR780 использовали в качестве модельного препарата и получали наномицеллы PTC, загруженные IR780, PTC-IR780 для визуализации интенсивности флуоресценции IR780 с использованием микроскопии присутствия удовольствия (Evos FL Auto 2, Thermo Fisher Scientific , США) (рис. 4Б). В качестве контрольной группы мы также проанализировали использование нечувствительного к АФК PC-IR780. По сравнению с PC-IR780, PTC-IR780 показал более высокое поглощение в клетках HK-2 (дополнительный файл 1: рисунок S13). Точная причина повышенного поглощения PTC-IR780 в условиях отсутствия АФК не ясна, однако это может быть связано с тем, что PTC может проявлять небольшую чувствительность к нормальному уровню АФК в условиях клеточной культуры, что приводит к снятию защиты ПЭГ с поверхности. заряд слегка положительный. PC-IR780 показал схожий характер поглощения независимо от АФК, индуцированных обработкой H2O2, или условий АФК, вызванных гипоксией, из-за нечувствительной природы, тогда как PTC-IR780 показал другой характер распределения внутри клеток, что могло быть связано с повышенным высвобождением IR780. внутри клеток. Предыдущие данные о жизнеспособности клеток (дополнительный файл 1: рисунок S11), показывающие повышенную гибель клеток при PTC-M, также могут быть связаны с повышенным поглощением PTC клетками по сравнению с PC. Йодид IR780 представляет собой высокогидрофобный краситель, который может проявлять высокое сродство к клеточной мембране и показывать очень яркий сигнал независимо от воздействия АФК. Клеточное поглощение было дополнительно проанализировано путем проверки средней интенсивности флуоресценции (MFI) с помощью анализа сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS) (рис. 4C), что подтвердило данные, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии. Как показано, MFI был самым высоким в группе АФК-чувствительного PTC IR780 по сравнению с другими группами, что подтверждает усиленное высвобождение IR780 в клетках. Далее мы связали MFI из различных групп (рис. 4D), что подтвердило данные микроскопии, свидетельствующие о том, что PC-IR780 не показал каких-либо существенных различий в клеточном поглощении даже в условиях, индуцированных АФК, тогда как PTC IR780 показал значительное увеличение клеточного поглощения. поглощение при лечении в условиях, индуцированных АФК. Поглощение ПТК клетками также определяли путем проверки остаточного Mn в клетках после обработки ПТК-М. Как показано на фиг. 4E, PTC-M демонстрировал зависимое от концентрации поглощение клетками HK-2. Таким образом, эти результаты суммируют усиленную интернализацию наномицелл и ускоренное высвобождение внутри клеток, вероятно, из-за опосредованной АФК разборки наномицелл.

Мы провели исследования in vitro на клетках HK-2 для дальнейшего изучения влияния PTC-M на условия окислительного стресса на клеточном уровне. Клетки HK-2 стимулировали H2O2, типичным АФК (рис. 5А). H2O2 усиливал экспрессию гемоксигеназы (HO)-1, которая улучшалась при совместной обработке PTC-M (рис. 5A). Анализ Te 2',7'-дихлордигидрофуоресцеина диацетата (DCF DA) проводили для проверки характера внутриклеточных изменений АФК. Клетки Te HK-2, стимулированные H2O2, демонстрировали высокую интенсивность флуоресценции, но после совместной обработки с PTC-M интенсивность флуоресценции снижалась (рис. 5Б). Соотношение Te BAX/BCL-2 увеличивалось при обработке H2O2, которое также восстанавливалось при совместной обработке PTC-M, что указывает на защиту от апоптоза (рис. 5C). Клетки HK-2, обработанные H2O2, демонстрировали значительное прогрессивное увеличение окрашивания аннексином V+/PI-, которое предотвращалось PTC-M (рис. 5D). H2O2-индуцированное фосфорилирование ERK, JNK и p38 также подавлялось при одновременном воздействии PTC-M, хотя значительного снижения фосфорилированного P38 не наблюдалось (рис. 5C). Эти данные свидетельствуют о том, что ПТК-М подавляет АФК-индуцированные апоптотические процессы в эпителиальных клетках почечных канальцев.