Взаимодействия между полифенольными антиоксидантами кверцетином и нарингенином диктуют характерное окислительно-восстановительное химическое и биологическое поведение их смесей Часть 1

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Исследования, проведенные за последние два десятилетия на молекулярной основе неинфекционных хронических заболеваний, таких какатеросклероз, гипертония, диабет и особенно рак, вызывающие большой интерес, показали, что все эти заболевания имеют общий фактор риска, которым является нарушение окислительно-восстановительного гомеостаза, часто называемое окислительным стрессом12. Он возникает в результате повышенного эндогенного уровня активных форм кислорода (АФК) из-за нарушения антиоксидантного барьера организма и, как полагают, способствует развитию всех этих заболеваний. Таким образом, последовало предположение, что экзогенные факторы, способные нейтрализовать АФК, например растительные антиоксиданты, могут противодействовать или замедлять развитие хронических заболеваний и способствовать их лечению. Проверка этой гипотезы положила начало детальным исследованиям антиоксидантов, присутствующих в пищевых продуктах, которые могут обладать профилактическим потенциалом4. Действительно, несколько исследований, обобщенных в метаанализе, сравнивающем потребление пищи и хронические заболевания, связанные с питанием, выявили снижение риска в случае диет, богатых фруктами и овощами, цельнозерновыми злаками, а также такими напитками, как вино, кофе и чай. следовательно, продукты, богатые антиоксидантными фитохимическими веществами. Неудивительно, что предполагалось, что эти вещества, однажды выделенные из их природных источников, очищенные и затем употребленные в виде пищевых добавок, содержащих более высокие дозы, чем достижимые в рационе, могут стать мощными химиопрофилактическими агентами. Это предположение было подтверждено большим количеством доказательств, полученных в результате исследований, в которых использовались различные экспериментальные модели хронических заболеваний in vitro и in vivo, включая рак. . Например, два мета-анализа когорты людей и исследований «случай-контроль» с витамином Е8 или препаратами питательных микроэлементов пришли к выводу, что низкие уровни антиоксидантов не имеют никакого эффекта, в то время как высокие дозы могут увеличить как заболеваемость, так и смертность от рака и сердечно-сосудистых заболеваний. добавки были основаны на настоящих растениях, таких как особая смесь концентрированных продуктов, богатых полифенолами (гранат, зеленый чай, брокколи и куркума), наблюдался значительный защитный эффект у мужчин с раком простаты1.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Многообещающие эффекты цельных пищевых продуктов в отличие от изолированных соединений соответствуют концепции пищевой синергии, которая определяется как аддитивное или более чем аддитивное влияние комбинации различных пищевых ингредиентов на здоровье человека. Наше более раннее исследование подтвердило эту концепцию, сравнив биоактивность настоящих продуктов с их изолированным основным антиоксидантом. Это показало, что биологические эффекты экстрактов плодов ягод значительно отличаются от таковых, проявляемых антоциан цианидин-3-О-глюкозидом. В некоторых других отчетах также указывалось на важность взаимодействий между различными биологически активными соединениями и компонентами пищевой матрицы, которые оказались взаимодействующими факторами, определяющими конечную биологическую активность пищевых продуктов3-1. Наши недавние механистические исследования, включающие поэтапное восстановление биоактивного состава какао, также подтвердили идею пищевой синергии, но продемонстрировали, что биологические эффекты образцов со сложным составом — это не просто комбинация активностей, проявляемых отдельными компонентами»3. Все эти наблюдения свидетельствуют о том, что при рассмотрении окислительно-восстановительной биоактивности изолированных антиоксидантов по сравнению с их смесями необходимо учитывать взаимодействие между компонентами. Растущая сложность смесифитохимикатыказалось, создать новыйредокс-активное веществоа не обогатить смесь новыми активностями, характерными для добавляемого соединения, что вытекает из концепции пищевой синергии.

Цистанхе может повысить иммунитет

В текущем исследовании мы упростили экспериментальную систему, ограничив ее только двумя структурами ядра, чтобы углубиться в детали их взаимодействия в контексте химической структуры, окислительно-восстановительной активности и связанной с окислительно-восстановительной биоактивностью, чтобы обеспечить лучшее понимание и предсказание химиопрофилактического потенциала антиоксидантов. «Фитохимические вещества, используемые для этой цели, представляли собой обычные антиоксиданты, присутствующие в различных травах, овощах и фруктах, особенно в цитрусовых, а именно: флавонолы, представленные кверцетином (O) и его рамно-сайд-рутин ( R) и флаванонов нарингенином (N-) и егонеогесперидозиднарингин (N plus ), а также две смеси этих соединений (QN-, RN plus ). Химический состав исследования включал определения, дающие некоторое представление о термодинамике и кинетике окислительных процессов, т.е. тест DPPH, потенциометрическое титрование и дифференциальную импульсную вольтамперометрию (DPV). В биологических тестах изучали влияние исследуемых образцов на рост клеток (МТТ-тест), клеточную антиоксидантную активность (анализ CAA), генотоксичность (кометный анализ), уровень глобального метилирования ДНК (эпигенетический вариант кометного анализа) и экспрессию 84 окислительно-восстановительных ферментов. родственные гены (технологии на основе массивов ПЦР в реальном времени). Биологические эксперименты проводились с использованием рекомендованной для диетологических исследований клеточной линии аденокарциномы толстой кишки HT29 в качестве модели кишечного эпителия, который может подвергаться воздействию относительно высоких концентраций принимаемых внутрь антиоксидантов.

Полученные результаты

Наши более ранние исследования, в которых сравнивались окислительно-восстановительные свойства какао-порошка и его основных компонентов, указывали на важность взаимодействия между полифенольными компонентами смеси для общей антиоксидантной активности. В текущем исследовании мы упростили экспериментальную систему, чтобы более подробно изучить такие взаимодействия для пары флавоноидов, которые являются обычными пищевыми компонентами. Были выбраны два флавоноида в форме агликонов и гликозидов. Флавонолы представлены кверцетином (Q) и егорамнозид-рутин(Р) ифлаванонынарингенином (N-) и его неогесперидозидом нарингином (N+). Эти полифенолы отличаются количеством и расположением окислительно-восстановительных гидроксильных групп, а также способностью образовывать внутримолекулярные Н-связи, т. е. тремя структурными особенностями, которые могут препятствовать снижению свойств антиоксидантных соединений. Как показано на рис. 1, промежуточные семихиноновые радикалы, образующиеся на первой стадии окисления катехинового фрагмента в кольце B

Q или R можно стабилизировать двумя способами i8,19. Первый способ - это сопряжение как структуры ядра по кольцам В и С, так и образование второй Н-связи с вицинальной ОН-группой или заместителями в кольце С, особенно в R. наличие гидроксильных групп в сахарном заместителе в положении 3 кольца C может еще больше усилить этот стабилизирующий эффект из-за большего количества возможностей образования Н-связей (непосредственно или через молекулу воды). C или H-связь с соседними заместителями. Более того, в N plus сахарная часть присоединена к кольцу А и, таким образом, находится слишком далеко, чтобы образовать Н-связь с радикалом в кольце В. Можно ожидать, что эти структурные особенности влияют на окислительно-восстановительную активность изученных флавоноидов.

Антиоксидантная активность химическими тестами.

Определение восстановительных свойств исследуемых полифенолов и их смесей проводили двумя химическими анализами при 37°С для соответствия клеточным условиям окислительно-восстановительных процессов. Первым методом был широко используемый периодический спектрофотометрический тест DPPH; результаты для отдельных флавоноидов и их смесей представлены на рис. 2А. Их выражают в виде стехиометрических значений n, где число 10 означает продолжительность реакции — 10 мин. Путем введения параметра времени в измерения кинетический аспект был включен в оценку антиоксидантной активности, как было описано ранее13. активнее флаванонов. O был наиболее эффективным соединением в удалении радикала DPPH, за ним следовал R. Несмотря на незначительную реакционную способность по отношению к DPPH, оба флаванона, включая N, который сам по себе не проявлял окислительно-восстановительных свойств в течение 10-минутного периода реакции, значительно увеличивали общую антиоксидантную активность смеси, в случае как агликонов НА-, так и гликозидов РН плюс.

Второй метод включал потенциометрическое титрование (ПТ), позволяющее измерить стандартный восстановительный потенциал (Е) и, таким образом, оценить термодинамическую способность чистых соединений приобретать электроны. Определенные значения подтвердили, что Q и R являются сильными восстанавливающими соединениями (рис. 2Б). Однако в PT R более охотно принимал донорные электроны, чем Q. Определение E для N- и Nplus не представлялось возможным из-за очень медленного переноса электронов в процессе окисления (медленнее для Nplus). ПТ измеряет разность потенциалов между электродом сравнения и измерительным электродом после добавления каждой порции титранта. Стационарный потенциал означает, что отношение реакции (Q) между титрантом и аналитом стабильно (Q= постоянна). Если скорость переноса заряда в ходе реакции мала (малые токи в вольтамперометрии), то для стабилизации добротности в ФП требуется много времени. Следовательно, для очень медленных реакций трудно получить кривую потенциометрического титрования и, таким образом, найденное значение Е" менее надежно.

Антиоксидантная активность по данным дифференциальной импульсной вольтамперометрии,

Используемые химические тесты показали, что при выяснении антиоксидантного действия полифенолов необходимо учитывать кинетические аспекты, где может играть роль стабильность промежуточных радикалов. Как показано на рис. 1, семихиноновые радикалы, образующиеся на первой стадии окисления флаванола, гораздо лучше стабилизированы, чем феноксильные радикалы, возникающие при окислении флаванона. Эта зависимость проиллюстрирована на рис. 1 и может влиять на скорость окислительно-восстановительных процессов. Поэтому дальнейший анализ восстановительно-окислительных свойств изученных чистых антиоксидантов и их смесей проводили с помощью дифференциальной импульсной вольтамперометрии (ДПВ). Поскольку этот метод позволяет отслеживать как термодинамические, так и кинетические аспекты реакций окисления, оба они, наконец, объединяются в параметре, называемом антиоксидантной способностью (АОП)15.

Наблюдения, сделанные с помощью измерений DPV (рис. 2B-F), противоречили наблюдениям, полученным с помощью теста DPPH (рис. 2A). Неожиданно DPV показал, что Q, описанный в литературе как превосходный восстановитель, при рассмотрении только термодинамических аспектов (потенциал анодного пика, E.) оказался самым слабым антиоксидантом (фиг. 2B, C). Термодинамически R был немного более сильным антиоксидантом. Интересно, что N- и N plus рассматриваются в литературе как слабые антиоксиданты, демонстрирующие термодинамически самые высокие значения E, что означает, что они являются очень сильными восстановителями. Для обоих классов флавоноидов гликозидная часть увеличивала антиоксидантную активность агликонов. Однако параметры, связанные с кинетикой (рис. 2E, F), т. е. анодный ток (I,.) и плотность заряда (Q), показали, что окисление N плюс является более медленным процессом по сравнению с окислением Q и R. Аналогичным образом , анодный ток (I) для N был ниже, чем для Q и R, но перенос заряда для этого соединения достигал наибольшего значения.

В случае смесей были обнаружены два анодных пика (1-й и 2-й) на вольтамперометрических кривых, как и следовало ожидать для двухкомпонентной смеси. Определенные значения потенциалов анодного пика (E.) показали, что 1-й наблюдаемый пик отражает окисление флавонолов, а 2-й пик — окисление флаванонов (дополнительные материалы — рис. S1). В большинстве случаев присутствие другого компонента в смесь влияла на термодинамику и/или кинетику окислительно-восстановительного процесса по сравнению с окислением чистых соединений.Например, для QN- значение E., для 1-го пика окисления было равно анодному пиковому потенциалу Q окисления. Однако 2-дюймовый анодный пик, соответствующий N-окислению, и потенциал этого перехода был выше, чем анодный потенциал чистого N- (фиг.2C). Противоположная ситуация наблюдалась для кинетики этой реакции. I и Q 1s-анодного пика QN были близки к кинетическим параметрам окисления чистых компонентов (рис. 2Д, Е), а перезарядка на 2n-стадии ON-окисления была значительно ниже, чем при N-окислении. (Рис.2F). Эти комбинированные термодинамические и кинетические эффекты привели к повышению АОП (рис. 2D) этой смеси, что согласуется с результатами теста DPPH.

Оценка цитотоксичности.

Влияние исследуемых флавоноидных агликонов (Q, N-), гликозидов (R, N плюс) и их смесей (QN-, RN плюс) на рост клеток кишечника оценивали с помощью МТТ-теста. Линия клеток аденокарциномы толстой кишки человека HT29 была выбрана в качестве модели эпителия пищеварительного тракта, т.е. ткани, находящейся в непосредственном контакте с проглоченными пищевыми ингредиентами, такими как полифенолы. Клетки обрабатывали отдельными флавоноидами и их смесями в физиологических концентрациях, потенциально присутствующих в крови (0.01-1 мкМ)22-2 или в концентрациях, достигаемых в пищеварительном тракте (10-100 мкМ) после приема пищи25-27. Кривые доза-реакция для 6, 24 и 72 часов лечения представлены на рис.3.

Индивидуальные соединения не оказывали существенного влияния на рост клеток ни в одной из исследованных концентраций ни при краткосрочной, ни при длительной обработке. Исключение составляла самая высокая концентрация N-, которая через 72 ч ингибировала рост клеток до 75% по сравнению с контролем. Напротив, исследованные смеси (QN-, RN плюс) значительно стимулировали рост клеток в зависимости от концентрации для всех протестированных периодов воздействия. Этот эффект наблюдался при низких концентрациях (0.01-1 мкМ), достигаемых в кровотоке, и был еще более сильным при более высоких концентрациях (10-100 мкМ), к которым эпителиальные клетки пищеварительного тракта может быть разоблачен. Только в случае самой высокой концентрации QN- после 72-часовой обработки стимуляция прекращалась, вероятно, из-за наблюдаемых в таких условиях ингибирующих эффектов для N-. Клеточная антиоксидантная активность. Эффективность очищенных флавоноидов и их смесей в поддержании эндогенного антиоксидантного барьера клеток НТ29 была проверена с помощью анализа CAA. Этот метод основан на способности образца, содержащего редокс-активные соединения, ингибировать или стимулировать окисление поглощенного зонда. клетками до его флуоресцентной формы. Ослабление окисления зонда, наблюдаемое как тушение флуоресценции, является мерой восстановительной способности антиоксидантов в клетках (положительные значения САА), а увеличение окисления зонда указывает на их прооксидантную активность (отрицательные значения САА)28. . Определения проводились для агликонов и гликозидов в концентрациях, отражающих как физиологическое (эндогенное), так и пищевое (экзогенное) воздействие на кишечник. Инкубацию с исследуемыми флавоноидами проводили в течение стандартного рекомендуемого времени 1 ч18 для агликонов и гликозидов. Длительные обработки (3 и 6 ч), направленные на мониторинг кинетики окислительно-восстановительного ответа в применяемой клеточной модели, применялись только в случае агликонов из-за их более выраженного влияния на антиоксидантную активность клеток.

Исследуемые флаваноны и флавонолы различались по влиянию на редокс-статус клеток НТ29. В случае отдельных агликонов определенные реакции, зависящие от концентрации, наблюдались после 1-часового воздействия. Однако антиоксидантная активность флавонола-Q увеличивалась с применяемой концентрацией, в то время как в случае флаванона-N- наблюдалось постепенное усиление прооксидантного эффекта (рис. 4А). Дозозависимость отдельных гликозидов была менее очевидной; только R в его самой высокой концентрации убедительно увеличивал клеточную антиоксидантную активность (рис. 4А). Интересно, что обе смеси проявляли повышенную антиоксидантную активность, по-видимому, не подверженную влиянию прооксидантного эффекта, наблюдаемого у отдельных соединений.

На рис. 4В представлена ​​кинетика изменения значений САА, определенная после 1, 3 и 6-часовой обработки клеток НТ29 агликонами. Для самой низкой концентрации (1 мкМ), соответствующей физиологическим воздействиям, зависимость от времени не наблюдалась ни для отдельных агликонов, ни для их смеси. Однако влияние более высокой концентрации на значения CAA явно зависело от времени. Длительное воздействие снижало как прооксидантный эффект N-, так и антиоксидантную активность Q и QN-.

Исследуемые агликоны проявляли различную нутригеномную активность, дополнительно изменяемую концентрацией, применяемой к клеткам.

Флаванон N-при 1 мкМ значительно снижал экспрессию CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Этот флаванон, применяемый к клеткам HT29 в концентрации 10 мкМ, влиял на экспрессию 5 генов, которые также подавлялись его более низкой дозой, а именно: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

дисмутация супероксидных радикалов на перекись водорода и кислород6. Небольшое увеличение экспрессии, вызванное N-в концентрации 10мкМ, наблюдалось только для гена VIMP (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Эта статья взята с сайта www.nature.com/scientificreports.