Ингибирование агрегации бета-амилоида и отложения водного экстракта Cistanche Tubulosa

1. Введение

Деменция – одно из наиболее распространенных хронических заболеваний старения. В 2015 году во Всемирном докладе о болезни Альцгеймера было подсчитано, что около 46,8 миллиона человек страдают от деменции, и ожидается, что это число составит 74,7 миллиона в 2030 году и 131,5 миллиона в 2050 году. Глобальное население, страдающее деменцией, будет увеличиваться из года в год и в будущем выйдет из-под контроля. . Глобальные расходы на здравоохранение на лечение деменции в 2010 году составили почти 604 миллиарда долларов США, а в 2030 году ожидается, что эта сумма составит 1 000 миллиардов. Пациенты с деменцией подвергаются большему риску смерти от несчастного случая и, следовательно, нуждаются в большем объеме медицинской помощи. Это тяжелое бремя для лиц, осуществляющих уход за больными деменцией. Воздействие деменции на лиц, осуществляющих уход, семью и общество может вызвать сильный физический, психологический, жизненный и экономический стресс. Существует две основные формы деменции: болезнь Альцгеймера (БА) и сосудистая деменция. БА является наиболее распространенной деменцией и представляет собой необратимое и прогрессирующее нейродегенеративное заболевание. БА была шестой по значимости причиной смерти в США в 2015 году.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Недавние исследования подтверждают, что токсичность нейронов, вызванная агрегацией амилоидного пептида (А) (бляшек) и белка тау (клубков), тесно связана с патогенезом БА. Накопление А и белка тау в мозге может привести к повреждению нейронов и потере памяти. Нерастворимые олигомеры А агрегируют во внеклеточных бляшках и, как сообщается, приводят к синаптической дисфункции, токсичности нейронов и гибели клеток. К сожалению, до сих пор не существует эффективного лечения, позволяющего очистить А и тау-белок, ингибировать образование или олигомеризацию А, а также приостановить или вылечить необратимое повреждение нейронов. Современные терапевтические средства, такие как галантамин и донепезил, которые являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы, могут лишь временно облегчить потерю памяти за счет повышения уровня нейромедиаторов. В 2012 году ни один препарат-кандидат не смог снизить эффект А в крупных клинических исследованиях пациентов с БА. Поэтому срочно необходимы исследования нового метода лечения болезни Альцгеймера. Ионы металлов недавно считались ключевым фактором, тесно связанным с агрегацией А. Хелаторы металлов, рассматриваемые как потенциальные соединения свинца, обеспечивают совершенно новую стратегию борьбы с БА.

Высушенный стебель цистанхе трубчатой.(Шренк) Р. Уайт, Роу Конг Ронг, широко собирают в пустыне Синьцзян, Китай. Это важная традиционная китайская медицина, относящаяся к тонизирующей китайской медицине, внесенная в Китайскую Фармакопею и используемая на протяжении тысячелетий для лечения физической слабости, почечной недостаточности, бесплодия, забывчивости, импотенции и старческих запоров.Водный экстракт C. Tubeulosa (CTE)капсулы были одобрены в качестве растительного препарата для лечения сосудистой деменции в Китае. По данным клинического исследования с участием 18 пациентов с диагнозом БА легкой и средней степени тяжести, капсулы CTE обеспечили пациентам более стабильное состояние памяти по сравнению с ингибиторами ацетилхолинэстеразы. В нашем предыдущем исследовании CTE уменьшал отложение амилоидного пептида (А) и улучшал потерю памяти у крыс, страдающих болезнью Альцгеймера. Фенилэтаноидные гликозиды, эхинакозид (1), актеозид (2) и изоактеозид (3) считаются основными компонентами ХТЭ. Соединение 1 обладает нейропротекторной активностью в отношении токсичности 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), 1-метил{{13 }}ион фенилпиридиния (MPP+) и 6-гидроксидофамин (6-OHDA). Наш предыдущий отчет показал, что 1 подавлял олигомеризацию и токсичность А в исследовании in vitro, а также ингибировал отложение А, улучшал нарушения памяти и когнитивную дисфункцию у А-индуцированных крыс. Соединения 2 и 3 усиливали деградацию А и уменьшали олигомеризацию А in vitro. Соединение 3 уменьшало отложение А у А-индуцированных крыс. На основании этих исследований C. Tubeulosa уже доказала свою способность лечить БА. CTE тесно связан с агрегацией и отложением анти-А. Чтобы лучше понять механизм ХТР, нам необходимо иметь удобный и эффективный метод идентификации активного компонента, а также его содержания в образцах ткани головного мозга. Большинство исследований были направлены на количественное определениеэхинакозид, актеозид и изоактеозид в травахили пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но только два исследования были посвящены определению в сыворотке или тканях. Однако нет сообщений об одновременном анализе 1–3 в тканях головного мозга после перорального введения ХТЭ. Кроме того, из недавних исследований до сих пор неясно, успешно ли активные компоненты ХТЭ или их метаболиты проходили через гематоэнцефалический барьер и действовали на нейроны головного мозга. Таким образом, это исследование представляет собой усовершенствованный и чувствительный метод с убедительными доказательствами, которые ясно иллюстрируют основной механизм CTE против агрегации и отложения A.

2. Результаты

2.1. Выделение и идентификация трех основных соединений (1–3)

Высушенные стебли C. Tubeulosa экстрагировали 75% этанолом при комнатной температуре. Конденсированный 75%-ный экстракт EtOH подвергали хроматографии на смоле и колонке C18 с получением трех основных соединений: эхинакозида (1),актеозид (2) и изоактеозид(3). Их структуры были выяснены путем анализа спектроскопии ЯМР (ядерный магнитный резонанс) и ESI-MS (ионизационная масса электрораспылением), а также путем сравнения с литературными данными (рис. 1, рисунки S3–S11 дополнительных материалов).

2.2. Анализ содержания фенилэтаноидных гликозидов (1–3) от CTE

Метод анализа был валидирован для анализа фенилэтаноидных гликозидов. Соединения 1–3 (5,0 мг) точно взвешивали и смешивали с 50% метанолом (40 мл). Смеси обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин. Стандартный раствор трех фенилэтаноидных гликозидов (1–3) смешивали с исходным стандартным раствором (100 мкг/мл). Из стандартного исходного раствора готовили пять различных концентраций (5, 10, 25, 50 и 100 мкг/мл) указанных растворов соответственно путем разбавления серийными объемами 50% метанола. Кривые фенилэтаноидных гликозидов (1–3) были установлены с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) в диапазоне 5–100 мкг/мл и были линейными соответственно (1, r2= 0,9999; 2, r{{25}). }.9999; 3, р2= 0.9998). Внутридневная и междневная точность [% RSD (относительное стандартное отклонение) составляла от 0,1 до 1,8%) и точность (95,6–104,2%) были приемлемыми для UPLC для 1–3. С помощью UPLC количественно 1, 2 и 3 содержания CTE составили 254, 38 и 41 мг/г соответственно (рисунок S2).

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНХ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. Валидация UPLC/MS/MS

Фенилэтаноидные гликозиды (1–3) смешивали, добавляли к гомогенату ткани головного мозга крысы и анализировали с использованием масс-спектрометра с жидкостной хроматографией Ultra Performance (UPLC/MS/MS) с твердофазной экстракцией. Нижний предел обнаружения (LLOQ) 1–3 составлял 0,2 нг/мл. Извлечение фенилэтаноидных гликозидов резко возросло при использовании гомогената мозговой ткани (10 нг/мл) и составило 91,39% для 1, 89,54% для 2 и 96,81% для 3 соответственно (рис. 2).

2.4. Анализ AD-подобных тканей мозга крыс

Через 14 дней перорального введения CTE (200 мг/кг/день) AD-подобные ткани головного мозга крыс собирали и разделяли на две части: гиппокамп и полосатое тело, и обе гомогенизировали. Поскольку гомогенаты гиппокампа и полосатого тела от каждой крысы были слишком скудными, чтобы их можно было загрузить в твердофазную экстракцию, и во избежание чрезмерных экспериментальных ошибок, гомогенаты гиппокампа и полосатого тела от четырех отдельных крыс были смешаны в анализируемый образец для UPLC/MS/MS с использованием твердого вещества. метод фазовой экстракции (рис. 3А, Б). Фенилэтаноидные гликозиды (1–3) наблюдались в гиппокампе (рис. 3А) и полосатом теле (рис. 3В). В пустых тканях мозга не было значительного пика (рис. 3C). В гиппокампе содержание эхинакозида составило 11,97 ± 0,34 нг/мл, актеозида — 1,25 ± 0,16 нг/мл, изоактеозида — 1,38 ± 0,08 нг. /мл. В стриатуме содержание эхинакозида составило 22,60 ± 1,69 нг/мл, актеозида — 2,03 ± 0,61 нг/мл, изоактеозида — 4,90 ± 0,64 нг/мл. Как показано на рисунке 4, CTE может проходить через гематоэнцефалический барьер в соответствии со значительными обнаруживаемыми количествами 1–3 в гиппокампе и полосатом теле. Содержание 1 намного выше, чем 2 и 3 в CTE по данным анализа UPLC (рис. S2). Таким образом, разумно отметить, что 1 является самым высоким в ткани головного мозга после перорального введения ХТЭ.

2.5. Фенилэтаноидные гликозиды (1–3) проявляют металлхелатирующую активность.

В литературе определение свободных соединений и их металлокомплексов проводили методом ВЭЖХ. В этом исследовании степень хелатной активности анализировали с помощью UPLC. Растворы 50 мкг/мл каждого из фенилэтаноидных гликозидов (1–3) добавляли к раствору 10 мкг/мл меди (Cu), кальция (Ca), магния (Mg), цинка (Zn), железа (Fe ) или крысиной сыворотки соответственно. Каждое соединение с каждым раствором металла или сывороткой анализировали с помощью UPLC. Фенилэтаноидные гликозиды (1–3) проявляли активность хелатирования металлов с железом и сывороткой (рис. 5, дополнительные материалы, рис. S1).

2.6. Анализ эхинакозида (1) в сыворотке крыс in vivo

Чтобы понять распределение эхинакозида в сыворотке крыс, сыворотку собирали от начального времени до 720 минут после перорального введения эхинакозида (1) (100 мг/кг) и анализировали с помощью UPLC. На рисунке 6 показаны профили зависимости концентрации эхинакозида от времени в сыворотке крыс.

3. Обсуждение

Деменция, особенно БА, представляет собой необратимое старение и хроническое заболевание, которое приводит к возникновению гордиева узла вопросов. Эта непреодолимая болезнь приводит к серьезным экономическим проблемам с огромным и растущим финансовым бременем. Во всем мире исследователи AD приложили много усилий для изученияновые препараты против АДно потерпел неудачу в нескольких крупных клинических испытаниях, нацеленных на A, в 2012 году. За исключением прямого воздействия на A, гомеостаз ионов металлов в мозге считается ключевой причиной, связанной с агрегацией и отложением A, которая приводит к образованию AD. Таким образом, ионы металлов играют важную роль в патогенезе БА, и гипотеза хелатирования металлов стала важным направлением исследований.

Согласно нашим предыдущим исследованиям,CTE продемонстрировал потенциальную активность против деменции. Даже в клинических исследованиях на людях после 1 года лечения капсулами CTE у пациентов с БА средней степени тяжести показатель когнитивной подшкалы шкалы оценки болезни Альцгеймера (ADAS-cog) не показал значительного ухудшения по сравнению с показателем до лечения. CTE поддерживал стабильный показатель ADAS-cog у пациентов с AD, в отличие от других рецептурных лекарств. Единственный выбор рецептурных препаратов, лицензированных длялечение АДИнгибиторы ацетилхолинэстеразы (АХЭИ), такие как донепезил и галантамин, улучшают симптомы АД в краткосрочной перспективе, но ухудшение наступает через 1 год лечения. Согласно клиническим исследованиям, ХТЭ может стать потенциальным средством лечения разработки средств против БА. Согласно нашим предыдущим сообщениям, эхинакозид (1), актеозид (2) и изоактеозид (3) защищают нейроны от повреждения А, уменьшают олигомеризацию А in vitro и значительно улучшают когнитивную дисфункцию, вызванную А in vivo. Исследование in vitro показало, что активные дозы 1–3 составляли до 5{{10}} мкг/мл. Однако предыдущие исследования показали, что пероральная биодоступность 1 и 2 была очень низкой (0,83% для 1 и 0,12% для 2) у крыс. Соединение 1 даже не удалось идентифицировать в сыворотке человека после перорального приема таблеток эхинацеи. Текущие исследования показывают, что 1–3 имеют плохую проницаемость мембран и абсорбцию в клетках кишечника, и большая часть 1 метаболизируется в желудочно-кишечных протоках. Содержание соединения 2 в сыворотке крыс составляло всего около 4,5 мкг/мл после 15 мин внутривенного введения дозы актеозида 10 мг/кг. Однако это исследование показывает, что 1–3 будут обнаружены в гиппокампе и полосатом теле тканей головного мозга крыс после перорального введения CTE (рис. 3 и 4). Кроме того, на фигуре 6 показано, что содержание соединения 1 в сыворотке крыс увеличивалось примерно в 5 раз с 15 мин до 720 мин после перорального введения соединения 1 (100 мг/кг). Мы считали, что фенилэтаноидные гликозиды ХТЭ могут проходить через гематоэнцефалический барьер и между ХТЭ и металлом будет происходить хелатирующее действие. Хелатирование – это обратимая химическая реакция. Железо является важным элементом в сыворотке и мозге [10,40]. На рисунке 5 показано, что три фенилэтаноидных гликозида обладают металлохелатирующей активностью с железом и сывороткой. Железо и сыворотка изменяют пиковую область времени удерживания трех фенилэтаноидных гликозидов. Хелатирование железа может быть решающей причиной, приводящей к ошибочному определению очень низкой биодоступности фенилэтаноидных гликозидов. Следовательно, металл-хелатную активность следует учитывать при анализе сыворотки крови и головного мозга трех фенилэтаноидных гликозидов CTE для восстановления реальной биодоступности и фармакокинетики. Кроме того, результаты показали, что три фенилэтаноидных гликозида (1–3) проходят через гематоэнцефалический барьер и достигают тканей мозга через кровообращение в организме. В этом исследовании был разработан наиболее быстрый и чувствительный метод анализа 1–3 с использованием UPLC/MS/MS и предоставлены убедительные доказательства того, что фенилэтаноидные гликозиды (1–3) являются основными биоактивными компонентами CTE.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНШ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Материалы и методы.

4.1. Растительный материал

Стебли C. Tubeulosa были собраны в мае 2016 года в Ханчжоу, Китай. Растение было идентифицировано по образцам ваучера доктора Лина Х.К. (№ 20016CT), которые были переданы на хранение в компанию Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Ханчжоу, Китай.

4.2. Выделение и очистка

Высушенный стебель C. Tubeulosa измельчали ​​в порошок, а затем пять раз экстрагировали 75% этанолом. После выпаривания растворителя при пониженном давлении неочищенный экстракт подвергали колоночной хроматографии на макропористой смоле AB-8 с градиентными системами растворителей H2O/EtOH от 20% EtOH до 100% EtOH. По данным тонкослойной хроматографии четыре фракции (Fr.1~Fr.4) собирали для дальнейшего разделения. о. 2 подвергали препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 мм × 20 мм, внутренний диаметр, 5 мкм) с использованием 18% ацетонитрила в качестве подвижной фазы. Скорость потока составляла 15 мл/мин. Выборочно были собраны три основных представляющих интерес пика. Фракции, содержащие целевые соединения, дополнительно конденсировали досуха и получали 1, 2 и 3 соответственно.

4.3. Экспериментальный анализ

Спектры ЯМР 1Н и 13С получали на спектрометрах Bruker Avance DRX 500 МГц (Биллерика, Массачусетс, США) с тетраметилсиланом (ТМС) в качестве внутреннего стандарта. Препаративную ВЭЖХ проводили с использованием колонки с обращенной фазой (колонка Cosmosil C18-AR-II, внутренний диаметр 250 мм × 20 мм; Nacalai Tesque, Inc., Киото, Япония) на приборах Shimadzu LC-6AD серии. аппарат с детекторами Prominence HPLC UV-Vis (Киото, Япония).

Эхинакозид (1): белый порошок; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 1H ЯМР (CD3OD, 500 МГц): δ 1.07 (1H, д, J=6.2 Гц, Rha-H-6), 2,79 ( 2H, t, J=5,2 Гц, H-7), 3,56 (1H, м, Ha-8), 3,79 (1H, м, H-30), 3,91 (1H, м, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7.7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J {{4{ {80}}}}.9 Гц, H-10 ), 5.{{100}}0 (1H, t, J=9.6 Гц, H-40), 5,17 (1H, d, J=1,5 Гц, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9). Гц, H-800), 6,58 (1H, дд, J=8.1,2,0 Гц, H-6), 6,67 (1H, д, J=8.1 Гц, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Гц, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Гц, H-500), 6,94 (1H, дд, J=8,3, 2,0 Гц, H-600), 7,05 (1H, d, J=2,0 Гц, H-200), δ 7,59 (1H, d, J=15,9 Гц, H-700); 13C-ЯМР (CD3OD, 125 МГц): δ 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C{{ 125}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200), 115,3 (C{{ 189}} ), 116,3 (C-500), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 204}} ), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 219}}), 148,2 (C-700), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (рис. S3–S5).

Актеозид (2): белый порошок; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H ЯМР (ДМСО-d6, 500 МГц): δ 0,94 (3H, д, J =5,9 Гц, H-6000 ), 2,68 (2H, м, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Гц, H-100), 4,70 (1H, t , J=9.{{160}} Гц, H-400 ), 5.{{209}}1 (1H, с, H{{ 31}}), 6,18 (1H, д, J=15,9 Гц, H-80), 6,48 (1H, дд, J=7,9, 1,4 Гц, H{{ 45}}), 6,62 (1H, d, J=7,1 Гц, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Гц, H{{57}) }), 6,75 (1H, d, J=7,9 Гц, H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Гц, H-60) , 7,01 (1H, с, H-20), 7,44 (1H, д, J=15,8 Гц, H-70); ЯМР 13С: (ДМСО-d6, 125 МГц): δ 18,2 (C-6000), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{95}). } ), 69,2 (C-400), 70,3 (C-3000), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000), 70,6 (C{{110} } ), 71,7 (C-500), 74,5 (C-200), 79,2 (C-300), 101,3 (C-1000), 102,3 (C{{125} } ), 113,6 (C-80), 114,7 (C-20), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{{140} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10), 129,2 (C-1), 143,6 (C{{155} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C{{170} } ) (Рисунки S6–S8). Изоактеозид (3): белый порошок; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H ЯМР (ДМСО-d6, 500 МГц): δ 1,07 (3H, д, J=6,1 Гц, H-6000), 2,65 (2H, м, H-7), 4,35 (1H, д, J=10,0 Гц, H-100), 5,10 (1H, с, H-1000), 6,27 (1H, д, J=15 .9 Гц, H-80), 6,45 (1H, дд, J=8.0, 1,8 Гц, H-6), 6,58 (1H, d, J=8 .8 Гц, H-5), 6,73 (1H, d, J=1.6 Гц, H-2), 6,74 (1H, d, J=8).1 Гц, H-50), 6,94 (1H, d, J=8,2 Гц, H-60), 7,04 (1H, с, H-20), 7,46 ( 1H, d, J=15,8 Гц, H-70 ); ЯМР 13С (ДМСО-d6, 125 МГц): δ 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000 ), 70,4 (C-400), 70,6 (C-3000), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500), 74,5 (C-200), 80,9 (C-300), 100,7 (C-1000), 102,7 (C-100 ), 113,9 (C-20), 114,9 (C-80), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C-90 ) (Рисунки S9–S11).

4.4. Получение водного экстракта C. Tubulosa (CTE)

Порошок стебля C. Tubeulosa дважды экстрагировали путем кипячения с обратным холодильником с водой в течение 1,5 ч и раствор экстракта фильтровали. Отфильтрованный водный экстракт (КТЕ) перед использованием хранили при температуре 4 ◦С.

4.5. Модель животного и график экспериментов

Модель AD-подобных крыс и график экспериментов, использованные в этом исследовании, были такими же, как предписано в нашем предыдущем исследовании [19]. После инфузии А 1–42 (300 пмоль/день) в желудочек головного мозга в течение по меньшей мере двух недель или более крысам с АД-подобным заболеванием вводили CTE (200 мг/мл) перорально на следующий день. Через 14 дней введения крыс умерщвляли для сбора тканей головного мозга. Чтобы избежать чрезмерных экспериментальных ошибок, образцы от четырех отдельных крыс были объединены в один образец. Для каждой группы было по три образца.

4.6. Химикаты и реагенты

Метанол (класс ВЭЖХ) был приобретен у компании Merck (Дармштадт, Германия). Муравьиная кислота (98% для анализа, ACS) была приобретена у Panreac (Барселона, Испания). Ацетонитрил (класс ВЭЖХ) был приобретен у JT Baker (Филипсбург, Нью-Джерси, США). Чистую воду готовили с помощью системы ELGA (Woodridge, Великобритания). Гесперидин приобретали у Chromadex и использовали в качестве внутреннего стандарта (ВС) для анализа UPLC.

4.7. Аппаратура УПЛК/МС/МС

Для анализа UPLC/MS/MS использовали систему сверхэффективной жидкостной хроматографии Waters Acquity TQD (UPLC)/MS/MS (Милфорд, Массачусетс, США). Хроматографические эксперименты проводили на колонке Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters) в условиях градиентного элюирования со скоростью потока 0,4 мл/мин. Подвижная фаза состояла из муравьиной кислоты-воды (1:1000, по объему) (А) и муравьиной кислоты-ацетонитрила (1:1000, по объему) (Б). Временная программа была следующей: 0–5 мин, А–Б (92:8, об/об) сменилась на А–Б (62:38, об/об); 5–7 мин, АВ (62:38, об/об); 7-7.1 мин, AB (62:38, об/об) заменено на A–B (92:8, об/об); 7,1–9 мин, (92:8, об/об). Объем инъекции составлял 5 мкл в систему UPLC/MS/MS с источником ионов отрицательной ионизации электрораспылением (ESI). Полные ионные хроматограммы (ПИК) для 1–3 получали в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Массовые параметры были оптимизированы для получения максимально четких и интенсивных сигналов. Лучший выбор параметров был описан как капиллярное напряжение 3000 В, напряжение конуса 20 В, температура источника 125 ◦C, температура десольватации 400 ◦C, поток газа в конусе 50 л/ч, поток газа для десольватации 900 л/ч и столкновение 38 эВ. энергия. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения MassLynx 4.1 (Милфорд, Массачусетс, США).

4.8. Базовые приготовления

Для гомогенизации ткани мозга крысы использовали 50% метанол (1 г ткани на 5 мл метанола). Гомогенат центрифугировали при 10,000 об/мин при 4 ◦С в течение 10 мин. К супернатанту (50 мкл) с 10 мкл ИС (100 мкг/мл) добавляли чистую воду до 1 мл. Смесь осторожно загружали в картридж Oasis HLB (гидрофильно-липофильный сбалансированный) (Waters, Милфорд, Массачусетс, США), который уже элюировали 1 мл метанола, а затем уравновешивали 1 мл воды в условиях вакуума. После промывания картриджа 1 мл 10% метанола использовали 1 мл метанола для элюирования с получением анализируемого образца, который переносили в другую пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл с 10 мкл 1% раствора аскорбиновой кислоты и сушили выпариванием. Наконец, остаток анализируемого образца растворяли в 200 мкл 50% метанола для анализа.

4.9. Подготовка калибровочной стандартной кривой

Соединения 1–3 использовали для приготовления калибровочных стандартов, соответственно добавляя их к гомогенату ткани головного мозга и гесперидину в качестве внутреннего стандарта для получения окончательных концентраций калибровочных стандартов, которые составляли 1.0, 5.0, 1{{7 }}.0, 50.0 и 100,0 нг/мл.

4.10. Проверка

Калибровочная стандартная кривая была получена с помощью теста на линейность с использованием пяти различных концентраций 1–3 в диапазонах 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0 и 100,0 нг/мл соответственно и считались линейными с коэффициентом детерминации более 0,99 (R-квадрат). Нижний предел обнаружения (LLOQ), определенный как ± 20% от концентрации тестируемого образца, дает пик сигнала, а не шум. Достоверность и точность метода анализа оценивали с помощью теста восстановления при концентрации 10 нг/мл 1–3.

4.11. Анализ активности хелатирования металлов

Для анализа хелатирующего эффекта металлов использовали метод СЭЖХ с использованием 50 мкг/мл раствора СТЕ фенилэтаноидных гликозидов 1–3, содержащего 10 мкг/мл раствора металлов меди, кальция, магния, цинка, железа или сыворотки крови крыс. Каждое соединение с каждым раствором металла или сывороткой анализировали с помощью UPLC. Эффект хелатирования металлов изменит время удерживания на 1–3 в жидкостной хроматографии. Процент эффекта хелатирования металлов рассчитывали, как показано ниже, и данные представляли собой среднее значение ± SD (n=3).

5. Выводы

Это исследование показало, что 1–3 являются активными компонентами CTE, обладающими антиAD-активностью. Хелатирование железа стало новой концепцией разработки нового поколения лекарств для лечения АД.CTE — потенциальное ботаническое средство китайской медицины против AD.нацеливание на агрегацию и отложение А, вызванную хелатированием железа. Кроме того, мы также доказали, что 1–3 достигают мозга через кровь – гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Активные компоненты и подтверждение основного механизма CTE во многом помогут контролю качества и исследованиям биодоступности продукта в будущем. В то же время представленный передовой и эффективный метод анализа будет полезен при определении 1–3 в растениях, пищевых продуктах, крови и тканях мозга для химических отпечатков пальцев и фармакокинетических исследований.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА PHGS75% ECH 30% ACT 12%