Железосодержащие добавки замедляют старение и продлевают жизнь клеток за счет потенцирования митохондриальной функции Ⅱ

3.2. Добавка железа повышает устойчивость к окислительному стрессу

Нажмите здесь, чтобы получить дополнительную информацию о том, как Cistanche снижает окислительный стресс в вашем организме

Клеточное старение связано сповышенный окислительный стресскоторый повреждает биологические системы и смягчает возрастные заболевания [34]. Поскольку добавки железа замедляют старение, мы исследовали его влияние наокислительный стресс. Мы использовалиокислительный стрессиндукторное соединение, перекись водорода ( H2O2), чтобы проверить окислительную устойчивость клеток. Сначала клетки выращивали в присутствии железа до стадии стационарной фазы (72 ч) в среде SD. После этого клетки промывали и инкубировали с различными концентрациями H.2O2 на среде YPD и росли в течение 24 ч.окислительныйустойчивость к стрессу анализировали, сравнивая рост клеток, обработанных H2O2-, с необработанным контролем. Мы обнаружили, что клетки, дополненные железом, были устойчивы к окислительному стрессу по сравнению с контролем (рис.2а и S3). Чтобы подтвердить, что добавки железа обеспечивают устойчивость к окислительному стрессу, BPS был добавлен к железу и росту клеток с H.2O2 был проанализирован. Добавление BPS снижало устойчивость к окислительному стрессу клеток с добавками железа (рис.2б). Эти результаты коррелируют с ролью добавок железа в замедлении старения и увеличении продолжительности жизни клеток.

3.3. Добавки железа усиливают митохондриальные функции

Митохондрии являются основным клеточным центром утилизации и метаболизма железа [35–38]. Снижение митохондриальных функций связано со старением [39–43]. Железо служит кофактором нескольких митохондриальных белков, включая железо-серные кластеры и гемсодержащие белки [44–46]. Эти железосодержащие белки участвуют в митохондриальном цикле трикарбоновых кислот (TCA) и цепи переноса электронов (ETC) (рис. 3а). Мы исследовали, требует ли увеличение продолжительности жизни клеток за счет добавок железа митохондриальных функций. Чтобы проверить это, мы проанализировали экспрессию генов митохондриального цикла ТСА. Мы обнаружили, что добавки железа в значительной степени индуцируют экспрессию нескольких генов цикла ТСА (рис. 3b и S4a). Метаболиты цикла ТСА - кетоглутарат и оксалоацетат могут продуцировать глутамат и аспартат в результате катаплеротических реакций в митохондриях (рис. 3а). Эти аминокислоты используются в биосинтезе белков, липидов и нуклеотидов [47–49]. Интересно, что экспрессия генов биосинтеза глутамата (GDH1 и GDH3) и аспартата (AAT1 и AAT2) была снижена в клетках, дополненных железом (рис. 3c). Этот профиль экспрессии предполагает, что добавки железа способствуют сохранению, а не потреблению промежуточных продуктов цикла ТСА. В соответствии с этой идеей, экспрессия генов митохондриального анаплеротического пути (PYC1, PYC2 и GDH2) была значительно увеличена в клетках с добавлением железа (рис. 3с). PYC1 и PYC2 кодируют пируваткарбоксилазу, которая превращает пируват в оксалоацетат. GDH2 кодирует глутаматдегидрогеназу, которая синтезирует -кетоглутарат из глутамата. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что добавки железа настраивают клетки в метаболическое состояние, которое способствует анаплерозу и предотвращает катаплероз, чтобы увеличить количество метаболитов цикла ТСА.

Рисунок 3.Добавки железа улучшают функции митохондрий. (a) Обзор митохондриальнойЦикл ЦТК (трикарбоновых кислот) и ЭТЦ (цепь переноса электронов) с основными катаплеротическими ипроиллюстрированы анаплеротические реакции. (b) Штамм прототрофных дрожжей инкубировали со 100µM FeSO4 и выращивали на среде SD в течение 8 ч при 30◦C. РНК экстрагировали из культур иЭкспрессию указанных генов цикла ТСА анализировали с помощью количественной ОТ-ПЦР. (c) Выражениеанализ катаплеротических генов (ГДГ1, ГДГ3, ААТ1,иААТ2) и анаплеротических генов (PYC1, ПИЦ2,иГДГ2) проводили с помощью количественной ОТ-ПЦР. (d) Анализ экспрессии генов ETC проводили с помощьюколичественная ОТ-ПЦР. Статистическая значимость (*p < 0.05) was determined by Student's t-тест.

В реакциях цикла ТСА образуются НАДН и ФАДН.2 которые окисляются комплексами ETC I и II и необходимы для функционирования цикла TCA (рис.3а). ХотяС. cerevisiaeне хватает комплекса I, восстанавливающие эквиваленты передаются в дыхательную цепь с помощью НАДН-дегидрогеназ. Сукцинатдегидрогеназа играет центральную роль и участвует как в цикле ЦТК, так и в комплексе ЭТЦ II (рис.3а). Поразительно, но экспрессия сукцинатдегидрогеназы (SDH1иSDH2) был сильно активизирован среди всех проанализированных генов цикла ТСА (рис.3б, г). Эти результаты указывают на то, что поток цикла TCA продолжается в направлении ETC вместо накопления определенного промежуточного продукта. Точно так же экспрессия всех других генов комплексов ETC была сильно повышена в клетках с добавками железа (рис.3г). ETC связан с образованием активных форм кислорода (АФК), которые регулируют экспрессиюСОД2ген [50]. Он кодирует марганцево-супероксиддисмутазу (MnSOD), которая является основным поглотителем митохондриального супероксида.СОД2экспрессия генов повышалась в клетках с добавками железа (дополнительная фигура S4a), что согласуется с экспрессией генов ETC. Далее мы проанализировали митохондриальный мембранный потенциал (ММП), который генерируется протонными насосами комплексов ETC I, III и IV. Мы обнаружили, что добавки железа увеличивают ММР клеток (дополнительная фигура S4b). Затем мы исследовали структуру митохондрий с помощью флуоресцентной микроскопии. Мы обнаружили, что добавки железа предотвращают фрагментацию митохондрий (дополнительная фигура S4c). В целом эти результаты показывают, что добавки железа усиливают митохондриальные функции клеток.

3.4. Добавки железа повышают уровень АТФ, необходимый для продления жизни клеток

В реакциях митохондриального цикла ТСА образуются восстанавливающие эквиваленты НАДН и ФАДН2, которые переносят электроны на ЭТЦ и генерируют аденозинтрифосфат (АТФ) посредством окислительного фосфорилирования (ОКФОС) (рис.3а). Поскольку экспрессия генов цикла ТСА и ЭТС усиливалась при приеме добавок железа, мы проверили его влияние на синтез АТФ. В соответствии с профилем экспрессии митохондриального цикла TCA, экспрессия гена ETC и уровни АТФ были высокими в клетках с добавлением железа (рис.4а). Затем мы спросили, требуется ли АТФ для продления жизни клеток, обогащенных железом. Мы ингибировали синтез АТФ и измеряли CLS дрожжей. Антимицин А (АМА) является ингибитором синтеза АТФ, который связывается с комплексом III и блокирует перенос электронов в митохондриальной ЭТЦ.51]. Сначала мы изучили уровень АТФ и обнаружили, что лечение АМА ингибирует синтез АТФ (рис.4б). Далее мы проверили влияние АМА на продолжительность жизни клеток, обогащенных железом. Клетки дрожжей инкубировали с железом и АМА в среде SD. Рост клеток достиг насыщения через 24 часа (дополнительная фигура S5). Впоследствии мы измерили выживаемость и обнаружили, что лечение АМА ингибирует увеличение продолжительности жизни, опосредованное добавками железа (рис.4в). Вместе эти результаты показывают, что добавки железа повышают уровень АТФ, который необходим для увеличения продолжительности жизни клеток. Мы также заметили, что продолжительность жизни клеток, обработанных АМА, была ниже, чем в контроле (рис.4в), что еще раз подтверждает, что неспособность синтезировать АТФ снижает продолжительность жизни.

3.5. Добавки железа предотвращают ускоренное старение нокаут-мутанта AMPK

AMPK является основным регулятором гомеостаза клеточной энергии.20,21]. Высококонсервативный человеческий аналог AMPK в дрожжахС. cerevisiaeпредставляет собой белок Snf1 [52]. AMPK активирует функции митохондрий для производства АТФ в условиях ограниченной энергии. Недавние сообщения показали, что снижение митохондриальных функций с возрастом частично происходит из-за нарушения активности AMPK в разных возрастных организмах.53,54]. Таким образом, отсутствие активности AMPK влияет на функции митохондрий и ставит под угрозу многочисленные клеточные функции, включая метаболизм, устойчивость к стрессу и выживаемость клеток, которые являются наиболее важными детерминантами старения и продолжительности жизни. В соответствии с предыдущими исследованиями мыобнаружил, чтоsnf1Нокаутная мутация скомпрометировала уровень АТФ, устойчивость к окислительному стрессу и продолжительность жизни (рис.5a–c). 

Рисунок 5.Добавки железа спасают ускоренное старение мутанта с нокаутом AMPK.дрожжевой прототрофный дикий тип и мутантный нокаут AMPK (snf1∆) штаммы выращивали до стационарныхфазы в среде SD в течение 72 ч при 30◦C. (a) АТФ-анализ дикого типа иsnf1∆ штаммы. (b) Окислительныйстресс-анализ дикого типа иsnf1∆ штаммы с разным H2O2 концентрации. (c) Хронологическийанализ продолжительности жизни (CLS) дикого типа иsnf1∆ штаммы. (d) АТФ-анализ дикого типа иsnf1∆ штаммыинкубировали с различными концентрациями FeSO4. (e) Анализ окислительного стресса дикого типа иsnf1∆ штаммы, инкубированные с различными концентрациями FeSO4. (f) Анализ CLS дикого типа иsnf1∆ штаммы, инкубированные с различными концентрациями FeSO4. Статистическая значимость (*p < 0.05) was determinedпо студенческомуt-тест.

Посколькуsnf1мутант дефектен в митохондриальных функциях, мы проверили, могут ли добавки железа спасти фенотипы ускоренного старения. Поэтому мы дополнили железо доsnf1мутант и проанализировали уровень АТФ, окислительный стресс и продолжительность жизни. Мы обнаружили, что добавки железа повышают уровень АТФ, устойчивость к окислительному стрессу и продолжительность жизни (рис.5г–е). В целом эти результаты подтвердили, что добавки железа замедляют старение и увеличивают продолжительность жизни клеток за счет усиления функций митохондрий.

4. Дискуссия

Питательные вещества определяют функциональное состояние клеток, а дефицит основных питательных веществ ставит под угрозу здоровье человека.55,56]. Кроме того, питательные вещества являются основными регуляторами клеточного метаболизма, который контролирует несколько биологических процессов, включаястарение, основной фактор риска несколькиххронические болезни. Снижениеметаболическая активностьявляется одним из отличительных признаковстарение [10]. Недавние исследования на различных организмах, включая млекопитающих, показали, что замедление старения и увеличение продолжительности жизни возможно с помощью антивозрастных вмешательств, включая введение препаратов рапамицина и метформина.11,16]. Эти препараты нацелены на чувствительные к питательным веществам комплексы TORC1 и AMPK, которые являются важными регуляторами метаболизма клеток.11,16]. 

Железо является важным питательным веществом, участвующим в нескольких важных метаболических реакциях в клетках.23–26]. Дефицит железа ухудшает метаболическую активность, что приводит к нарушению клеточных функций, что приводит ко многим заболеваниям, включая анемию, когнитивные нарушения и потерю сознания.мышечная сила [26,57–59]. Дефицит железа широко распространен среди пожилых людей в возрастеБольше или равно65 лет [60–62]. 

Поскольку железо регулирует метаболические процессы, мы исследовали его роль в старении. Мы использовали дрожжи в качестве модельного организма для изучения роли железа в хронологическом старении. Мы исследовали влияние добавок железа на CLS дрожжей. Мы обнаружили, что оба FeSO4 и FeCl3 увеличивает продолжительность жизни клеток. Используя различные соли сульфата, хлорида и хелатора железа, мы подтвердили, что железо увеличивает продолжительность жизни клеток. Старение связано с постепенным накоплением окислительного стресса, который вреден для клеточных функций и снижает выживаемость клеток.34]. Поскольку мы обнаружили, что добавки железа замедляют старение, мы проверили, может ли она обеспечить устойчивость к окислительному стрессу. Чтобы изучить фенотип окислительного стресса, мы обрабатывали клетки индуктором окисления H.2O2 и измерили выживаемость клеток. Мы обнаружили, что добавки железа повышают устойчивость к окислительному стрессу по сравнению с контролем. Эти результаты коррелируют с ролью добавок железа в увеличении продолжительности жизни.

Далее мы раскрыли антивозрастной механизм добавок железа. Митохондрии являются основными клеточными потребителями утилизации и метаболизма железа.35–38]. Сначала мы проанализировали экспрессию генов митохондриального цикла ТСА. Мы обнаружили, что экспрессия почти всех генов цикла ТСА повышалась при приеме добавок железа. Важно отметить, что добавки железа подавляли экспрессию митохондриального анаплероза и активировали катаплеротические метаболические гены. Эти результаты показывают, что добавки железа усиливают синтез промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот и предотвращают их использование клетками. Эти результаты подтверждают омолаживающую активность добавок железа, поскольку регулярный экспорт промежуточных продуктов цикла ТСА влияет на целостность митохондрий.47]. Более того, пополнение пула митохондриального углерода необходимо для поддержания митохондриальных функций, необходимых для выживания во время клеточного старения.

Промежуточный продукт цикла ТСА Было показано, что -кетоглутарат увеличивает продолжительность жизни различных организмов.63]. Однако мы обнаружили, что добавки железа увеличивают экспрессию -кетоглутаратдегидрогеназа (КГД1иКГД2), который преобразует - кетоглутарата с образованием сукцинил-КоА. Более того, мы наблюдали, что экспрессия генов сукцинатдегидрогеназы (SDH1иSDH2) был сильно активизирован среди других протестированных генов цикла ТСА. Важно отметить, что сукцинатдегидрогеназа участвует как в цикле трикарбоновых кислот, так и в комплексе ЭТЦ II. Эти результаты свидетельствуют о том, что вместо накопления определенного промежуточного продукта цикла ТСА омолаживающая активность добавок железа может включать путь ЭТС.

Поскольку цикл ЦТК функционально связан с ЭТЦ, мы проанализировали экспрессию генов ЭТЦ. Мы обнаружили, что добавки железа значительно повышали экспрессию генов ETC. Продукты цикла ТСА НАДН и ФАДН2 окисляются комплексами ЭТЦ и генерируют АТФ через OXPHOS. Мы обнаружили, что добавки железа повышают уровень клеточного АТФ, что коррелирует с активацией цикла ЦТК и генов ETC. Затем мы выяснили, требуется ли увеличение уровня АТФ за счет добавок железа для увеличения продолжительности жизни клеток. Мы обнаружили, что увеличение продолжительности жизни за счет добавок железа было отменено за счет ингибирования синтеза АТФ. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что добавки железа повышают уровень АТФ, который необходим для увеличения продолжительности жизни клеток. Наши результаты согласуются с предыдущими отчетами, показывающими роль АТФ в продолжительности жизни клеток.51,64,65]. Кроме того, мы использовали добавки железа для улучшения митохондриальных функций и спасли короткую продолжительность жизни и чувствительный к окислительному стрессу фенотип мутанта AMPK. В целом эти результаты показали, что добавки железа усиливают митохондриальные функции, замедляющие старение и увеличивающие продолжительность жизни клеток.

Недавние исследования показали, что добавки железа восстанавливают митохондриальный дефект у мутантов с нарушением лизосом и предотвращают угасание митохондрий при старении.66,67]. Таким образом, наши результаты подтверждают предыдущие выводы о том, что добавки железа улучшают функции митохондрий. Интересно, что одно из более ранних исследований показало, что добавки железа останавливали ускоренное репликативное старение мутантов с нарушением лизосом; Однаковлияние на клетки дикого типа не было включено в отчет.67]. Тем не менее, наши результаты коррелируют с предыдущими выводами, и, несмотря на разные модели старения (хронологическое старение), мы обнаружили, что добавки железа замедляют старение и увеличивают продолжительность жизни клеток. Таким образом, в совокупности наши результаты и предыдущие отчеты ясно показывают, что добавки железа могут быть потенциальным терапевтическим средством для борьбы со старением и увеличения продолжительности жизни.

Дополнительные материалы:Рисунок S1: Анализ роста и хронологической продолжительности жизни дрожжевых клеток с добавками железа; Рисунок S2: Анализ роста различных дрожжевых клеток, обогащенных железом, сульфатом и хлоридом; Рисунок S3: Анализ устойчивости к окислительному стрессу дрожжевых клеток с добавками железа. Рисунок S4: Экспрессия митохондриальных генов, мембранный потенциал и структурный анализ дрожжевых клеток с добавками железа; Рисунок S5: Анализ роста дрожжевых клеток с добавками железа и антимицина А; Таблица S1: Список праймеров, использованных для ОТ-ПЦР в этом исследовании.

Вклад автора:JLJ: методология, формальный анализ, исследование и обзор; TCYN: методология, формальный анализ, исследование и обзор; FN: проверка, формальный анализ и проверка; FE: просмотр, редактирование и контроль; MA: Концептуализация, обработка данных, методология, написание, проверка, редактирование и контроль. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование:Эта работа была поддержана Институтом биоинформатики (BII), Фондом развития карьеры A*STAR (C210112008) и грантом Global Healthy Longevity Catalyst Awards (MOH-000758-00).

Благодарности:Мы благодарим Maurer-Stroh Sebastian, Lee Hwee Kuan, Loo Lit Hsin, Chiam Keng Hwee и Prakash Arumugam за поддержку этого исследования.

Конфликт интересов:Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых и нефинансовых интересов.

Рекомендации

1. Блум, Делавэр; Каннинг, Д.; Любет, А. Глобальное старение населения: факты, проблемы, решения и перспективы.Чал. Раствор. Перспектива. Дедал2015, 144, 80–92. 

2. Департамент Организации Объединенных Наций по экономическим и социальным вопросам, Отдел народонаселения.Перспективы народонаселения мира 2019 г.; Основные моменты (ST/ESA/SERA/423); ООН: Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США, 2019 г.

3. Робин, Дж.Старение населения: мы живем дольше, но здоровее ли мы?Организация Объединенных Наций, Департамент по экономическим и социальным вопросам, Отдел народонаселения: Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США, 2021 г.; ДЭСВ ООН/POP/2021/TP/NO.

4. Никколи Т.; Партридж Л. Старение как фактор риска заболеваний.Курс. биол.2012, 22, R741–R752. [перекрестная ссылка] [пабмед] 

5. Хоу, Ю.; Дэн, X .; Баббар, М.; Вэй, Ю .; Хассельбальх, С.Г.; Крото, Д.Л.; Бор В.А. Старение как фактор риска нейродегенеративных заболеваний.Нац. Преподобный Нейрол.2019, 15, 565–581. [перекрестная ссылка] [пабмед] 

6. Харман Д. Процесс старения: главный фактор риска болезней и смерти.проц. Натл. акад. науч. США1991, 88, 5360–5363. [перекрестная ссылка] [пабмед] 

7. Партридж Л.; Дилен, Дж.; Slagboom, PE Решение глобальных проблем старения.Природа2018, 561, 45–56. [перекрестная ссылка] [пабмед] 8. Фонтана, Л.; Кеннеди,

БК; Лонго, В. Д.; Силс, Д.; Мелов С. Медицинские исследования: Лечение старения.Природа2014, 511, 405–407. [перекрестная ссылка] [пабмед] 

9. Фонтана, Л.; Партридж, Л.; Лонго, В. Д. Увеличение продолжительности здоровой жизни — от дрожжей до человека.Наука2010, 328, 321–326. [перекрестная ссылка] [пабмед] 

10. Lóпез-отíн, с.; Бласко, Массачусетс; Партридж, Л.; Серрано, М.; Кремер Г. Признаки старения.Клетка2013, 153, 1194–1217. [перекрестная ссылка] 

11. Партридж Л.; Фуэнтеальба, М.; Кеннеди, Б. К. Стремление замедлить старение с помощью открытия лекарств.Нац. Преподобный Друг Дисков.2020, 19, 513–532. [перекрестная ссылка]

12. Циммерманн, А.; Хофер, С .; Пендл, Т .; Кайнц, К .; Сделано из.; Кармона-Гутьеррес, Д. Дрожжи как инструмент для выявления соединений, замедляющих старение.FEMS Yeast Res.2018, 18, фой020. [перекрестная ссылка] 

13. Каберляйн, М.; Бертнер, ЧР; Кеннеди, Б.К. Последние разработки в области старения дрожжей.Генетика PLoS.2007, 3, e84. [перекрестная ссылка] 

14. Лонго В.Д.; Шадель, Г.С.; Каберлейн, М .; Кеннеди, Б. Репликативное и хронологическое старение всахаромицеты церевисиае. Клеточный метаб.2012, 16, 18–31. [перекрестная ссылка] 15. Лонго, В.Д.; Фабрицио, П. Хронологическое старение Saccharomyces cerevisiae.Старение рез. Дрожжи2011, 57, 101–121. [перекрестная ссылка] 

16. Кулкарни, А.С.; Губби, С.; Барзилай, Н. Преимущества метформина в ослаблении признаков старения.Клеточный метаб.2020, 32, 15–30. [перекрестная ссылка] 

17. Алфата, М.; Вонг, Дж. Х.; Кришнан, В.Г.; Ли, ЮК; Грех, КФ; Го, CJH; Конг, кВт; Ли, ВТ; Льюис, Дж.; Хун, С .; и другие. TORC1 регулирует транскрипционный ответ на глюкозу и цикл развития посредством пути Tap42-Sit4-Rrd1/2 у Saccharomyces cerevisiae.БМС Биол.2021, 19, 1–22. [перекрестная ссылка] 

18. Сакстон, РА; Сабатини, передача сигналов DM mTOR в росте, метаболизме и заболевании.Клетка2017, 168, 960–976. [перекрестная ссылка]