Полисахариды мармелада смягчают анемию у крыс с хронической болезнью почек

Контактное лицо: emily.li@wecistanche.com

Шиин Хуан и др.

Абстрактный

Полисахариды ююбы (JP) являются одним из активных гликанов пищевого происхождения в диетических плодах Ziziphus jujuba, которые рассматривались для лечения дефицита крови. В этом исследованиихроническийпочкаболезнь(CKD) крысиная модель использовалась для оценки влияния JP и его механизма на анемию, связанную с CKD. У крыс с ХБП лечение JP значительно улучшилопочкафункция, почкапатологическийрана, и гематологические параметры, в том числе увеличение количества эритроцитов, гемоглобина, гематокрита и тромбоцитов. Более того, результаты целевой метаболомики ЖХ-МС/МС показали, что JP способствует высвобождению короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) у крыс с ХЗП. Кроме того, JP изменял уровень эритропоэтина в сыворотке (ЭПО), мРНК ЭПО в почках ипочкаБелок ЭПО посредством передачи сигналов HIF. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что влияние JP на анемию, связанную с ХБП, может быть связано с регуляцией высвобождения SCFAs и продукции эритропоэтина, что поддерживает дальнейшее развитие JP в качестве пищевых добавок для лечения анемии, связанной с ХБП.

Ключевые слова: полисахариды мармелада.Хроническийпочка болезньАнемия Эритропоэтин Индуцируемый гипоксией фактор Короткоцепочечные жирные кислоты

Нажмите здесь, чтобы получить больше информации о Cistanche

1. Введение

Хроническийпочка болезнь(ХБП) определяется как клинический синдром почечных структурных аномалий или функциональных нарушений и становится все более серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире (Webster, Nagler, Morton, & Masson, 2017). Почечная анемия является одним из наиболее частых осложнений ХБП, которые способствуют повышению риска смерти (Locatelli et al., 2019). Недостаточность выработки эритропоэтина (ЭПО) является признанным основным движущим фактором анемии при ХБП (Pappa, Dounousi, Duni, & Katopodis, 2015). ЭПО вырабатывается в печени ипочка, который необходим для производства эритроцитов (Lappin & Lee, 2019). В условиях гипоксии фактор, индуцируемый гипоксией (HIF), может активировать экспрессию EPO (Schödel & Ratcliffe, 2019). Таким образом, нацеливание HIF на индукцию продукции EPO считается новой терапевтической стратегией для лечения анемии, связанной с ХБП.

Мармелад – это плоды Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), также известный как китайский финик. Мармелад имеет давнее традиционное использование, насчитывающее тысячи лет, в качестве лекарственного растения и пищевой добавки. Мармелад используется в качестве пищевой добавки для людей, страдающих гематогенным или хроническим недоеданием. Полисахариды мармелада (JP), водорастворимый компонент, состоящий из моносахаридов и уроновой кислоты в различных соотношениях (Ji, Hou, Yan, Shi, & Liu, 2020), являются одним из активных ингредиентов мармелада (Ji et al., 2017). ), который, как хорошо известно, проявляет гепатопротекторный эффект и иммуномодулирующую активность и усиливает барьерную функцию кишечника (Liu et al., 2015, Yue et al., 2015). Действительно, считается, что JP также может оказывать потенциальное влияние на анемию. Однако молекулярный механизм ЯП при лечении анемии еще менее известен.

В последние годы метаболомика широко используется для понимания потенциальных факторов, способствующих прогрессированию заболевания. Целевая метаболомика широко используется для идентификации молекулярных маркеров сложных заболеваний человека, таких как ХБП. Было подтверждено, что индоксилсульфат (ИС) и п-крезилсульфат (ПКС) являются биомаркерами прогрессирования ХБП (Meijers & Evenepoel, 2011), а повышенный уровень триметиламин-N-оксида (ТМАО) может непосредственно приводить к почечному тубулоинтерстициальному фиброзу и дисфункции. (Танг и др., 2015). Короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), метаболиты, зависящие от микробов кишечника, являются энергетическими субстратами, способными влиять на различные физиологические процессы (LeBlanc et al., 2017), и, как сообщается, снижение содержания КЦЖК способствует прогрессированию ХБП. (Кох, Де Вейдер, Ковачева-Датчари и Бэкхед, 2016 г., Ван и др., 2019 г.). Более того, SCFAs были способны защищать структуру почек от повреждений за счет ингибирования окислительного стресса (Li, Ma, & Fu, 2017). В то же время было обнаружено, что SCFAs оказывают благотворное влияние на абсорбцию железа и усиливают экспрессию генов эмбрионального/фетального глобина, что индуцирует эритропоэз и устраняет анемию (Tako, Glahn, Knez, & Stangoulis, 2014). Однако механизм действия КЦЖК при почечной анемии еще предстоит выяснить.

В этом исследовании мы предполагаем, что JP может регулировать высвобождение SCFAs и стимулировать HIF-опосредованную продукцию EPO, результатом чего является коррекция почечной анемии. Здесь мы будем исследовать влияние JP на улучшение почечной анемии у 5/6 нефрэктомированных крыс с ХЗП, включая функцию почек и гематологические параметры. Целевой метаболомный подход с использованием ЖХ-МС/МС разработан для определения восьми короткоцепочечных жирных кислот, включая уксусную кислоту, пропановую кислоту, изомасляную кислоту, масляную кислоту, 2-метилмасляную кислоту, изовалериановую кислоту, валериановую кислоту и гексановую кислоту в фекалиях и образцы почек и уровни целевых SCFAs оцениваются у здоровых крыс и крыс с ХЗП. Кроме того, также выявлено участие передачи сигналов HIF у крыс, получавших JP.

Рис. 1. Типичная ГХ-МС хроматография JP. (A) Структурные формулы моносахаридов после дериватизации ацетата альдононитрила; (B) Репрезентативные профили смешанной ионной хроматографии (МИК) ГХ-МС стандартной смеси моносахаридов и гидролизованных моносахаридов JP. Пики на хроматографических профилях соответствовали химическому маркеру, показанному на (А): 1. рамноза, 2. арабиноза, 3. фукоза, 4. ксилоза, 5. манноза, 6. глюкоза, 7. галактоза, 8. инозитол (ISTD ).

2. Материалы и методы

2.1. Получение полисахарида мармелада

Плоды Z. jujuba были приобретены у Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Аутентичность материалов подтверждена доктором Цзяньпином Ченом в соответствии с Фармакопеей Китайской Народной Республики, издание 2015 г. Образцы ваучеров хранились в Шэньчжэньской больнице традиционной китайской медицины под номером 18100601.

Неочищенный JP был извлечен из мармелада, как описано ранее, с небольшими изменениями (Ji et al., 2020). Вкратце, мармелад инкубировали с 10 объемами воды (по объему) на водяной бане при 80°С в течение 3 ч и экстрагировали 3 раза. После фильтрации объедините фильтраты и конденсируйте эту смесь в роторном испарителе под регулируемым вакуумом. Раствор концентрата дополнительно осаждали добавлением четырехкратного количества этанола (об./об.) при 4°С в течение 12 часов. Осадок собирали центрифугированием и сушили при пониженном давлении досуха, получая сырой JP. С помощью калориметрии было определено, что чистота JP составляет 80 процентов.

2.2. Характеристика моносахаридного состава полисахарида мармелада

Система ГХ-МС Shimadzu (Shimadzu GC-MS TQ8040, сопряженная с Shimadzu GC 2010 plus), оснащенная источником ЭУ, капиллярной колонкой SH-Rxi-5Sil MS (30 м × внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, Shimadzu) использовали для определения дериватизации гидролизованных моносахаридов с коэффициентом разделения 10:1. Температура инжекции, источника ионов и границы раздела составляла 250 ◦C, 200 ◦C и 250 ◦C. Начальную температуру колонки поддерживали на уровне 120°С в течение 1 мин, затем повышали со скоростью 15°С/мин до 160°С и поддерживали в течение 4 мин, 2°С/мин до 165°С и поддерживали в течение 2 мин, 20°С. /

мин до 195 ◦C, 5 ◦C/мин до 250 ◦C, выдержка 3 мин. Скорость потока газа-носителя гелия поддерживали на уровне 46 см/с, и в прибор вводили по 2 мкл каждого образца. Количественное определение аналитов проводили в режиме мониторинга выбранных ионов (SIM), целевой ион: рамноза (m/z 129.00), арабиноза (m/z 115.00), фукоза (m/z 115.00). z 103.00), ксилоза (m/z 115.00), манноза (m/z 115.00), глюкоза (m/z 115.00 ), галактоза (м/з 115.00), инозитол (м/з 126.00). Стандарты моносахаридов были перечислены следующим образом: L (плюс)-арабиноза (1506–200202), фукоза (112014–201902), D-ксилоза (111508–201605), D-глюкоза (110833–201908), рамноза (111683–201502). ), галактозу (100226–201807), D-маннозу (140651–201805) приобретали в Национальных институтах контроля пищевых продуктов и лекарственных средств. Инозитол был получен от Sigma (17508-50 г).

Экстрагированный JP (10 мг) гидролизовали до моносахаридов с помощью 10 мл 2 моль/л трифторуксусной кислоты (TFA) при 105 ◦C в течение 3 ч, гидролизованные моносахариды из JP концентрировали и промывали при пониженном давлении при 60 ◦C до удаляли ТФУ, а остатки восстанавливали 2 мл воды. Добавляли 250 мкл раствора гидрохлорида гидроксиламина/пиридина с концентрацией 20 мг/мл в 100 мкл раствора гидролизованных моносахаридов и выдерживали на водяной бане при 90°С в течение 45 мин. Затем добавляли 250 мкл уксусного ангидрида и выдерживали на водяной бане при 90 ◦C еще 45 мин. По окончании реакции смесь экстрагировали 1 мл циклогексана 5 раз и циклогексановый слой концентрировали до 1 мл. Ввели 1 мкл супернатанта в ГХ-МС для анализа (Li & Shi, 2013).

2.3. Животные

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по использованию институционального ухода за животными Университета китайской медицины Гуанчжоу. Крысы Sprague-Dawley, самцы и самки, массой 180–220 г, были получены из Гуандунского медицинского лабораторного центра животных (Фошань, Китай, разрешение № SCXK (Yue) 2008–0002) и содержались в среде, свободной от патогенов (SPF). ) помещения для животных с 12-часовым циклом свет-темнота, со свободным питанием и водой.

Для индуцированной почечной недостаточности выполняли нефрэктомию 5/6 согласно предыдущему описанию (Chen et al., 2019). Все хирургические операции проводились под наркозом 10-процентным раствором хлоралгидрата. Группа ложной операции (n=6) предприняла те же шаги, чтобы открыть брюшную полость и обнажить почку. Крыс после нефрэктомии 5/6 случайным образом разделили на две группы. Крысы без лечения (группа ХБП, n=6) и крысы, получавшие JP (группа ХБП плюс JP, n=6) ​​перорально через желудочный зонд в дозе 1,2 г/кг/сут. После 90 дней работы начались 90 дней приема. 90-й день был последним временем введения JP крысам, и через 24 ч животных умерщвляли, беря кровь из брюшной аорты, и у каждой крысы собирали образцы мочи, кала, сыворотки и почек. Все образцы хранились при температуре -80 ◦C перед дальнейшим анализом.

2.4. Биохимический анализ

Следуя инструкциям производителя, азот мочевины крови (BUN) и креатинин сыворотки (Scr) измеряли с помощью набора для определения креатинина в сыворотке и набора для обнаружения BUN (WAKO, Ginza, Japan), а белок мочи измеряли с помощью набора Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Нанкин, Китай). Эритроциты (RBC), гемоглобин (Hb), гематокрит (HCT) и количество тромбоцитов (PLT) анализировали с помощью Hematology Systems (Siemens 2021i, Эрланген, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.

2.5. Гистологическое исследование

Окрашивание периодической кислотой по Шиффу (PAS) и окрашивание по Массону использовали для оценки патологического повреждения почек, среди них окрашивание PAS применяли для выявления атрофии почечных канальцев и гломерулярной области, а окрашивание по Массону — для выявления почечного интерстициального фиброза (Xie et al. , 2020). Метод количественного анализа был проведен в соответствии с предыдущими исследованиями (Chen et al., 2019). Вкратце, оценка канальцевой атрофии при окрашивании PAS была определена следующим образом: 1) редкая одиночная атрофия канальца; 2. несколько скоплений атрофированных канальцев; 3. массивная атрофия. Площадь клубочков измеряли с помощью программного обеспечения ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Йена, Германия). Площадь фиброза при окрашивании по Массону измеряли с помощью программного обеспечения Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). По меньшей мере десять микроскопических полей (200×) по 6 крыс в группе были случайным образом захвачены для измерения показателя атрофии, площади клубочков и фиброзной области, по крайней мере, с одним клубочком в каждом микроскопическом поле.

2.6. Иммуногистохимический анализ

Почечный парафиновый срез (4 мкм) из каждого образца подвергали постепенной дегидратации ксилолом дважды и градиентным этанолом (100–95–90–80–70 процентов), антиген выделяли лимоннокислым буфером (pH 6,0). ) в течение 30 мин, блокировали 3-процентной перекисью водорода в течение 10 мин и козьей сывороткой в ​​течение 30 мин при комнатной температуре. Срезы тканей инкубировали отдельно с первичными антителами HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1:500, лот: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 R, 1:500, лот: BJ2044786) при 4 ◦C в течение 10 ч и конъюгированное с пероксидазой козье вторичное антитело против кролика (Abcam, ab6712, 1:1000) при комнатной температуре в течение 30 мин, DAB (диаминобезид в) использовали для обнаруживают активность HRP, ядро ​​докрашивали гематоксилином. в. Иммуногистохимию анализировали в полях микроскопа 400× из каждой группы и фиксировали масштабную линейку=20 мкм с помощью Axio Scope A1, ZEISS, Йена, Германия. Ядерное окрашивание гематоксилином было синим, а иммунопозитивность DAB была коричневой, более глубокое окрашивание DAB означает более сильный иммуногистохимический положительный результат.

2.7. Обнаружение ЭПО

Содержание ЭПО в сыворотке определяли с помощью набора ELISA (Abcam, ab274398), и эксперимент проводился в соответствии с протоколом набора ELISA. Подводя итог, в образец добавляли смесь антител к ЭПО и инкубировали в течение 1 часа. после инкубации каждую лунку промывали промывочным буфером 3 раза, добавляли ТМБ во вторую, инкубировали 15 мин и останавливали реакцию.

Суммарную мРНК почек экстрагировали из замороженной почечной ткани с использованием Trizol и транслировали мРНК в кДНК. ПЦР в реальном времени проводили с помощью Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) в соответствии с протоколом производителя. Зеленый сигнал SYBR был получен и измерен с помощью системы обнаружения последовательностей ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния). Праймерами были: 5'-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3' и 5'-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3' для крысиного EPO (214 п.н., NM_017001). 2); 5'-GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3' и 5'-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3' для GAPDH (181 п.н., NM_017008.3), ведение домашнего хозяйства в качестве внутреннего контроля во всех случаях. И относительную количественную оценку экспрессии генов рассчитывали методом нормализованной экспрессии генов (2- ΔΔCT).

Равные количества белка лизатов коркового вещества почек загружали и разделяли 10%-ным гелем SDS, а затем переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования в 5% нежирном молоке в течение 2 ч при комнатной температуре мембраны инкубировали с первичными антителами при 4°С в течение ночи. Затем мембраны инкубировали с конъюгированным с HRP (пероксидазой хрена) антимышиным IgG (Life Technologies) при комнатной температуре в течение 45 мин. Активность HRP визуализировали с помощью Clarity Western ECL Substrate и анализировали с помощью системы визуализации Tanon. В этом исследовании использовали следующие первичные антитела: моноклональный ЭПО (B- 4) от мышей (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, разведение 1/500), моноклональный -актин от мышей (Cell signaling technology, 8H10D10, разведение 1/1000).

2.8. Анализ короткоцепочечных жирных кислот

Система Shimadzu UHPLC-LCMS/MS (Shimadzu LC-MS 8045, связанная с Shimadzu LC-20AD), оснащенная источником ESI.

Хроматографическое разделение проводили на колонке Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 мм, 2 мкм) с использованием {{10}},1% муравьиной кислоты в воде ( растворитель А) и ацетонитрил (растворитель Б) со скоростью потока 0,3 мл/мин методом градиентного элюирования: 0–9 мин, 25–30% Б; 9–11 мин, 30–40% В; 11–20 мин, 40–50% В; 20–20,1 мин, 50–100% В; 20,1–23 мин, 100% В; 23,1 мин–25% В для повторного уравновешивания. Температура колонки составляла 35 ◦C, автодозатор во время анализа поддерживался при 4 ◦C, в прибор вводили по 1 мкл каждой пробы. Детекцию аналита проводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM), работая в режиме положительных ионов. Параметры МС: Расход распыляемого газа: 3,0 л/мин; Расход осушительного газа: 10 л/мин; Расход газа для отопления: 10 л/мин; температура ДЛ: 250 ◦С; температура интерфейса: 300 ◦С; Нагревательный блок: 400 ◦C. Переходы MRM и энергия столкновения (CE) были выбраны и оптимизированы путем прямого введения каждой стандартной производной. Переходы MRM количеств аналитов были суммированы в Таблице S1.

Фекальные SCFAs: добавляли 100 мкл 50-процентного ацетонитрила к 3 мг лиофилизированных фекалий и встряхивали в течение 2 минут. Затем смесь центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин при 4 ◦C и отбирали надосадочную жидкость пипеткой.

Почечные SCFAs: Взвешивали 100 мг почечной ткани и встряхивали на льду с 4-кратным нормальным физиологическим раствором (100 мг/400 мкл) для приготовления гомогената ткани. К 300 мкл гомогената ткани добавляли 3 раза холодный метанол и встряхивали в течение 2 мин, затем смесь центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин при 4 ◦C и отбирали надосадочную жидкость пипеткой. Супернатант сушили азотом и восстанавливали 100 мкл 50-процентного ацетонитрила.

Добавлено 500 ммоль/л гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-н-этилкарбодиимида (EDC, Aladdin, Шанхай, Китай), 50 ммоль/л 3H-[1,2,3]-триазоло[4, 5-b] пиридин-3-ол (HOAT, Aladdin, Шанхай, Китай) и 50 мг/мл 12C-дансилгидразина (12C-DnsHz, J&K, Пекин, Китай) в 20 мкл экстракции образца в последовательность с тем же объемом. EDC и HOAT готовили со свежей 500 ммоль/л 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES, Macklin, Шанхай, Китай). После инкубации при 20°C в течение 90 мин к смеси добавляли 20 мкл 50 ммоль/л CuCl2 (Macklin, Шанхай, Китай) для гашения реакции дериватизации при 40°C в течение 30 мин (Zhao & Li, 2018). По окончании дериватизации смесь разбавляли в 10 раз 25%-ным ацетонитрилом. Перед анализом 100 мкл супернатанта смешивали со 100 мкл раствора внутреннего стандарта. Метку 13C-DnsHz использовали в качестве внутренних стандартов (ISTD1-8) в соответствии с той же реакцией дериватизации. Стандарт SCFAs: уксусная кислота (AA, A116173), пропановая кислота (PA, P110446), изомасляная кислота (IBA, I103524), масляная кислота (BA, B110438), 2-метилмасляная кислота (2- ВА, М107377), изовалериановую кислоту (IVA, I108280), валериановую кислоту (VA, V108271), гексановую кислоту (HA, H103632) поставляли от Aladdin (Шанхай, Китай).

2.9. статистический анализ

Данные каждой группы выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистическую значимость среди групп определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа и ретроспективного анализа с помощью критерия Стьюдента-Ньюмана-Кеулса (SNK) или критерия Т3 Даннета. Значение P < 0.05="" считалось="" статистически="" значимым.="" все="" данные="" были="" получены="" с="" использованием="" статистического="" программного="" обеспечения="" spss="" (версия="" 22.0,="" spss="" inc.,="" чикаго,="" иллинойс,="">

3. Результаты

3.1. JP улучшил функцию почек у крыс с ХБП

Моносахарид JP был охарактеризован перед обработкой на животных. JP, использованный в настоящем исследовании, состоял из семи моносахаридов, то есть рамнозы (1,62%), арабинозы (15,79%), фукозы ({4}},21%), ксилозы (4,56%), маннозы (3. 00 процентов), глюкоза (73,44 процента) и галактоза (4,99 процента) (рис. 1). Наш метод анализа был подтвержден линейностью, точностью, воспроизводимостью, стабильностью и восстановлением (таблицы S2–S3). Было подтверждено, что аналиты стабильны при комнатной температуре в течение 24 часов. Выход JP должен быть выше 8,63%, а чистота не менее 77,16%. Вышеупомянутый химический анализ JP служил подходом к контролю качества для обеспечения воспроизводимости приведенных ниже исследований на животных.

Scr, BUN и белок мочи были наиболее репрезентативными для функций почек. Уровни Scr, BUN и белка в моче у крыс с ХЗП были значительно выше, чем у ложной группы (P < {{0}},01).="" после="" 90="" дней="" лечения="" jp="" уровни="" scr,="" bun="" и="" белка="" в="" моче="" были="" снижены="" по="" сравнению="" с="" группой="" с="" хбп="" (p=""><0,01) (рис.="">

3.2. JP улучшил патологическое повреждение почек у крыс с ХЗП

Массу всей правой почки для группы имитации и остатка правой почки для группы ХБП и ХБП плюс JP использовали для оценки морфологии почек по массе почки (KW) и массе почки/массе тела (KW/BW). В конце экспериментов KW и KW/BW в группе с ХЗП были увеличены по сравнению с группой с имитацией (все P < {{0}}.05).="" в="" модели="" хбп,="" вызванной="" нефрэктомией="" 5/6,="" снижение="" активности="" почечных="" протеиназ="" вызвало="" компенсаторный="" рост="" почек,="" компании="" с="" почечной="" гипертрофией="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" и="" мы="" подтвердили="" это="" утверждение.="" после="" лечения="" jp="" kw="" значительно="" снизился="" (p="">< 0,05)="" и="" приблизился="" к="" ложной="" группе="" (p="" ˃="" 0,05);="" при="" этом="" отношение="" kw/bw="" несколько="" уменьшилось="" (p="" ˃="" 0,05).="" (рис.="">

Рис. 2. JP защищает функцию почек у крыс с ХЗП. Уровень Scr (A), BUN (B) и белка мочи (C) в разных группах. (D) вес почки, (E) кВт/масса тела. Данные были представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, n=6 на группу (**P < 0.01="" по="" сравнению="" с="" фиктивной="" группой;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p=""><0,01 по="" сравнению="" с="" группой="">

В группе ХБП почечные канальцы демонстрировали массивную атрофию по сравнению с имитационной группой (P < {{0}}.01),="" а="" площадь="" клубочков="" и="" интерстициальный="" фиброз="" почек="" были="" почти="" в="" два="" раза="" больше,="" чем="" в="" группе="" симуляции.="" таковое="" в="" фиктивной="" группе="" при="" количественном="" анализе="" (p="">< 0.01).="" после="" лечения="" jp="" оценка="" канальцевой="" атрофии="" снизилась="" почти="" вдвое="" (p=""><0,01), площадь="" клубочков="" почти="" восстановилась="" до="" группы="" с="" имитацией="" (p=""><0,01), а="" почечный="" интерстициальный="" фиброз="" уменьшился="" на="" одну="" треть="" (p=""><0,01). по="" сравнению="" с="" группой="" хбп="" (рис.="">

Рис. 3. JP защищает структуру почек у крыс с ХЗП. (A) Окрашивание PAS. (B) Окрашивание по Массону. (C) Оценка канальцевой атрофии. (D) Клубочковая зона (E) Фиброзная зона. Все изображения представлены с одинаковым увеличением, 200×, масштабная линейка=100 мкм. Данные были представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, n=6 на группу (**P < 0,01="" по="" сравнению="" с="" фиктивной="" группой;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01 по="" сравнению="" с="" группой="" с="" хбп.="">

3.3. JP модулировал гематологические параметры у крыс с ХЗП

Для биохимического анализа гематологических параметров измеряли RBC, Hb, HCT и PLT. У крыс с ХЗП уровень эритроцитов снизился с 9,6 до 7,20 × 1012/л, Hb с 15,28 до 13,22 г/дл, HCT с 47,1 до 40,4%, а PLT повысился. от 1012 до 1526 × 109 /л по сравнению с плацебо (P < 0,01),="" что="" свидетельствовало="" о="" том,="" что="" у="" крыс="" с="" хбп="" наблюдались="" признаки="" анемии.="" сниженные="" уровни="" rbc,="" hb,="" hct="" и="" plt="" у="" крыс="" с="" хзп,="" получавших="" jps,="" были="" восстановлены="" (p=""><0,01) (рис.="">

Рис. 4. JP восстановил гематологические показатели у крыс с ХЗП. Уровень PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Данные были представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, n=6 на группу (**P < 0.01="" по="" сравнению="" с="" фиктивной="" группой;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p=""><0,01 по="" сравнению="" с="" группой="">

3.4. JP стимулировал экспрессию ЭПО

По сравнению с имитационной группой уровень ЭПО в сыворотке и количество мРНК ЭПО в почках были значительно снижены у крыс с ХЗП-анемией (P < 0.01).="" вестерн-блоттинг="" показал,="" что="" уровень="" белка="" эпо="" незначительно="" снижается="" в="" группе="" с="" хбп="" без="" существенной="" разницы.="" после="" лечения="" jp="" уровень="" epo="" в="" сыворотке,="" мрнк="" epo="" в="" почках="" и="" белок="" были="" значительно="" повышены="" по="" сравнению="" с="" группой="" с="" хбп="" (p=""><{5}},01 или="" p=""><0,05) (рис.="">

В корковом веществе почек HIF-1 в основном продуцировался эпителиальными клетками почечных канальцев, HIF-2 в основном экспрессировался в эндотелиальных клетках и интерстициальных фибробластах почек (Schödel & Ratcliffe, 2019). Иммуногистохимический анализ показал, что, как и в случае с HIF-1, у крыс с ХЗП канальцы были окрашены сильнее, чем в плацебо-группе. После лечения JP почечные канальцы имели более сильное окрашивание и большую площадь по сравнению с группой CKD, как показано красной стрелкой на рис. 5E. HIF-2 показал относительно слабый иммуногистохимический положительный результат в почечной интерстициальной ткани в группе имитации. В группе ХБП HIF-2 показал положительный иммуногистохимический анализ. После лечения JP HIF-2 показал более сильную иммуногистохимию по сравнению с группой CKD (рис. 5F).

Рис. 5. JP стимулировал экспрессию ЭПО. (A) Содержание ЭПО в сыворотке. (Б)ПочкаОтносительная мРНК ЭПО. GAPDH считался геном домашнего хозяйства. (C) Репрезентативные вестерн-блот-изображения экспрессии белка EPO. (D) Денситометрический анализ ЭПО. (E) Иммуногистохимия HIF{{0}}. (F) Иммуногистохимия HIF- 2, нормализованная по содержанию -актина. Иммуногистохимические изображения представлены при одинаковом увеличении, 400×, масштабная линейка=20 мкм. Ядерное окрашивание гематоксилином было синим, а иммунопозитивность DAB была коричневой, более глубокое окрашивание DAB означает более сильный иммуногистохимический положительный результат. Красная стрелка указывает на положительную иммуногистохимию. Данные были представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, n=6 на группу (*P <0,05 по="" сравнению="" с="" фиктивной="" группой;=""><0,05,><0,01 по="" сравнению="" с="" группой="" с="">

3.5. JP индуцирует высвобождение SCFAs

Целевой метаболомный подход на основе ЖХ-МС был разработан для количественного определения высвобождения восьми SCFAs в образцах фекалий. Установленный метод был проверен путем оценки линейности, чувствительности, прецизионности, матричного эффекта, точности и стабильности. Образцы контроля качества с низкой, средней и высокой концентрацией (LQC, QMC, HQC) для проверки чувствительности, прецизионности, правильности и стабильности были отобраны в соответствии с точками самой низкой, средней и самой высокой концентрации на стандартной кривой матрицы, и результаты представлены в таблицах S4–S6. Было подтверждено, что аналиты стабильны при 4°C в течение 48 часов. Хроматограмма LC-MS/MS SCFAs показана на рис. 6.

Рис. 6. УВЭЖХ-МС/МС хроматография SCFAs. (A) Верхнее было химическое уравнение дериватизации SCFAs; приведена структурная формула SCFAs после дериватизации дансилгидразина; (B) Хроматограмма UHPLC/MRM-MS смешанных стандартов и образца фекалий, хроматографические пики в (B) соответствовали химическому маркеру, показанному в (A):1. 12С-уксусная кислота; 2. 13C-уксусная кислота (ISTD1); 3. 12С-пропановая кислота; 4. 13C-пропановая кислота (ISTD2); 5. 12С-изомасляная кислота; 6. 12С-масляная кислота; 7. 13С-изомасляная кислота (ISTD3); 8. 13С-масляная кислота (ISTD4); 9. 12C-2-метилмасляная кислота; 10. 12С-изовалериановая кислота; 11. валериановая кислота 12С; 12. 13C-2-метилмасляная кислота (ISTD5); 13. 13С-изовалериановая кислота (ISTD6); 14. 13C-валериановая кислота (ISTD7); 15. 12С-гексановая кислота; 16. 13C-гексановая кислота (ISTD8).

Что касается образца кала, то в группе ХБП уровни АК и ФК были заметно снижены почти в 4 раза и в 5 раз по сравнению с имитационной группой (P < 0.01);="" в="" то="" время="" как="" после="" лечения="" jp="" количество="" aa="" и="" pa="" было="" восстановлено="" обратно="" до="" 4/5="" группы="" имитации="" (p="">< {{10}}.01).="" точно="" так="" же="" уровни="" ба="" и="" жа="" были="" достоверно="" снижены="" почти="" в="" 30="" раза="" и="" в="" 4="" раза="" в="" группе="" с="" хбп="" по="" сравнению="" с="" группой="" с="" имитацией="" (p="">< 0,01).="" лечение="" jp="" показало="" тенденцию="" к="" увеличению,="" но="" не="" значительное="" улучшение.="" содержание="" iba,="" iva="" и="" 2-ba="" не="" показало="" заметных="" изменений="" между="" ckd="" и="" фиктивной="" группой.="" после="" лечения="" юп="" уровень="" iba,="" iva="" и="" 2-ba="" повышался="" (p="">< 0,01).="" однако="" гк="" не="" показал="" явных="" изменений="" среди="" трех="" групп="" (рис.="" 7а).="" более="" того,="" что="" касается="" ткани="" почек,="" то="" в="" группе="" хбп="" количество="" восьми="" кцжк="" было="" значительно="" снижено="" (p="">< 0,01),="" в="" то="" время="" как="" после="" лечения="" jp="" уровни="" кцжк="" повышались,="" за="" исключением="" ба="" и="" гк="" (p="">< 0,01="" или="" p="">< 0,5).="" ba="" был="" немного="" повышен,="" но="" не="" значительно,="" а="" ha="" не="" изменился="" после="" лечения="" jp="" (рис.="">

Рис. 7. Содержание КЦЖК в разных группах. (A) Фекальные SCFAs. (B) почечные SCFAs. Данные были представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение, n=6 на группу (**P <0.01 по="" сравнению="" с="" фиктивной="" группой;="" ##p=""><0. 01,=""><0,05 по="" сравнению="" с="" группой="">

4. Дискуссия

В настоящей крысиной модели CKD с нефрэктомией 5/6почкафункцияпоказатели (Scr, BUN, белок мочи) были значительно повышены, появилась остаточная гипертрофия почек и патологическое поражение почек, сопровождающееся изменением гематологических показателей. Эти данные соответствовали предыдущим исследованиям (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Приведенные выше индикаторы показали, что анемия у крыс с ХБП, индуцированная нефрэктомией 5/6, была успешно установлена, и можно было проверить положительный эффект JP при лечении крыс с анемией с ХБП. СпочкафункцияПри дальнейшем ухудшении анемия была признана известным оппортунистическим осложнением ХБП, которое негативно влияло на качество жизни пациентов (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Понимание факторов риска, связанных с прогрессированием почечной анемии, поможет разработать терапевтические подходы. В настоящее время связь между заболеванием и метаболизмом кишечной микробиоты привлекает все больше внимания, в то время как связь между SCFAs и почечной анемией все еще менее известна. SCFAs, в основном метаболизируемые Clostridium, Coprococcus и Bacteroides (Koh et al., 2016), нацелены на специфические мембраносвязанные рецепторы, которые играют важную роль в поддержании баланса кишечной среды и здоровья всего организма. Уже доказано, что SCFAs имеют неразрывную связь с CKD, и уровни уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты были снижены при CKD (Wang et al., 2019). У крыс с ХБП, индуцированной аденином, численность и разнообразие кишечной микробиоты значительно изменились за счет снижения уровня пропановой, масляной и валериановой кислот (Lakshmanan, Al, Ali, & Terranegra, 2021). Основываясь на нашем предыдущем исследовании, секвенирование 16S рДНК показало, что дисбиоз кишечной микробиоты проявлялся у 5/6 крыс с ХБП, индуцированных нефрэктомией, по сравнению с плацебо-группой. Некоторые виды SCFAs, продуцирующие масляную кислоту из Clostridium, Coprococcus, показали различия у крыс с ХБП (Zheng et al., 2020). В соответствии с этим наши результаты показали, что количество уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, валериановой кислоты было снижено примерно на 60 процентов, 80 процентов, 85 процентов и 60 процентов у крыс с ХЗП, что указывает на то, что снижение КЦЖК соответствовало при дисбалансе кишечной среды. Следует отметить, что нарушение кишечной среды, вызванное ХБП, вызвало нарушение метаболизма кишечной микробиоты (Feng et al., 2019). Кроме того, мы обнаружили, что у крыс с CKD-анемией были снижены уровни восьми видов SCFAs. Например, аномалия конечных продуктов метаболизма, т.е. SCFAs, может быть результатом прогрессирования ХБП.

Полисахариды, один из активных ингредиентов, были обнаружены в различных травах, таких как Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix и Jujubae Fructus. Полисахариды могут ферментироваться и разлагаться микробиотой кишечника. В результате полисахариды представляются микробиотой кишечника в качестве субстрата для метаболизма в короткоцепочечные жирные кислоты или считаются обладающими пребиотическим действием, улучшающим состав микробиоты кишечника и способствующим выработке короткоцепочечных жирных кислот (Cai et al., 2019). В этом исследовании наши результаты показали, что полисахариды из мармелада стимулировали высвобождение короткоцепочечных жирных кислот кишечной микробиотой, таких как уксусная кислота, пропановая кислота, изомасляная кислота, 2-метилмасляная кислота, у крыс с ХЗП. Кроме того, после лечения JP уровень SCFAs в почках крыс с CKD-анемией улучшился, и тенденция изменения соответствовала образцу фекалий. На основании существующих исследований взаимосвязь между КЦЖК и ХБП постепенно становилась ясной. Например, сообщалось, что уксусная кислота модулирует иммунную систему и облегчает острыепочкаранапутем ингибирования передачи сигналов НАДФН-оксидазы в Т-клетках (Al-Harbi et al., 2018). Было доказано, что пропановая кислота предотвращает прогрессирование аденин-индуцированной ХБП через рецептор свободных жирных кислот 2 (FFA2) и FFA3 (Mikami et al., 2020). Таким образом, мы пришли к выводу, что восстановление уровня SCFA в почках было полезным для больной почки. Сообщалось, что JP увеличивает разнообразие микробиоты кишечника и увеличивает относительную численность активной микробиоты SCFAs (Bacteroides) у мышей с колоректальным раком (Ji et al., 2020). Кроме того, JP увеличивал концентрацию общих SCFAs в образцах фекалий (Ji et al., 2019). Таким образом, мы сделали вывод, что JP может стимулировать выработку SCFAs для достижения цели замедления прогрессирования ХБП. JP также может быть субстратом метаболизма для микробиоты, доминирующей SCFAs, для стимуляции продукции SCFAs при ХБП, или компонентом, подобным пребиотикам, для восстановления среды кишечника, особенно разнообразия микробиоты, доминирующей SCFAs, и дополнительно способствовать высвобождению SCFAs, чтобы предотвращения прогрессирования ХБП.

В целом, SCFAs (без углерода менее 6) с небольшой молекулярной массой и высокой химической полярностью трудно анализировать непосредственно с помощью хроматографических подходов. Стратегия химической дериватизации КЦЖК с изотопной меткой может повысить чувствительность прибора и уменьшить ошибки анализа, что обеспечивает полезную стратегию определения КЦЖК в анализе ЖХ-МС/МС (Higashi & Ogawa, 2016). Недавно подходы, меченные дансилгидразином, удовлетворительно использовались для обнаружения целевых метаболитов плазмы человека, содержащих карбоновую кислоту (Chen & Zhang, 2020). В поддержку этого в этом исследовании мы дополнительно разработали химическую дериватизацию на основе подхода LC-MS/MS для определения 8 SCFAs в фекалиях крыс. КЦЖК продуцируются микробиотой кишечника, и почти 10% КЦЖК выводятся с фекалиями (Boets et al., 2015). Таким образом, анализ образцов фекалий на SCFAs может напрямую отражать изменения в среде кишечника и имеет большее значение в совместном мультиомическом анализе между SCFAs и кишечной микробиотой. Примечательно, что при проверке нестабильности мы обнаружили, что меченные дансилгидразином SCFAs были нестабильны при комнатной температуре, а их интенсивность в масс-спектре демонстрировала тенденцию к снижению со временем, но она могла оставаться стабильной в течение 48 часов при 4 ◦C. Таким образом, после дериватизации КЦЖК аналиты перед анализом следует выдерживать при 4°С.

На поздних стадиях ХБП 4–5 дефицит продукции ЭПО ограничивает эритропоэз, что способствует наиболее важному фактору развития почечной анемии (Sakashita, Tanaka, & Nangaku, 2019). Рутинное лечение анемии стимуляторами эритропоэза (ЭСА) рекомендовано клиническими рекомендациями. Однако безопасность ЭСС, связанная с повышенным риском смерти и сердечно-сосудистых событий, должна быть обеспокоена (Thavarajah & Choi, 2019). У пациентов с почечной анемией экспрессия ЭПО должна была быть постоянной или несколько повышенной по сравнению со здоровыми органами (Babitt & Lin, 2012). На ранней стадии уровень ЭПО демонстрировал тенденцию к повышению, в то время как на поздней стадии уровень ЭПО демонстрировал тенденцию к снижению по сравнению с ранней стадией, даже ниже нормы (Panjeta, Tahirovic, Sofi's, ´ Cori's, & Dervisevi «с», 2017). Как и в предыдущих экспериментах (Chen et al., 2019; Wang et al., 2020), наши результаты показали, что уровень ЭПО в сыворотке был снижен у крыс с ХБП-анемией. Соответственно, мы обнаружили уровень мРНК ЭПО в почках и уровень белка у крыс с ХЗП, и уровень белка ЭПО в почках был немного снижен по сравнению с плацебо-группой, в то время как количество мРНК ЭПО в почках было деградировано, и его степень была больше, чем уровень ЭПО в сыворотке. Почки являются основным источником синтеза ЭПО у взрослых и пациентов с ERSD.почкипо-прежнему сохраняет способность продуцировать эритропоэтин (Bernhardt et al., 2010). Для коррекции эндогенных уровней ЭПО в сыворотке и адаптации к почечной анемии активировали выработку ЭПО в почках, хотяпочкаранаснижение экспрессии мРНК ЭПО (Schödel & Ratcliffe, 2019). После лечения JP уровень ЭПО в сыворотке повышался, а также повышались уровни мРНК ЭПО в почках и уровни белка. В нашем предыдущем исследовании JP мог стимулировать транскрипционную активность HRE и усиливать ген EPO (Chen et al., 2014). Следовательно, мы предположили, что JP может восстанавливать уровень ЭПО в сыворотке крыс с ХБП до регулируемой почечной анемии, чему может способствовать стимулированная экспрессия гена ЭПО в почках на уровне мРНК.

В коре HIF-1 обнаруживался в основном в канальцах, а HIF-2 - в почечном интерстиции. Поскольку EPO в основном продуцируется фибробластами, в которых совместно локализован HIF-2, это подтверждает, что HIF-2 может быть причиной регуляции продукции EPO (Maxwell, 2003). В нашем исследовании мы обнаружили, что HIF-1 и HIF-2 могут активироваться при ХБП, а лечение JP может стимулировать активность HIF-1 и HIF-2 по сравнению с крысами с ХБП. . Было доказано, что HIF-2 играет важную роль в регуляции продукции ЭПО (Kapitsinou et al., 2010), в то время как активация HIF-1 может оказывать почечное защитное действие в почках (Jiang et al. al., 2020), что косвенно улучшает продукцию ЭПО. Продукция ЭПО в почках сначала регулировалась на уровне мРНК, при анемии или гипоксии экспрессия мРНК ЭПО могла быть увеличена путем стимуляции белка HIF. Ранее фармакологические исследования показали, что мармелад стимулирует экспрессию ЭПО посредством регуляции уровня белка HIF в клеточной модели (Chen et al., 2014, Lam et al., 2016). Таким образом, мы сделали вывод, что JP может усиливать экспрессию мРНК ЭПО через HIF-белок для достижения цели облегчения почечной анемии.

Кроме того, на основании текущих результатов мы предполагаем, что снижение SCFAs может играть решающую роль в HIF-опосредованной экспрессии EPO, которая способствует анемии при ХБП. В противовес этому было показано, что повышенный уровень уксусной кислоты благотворно влияет на ацетилирование HIF-2 и образование комплекса CREB-связывающий белок-HIF 2, а также дополнительно индуцирует экспрессию EPO (Xu et al., 2014). Пропионовая кислота ослабляла разрушение митохондрий, апоптоз гиппокампа и неврологический дефицит через путь HIF-1/ERK (Cheng et al., 2019). Кроме того, было обнаружено, что масляная кислота стабилизирует HIF-1, активные гены-мишени HIF на клетках толстой кишки и смягчает воспалительную реакцию толстой кишки (Kelly et al., 2015). В нашем исследовании мы обнаружили, что уровни уксусной кислоты, пропановой кислоты и масляной кислоты были значительно снижены, что сопровождалось аномальной экспрессией HIF-белка у крыс с ХЗП, что указывало на то, что стабильность HIF- может быть связана с уменьшением SCFAs, а SCFAs могли иметь эффект стабилизации HIF для регуляции экспрессии ЭПО.

5. Выводы

В заключение мы доказали, что JP улучшает течение ХБП и связанную с ней анемию, механизм которой связан с регуляцией высвобождения SCFAs и продукции EPO. А JP может быть биологически активным ингредиентом мармелада для лечения анемии. Эти результаты могут служить доказательством дальнейшего развития JP в качестве пищевых добавок для лечения анемии, связанной с ХБП.

Этическое заявление

Все эксперименты на животных в нашем исследовании проводились в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по этике Университета китайской медицины Гуанчжоу, и в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (публикации NIH № 80-23, пересмотрено в 1996 г.). В нашем исследовании нет нарушений вышеуказанных правил.

Благодарности

Эта работа поддерживается Фондом естественных наук провинции Гуандун (2018A030313305), Фондом естественных наук Китая (81804052, 81973577 и 82004248), Шэньчжэньским научно-техническим планом (JSGG20191129102216637 и ZDSYS201606081515458), Бюро традиционной китайской медицины провинции Гуандун ( 20201320).

использованная литература

Аль-Харби, Н.О., Надим, А., Ахмад, С.Ф., Алотаиби, М.Р., Аль-Асмари, А.Ф., Аланази, В.А., … Ибрагим, К.Е. (2018). Короткоцепочечные жирные кислоты, ацетат улучшают острое состояние, вызванное сепсисом.почкаранапутем ингибирования передачи сигналов НАДФН-оксидазы в Т-клетках. Международная иммунофармакология, 58, 24–31.
Бабитт, Дж. Л., и Лин, HY (2012). Механизмы анемии при ХБП. Журнал Американского общества нефрологов, 23 (10), 1631–1634.
Бернхардт, В. М., Визенер, М. С., Сцигалла, П., Чоу, Дж., Шмидер, Р. Е., Гюнцлер, В., … Эккардт, КУ (2010). Ингибирование пролилгидроксилаз увеличивает продукцию эритропоэтина при ХПН. Журнал Американского общества нефрологов, 21(12),
2151–2156.
Боэтс, Э., Дерувер, Л., Хубен, Э., Вермюлен, К., Гоман, С.В., Делькур, Дж. А., … Вербеке, К. (2015). Количественная оценка образования короткоцепочечных жирных кислот в толстой кишке in vivo из инулина. Питательные вещества, 7 (11), 8916–8929.

Цай, Ю., Лю, В., Линь, Ю., Чжан, С., Цзоу, Б., Сяо, Д., … Се, З. (2019). Сложные полисахариды облегчают экспериментальный колит, модулируя состав и функцию кишечной микробиоты. Журнал гастроэнтерологии и гепатологии, 34 (9),1554–1562.

Чен, Г., и Чжан, К. (2020). Одновременное количественное определение свободных жирных кислот и ацилкарнитинов в образцах плазмы с использованием мечения дансилгидразином и жидкостной хроматографии-тройной квадрупольной масс-спектрометрии. Аналитический и биоаналитическийХимия, 412 (12), 2841–2849.

Чен, Дж., Лам, CT, Конг, А.И., Чжан, В.Л., Чжан, JY, Би, CW, … Цим, К.В. (2014). Экстракт плодов Ziziphus jujuba (мармелад) индуцирует экспрессию эритропоэтина посредством индуцируемого гипоксией фактора-1 в культивируемых клетках Hep3B. ПлантаМедика, 80 (17), 1622–1627.

Чен Дж., Ван Ф., Хуанг С., Лю С., Ли З., Ци А., … Ли С. (2019). Отвар Jian-Pi-Yi-Shen облегчает почечную анемию у 5/6 нефрэктомированных крыс: производство эритропоэтина посредством передачи сигналов индуцируемого гипоксией фактора. Доказательная дополнительная и альтернативная медицина, 2019, стр. 1–8.
Ченг, Ю., Май, К., Цзэн, X., Ван, Х., Сяо, Ю., Тан, Л., … Дин, Х. (2019). Пропионат снимает судороги, вызванные пентилентетразолом, последующее разрушение митохондрий, некроз нейронов и неврологический дефицит у мышей. Биохимическая фармакология, 169, статья 113607.
Фэн, Ю.Л., Цао, Г., Чен, Д.К., Вазири, Н.Д., Чен, Л., Чжан, Дж., … Чжао, Ю.Ю. (2019). Микробиом-метаболомика выявляет микробиоту кишечника, связанную с метаболитами, конъюгированными с глицином, и метаболизмом полиаминов при хроническом заболевании почек. Клеточные и молекулярные науки о жизни, 76 (24), 4961–4978.
Гарридо, П., Рибейро, С., Фернандес, Дж., Вала, Х., Бронз-да-Роча, Э., Роша-Перейра, П., … Рейс, Ф. (2015). Дисметаболизм железо-гепсидин, анемия и почечная гипоксия, воспаление и фиброз в модели остаточной почки у крыс. PLoS ONE, 10(4), статья e124048.
Хигаси, Т., и Огава, С. (2016). Кодированные изотопами реагенты для дериватизации, усиливающие ESI, для дифференциального анализа, количественного определения и профилирования метаболитов в биологических образцах с помощью ЖХ/МС: обзор. Журнал фармацевтического и биомедицинского анализа, 130, 181–193.
Цзи, X., Хоу, C., Гао, Y., Сюэ, Y., Ян, Y., и Го, X. (2020). Метагеномный анализ модулирующих эффектов полисахаридов зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.) на кишечную микробиоту в мышиной модели колоректального рака. Еда и функции, 11 (1), 163–173.
Цзи, X., Хоу, К., Ян, Ю., Ши, М., и Лю, Ю. (2020). Сравнение структурных характеристик и антиоксидантной активности полисахаридов из плодов зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.). Международный журнал биологических макромолекул, 149, 1008–1018.

Цзи, X., Хоу, C., Чжан, X., Хань, Л., Инь, С., Пэн, Q., … Ван, М. (2019). Микробиометаболомный анализ воздействия Zizyphus jujuba cv. Потребление полисахаридов Muzao на фекальную микробиоту и метаболиты мышей с колоректальным раком.Международный журнал биологических макромолекул, 131, 1067–1076.

Цзи С., Пэн К., Юань Ю., Шен Дж., Се С. и Ван М. (2017). Выделение, структура и биоактивность полисахаридов из плодов зизифуса (Ziziphus jujuba Mill.): Обзор. Пищевая химия, 227, 349–357.
Цзян, Н., Чжао, Х., Хань, Ю., Ли, Л., Сюн, С., Цзэн, Л., … Сунь, Л. (2020). HIF-1 улучшает повреждение канальцев при диабетической нефропатии посредством HO{2}}опосредованного контроля митохондриальной динамики. Пролиферация клеток, 53(11), статья e12909.
Капицину, П.П., Лю, К., Унгер, Т.Л., Ра, Дж., Давидофф, О., Кит, Б., … Хаазе, В.Х. (2010). Печеночный HIF-2 регулирует эритропоэтические реакции на гипоксию при почечной анемии. Кровь, 116 (16), 3039–3048.
Келли, С.Дж., Чжэн, Л., Кэмпбелл, Э.Л., Саиди, Б., Шольц, К.С., Бэйлесс, А.Дж.,… Колган, С.П. (2015). Взаимодействие между короткоцепочечными жирными кислотами, полученными из микробиоты, и HIF кишечного эпителия усиливает барьерную функцию тканей. Cell Host & Microbe, 17 (5), 662–671.
Кох, А., Де Ваддер, Ф., Ковачева-Дачари, П., и Бэкхед, Ф. (2016). От пищевых волокон к физиологии хозяина: жирные кислоты с короткой цепью как ключевые метаболиты бактерий. Ячейка, 165 (6), 1332–1345.
Лакшманан, А.П., Ал, З.М., Али, Б.Х., и Терранегра, А. (2021). Влияние пребиотика гуммиарабика на состав микробиома кишечника крыс с экспериментальной хронической болезнью почек. Биомедицина и фармакотерапия, 133, Статья
110992.
Лам, К., Чан, П.Х., Ли, П., Лау, К.М., Конг, А., Гонг, А.,… Цим, К. (2016). Химическая и биологическая оценка травяных отваров, содержащих мармелад (Ziziphus jujuba): индукция экспрессии эритропоэтина в культурах. Журнал хроматографии BAАналитические технологии в биомедицинских науках и науках о жизни, 1026, 254–262.
Лаппин, Т.Р., и Ли, Ф.С. (2019). Обновленная информация о мутациях в пути HIF: EPO и их роли в эритроцитозе. Обзоры крови, д. 37, ст. 100590.
ЛеБлан, Дж. Г., Чейн, Ф., Мартин, Р., Бермудес-Умаран, ´ Л.Г., Куро, С., и Лангелла, П. (2017). Благотворное влияние на энергетический метаболизм хозяина короткоцепочечных жирных кислот и витаминов, продуцируемых комменсальными и пробиотическими бактериями. Микробные клеточные фабрики, 16 (1), 79.
Ли, Л., Ма, Л. и Фу, П. (2017). Короткоцепочечные жирные кислоты кишечной микробиоты и заболевания почек. Разработка дизайна лекарств и терапия, 11, 3531–3542.
Ли, Л., и Ши, JY (2013). Анализ полисахаридных и липидных компонентов коры коричного дерева методом ГХ-МС. Чжун Яо Цай, 36 (4), 578–580.
Лю, Г., Лю, X., Чжан, Ю., Чжан, Ф., Вэй, Т., Ян, М.,… Чжао, З. (2015). Гепатопротекторное действие полисахаридов, экстрагированных из Zizyphus jujube cv. Хуангэтанзао. Международный журнал биологических макромолекул, 76, 169–175.

Локателли, Ф., Фишбейн, С., Блок, Г.А., и Макдугалл, И.К. (2017). Ориентация на факторы, вызывающие гипоксию, для лечения анемии у пациентов с хронической болезнью почек. Американский журнал нефрологии, 45 (3), 187–199.

Локателли, Ф., Ханнедуш, Т., Фишбейн, С., Морган, З., Оги, Д., и Уайт, В.Б. (2019). Сердечно-сосудистая безопасность и смертность от всех причин метоксиполиэтилена

Гликол-Эпоэтин бета и другие стимуляторы эритропоэза при анемии при ХБП: рандомизированное исследование не меньшей эффективности. Клинический журнал Американского общества нефрологов: CJASN, 14 (12), 1701–1710.
Максвелл, П. (2003). HIF-1: система реагирования на кислород, имеющая особое значение для почек. Журнал Американского общества нефрологов, 14 (11), 2712–2722.
Мейерс, Б.К., и Эвенепол, П. (2011). Ось кишечник-почка: индоксилсульфат, п-крезилсульфат и прогрессирование ХБП. Нефрология Диализная трансплантация, 26 (3), 759–761.
Миками Д., Кобаяши М., Увада Дж., Ядзава Т., Камияма К., Нисимори К., … Ивано М. (2020). Короткоцепочечные жирные кислоты смягчают аденин-индуцированное хроническое заболевание почек через пути FFA2 и FFA3. Biochimica Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology Lipids, 1865(6), статья 158666.
Мортон, Д.Б., и Гриффитс, П.Х. (1985). Руководство по распознаванию боли, дистресса и дискомфорта у экспериментальных животных и гипотеза для оценки. Ветеринарная запись, 116 (16), 431–436.
Панета, М., Тахировиц, И., Софиц, Э., Корич, Дж., и Дервишевич, А. (2017). Интерпретация уровней эритропоэтина и гемоглобина у больных с различными стадиями хронической болезни почек. Журнал медицинской биохимии, 36 (2), 145–152.
Паппа, М., Дунуси, Э., Дуни, А., и Катоподис, К. (2015). Менее известны патофизиологические механизмы развития анемии у больных диабетической нефропатией. Международная урология и нефрология, 47 (8), 1365–1372.
Сакашита, М., Танака, Т., и Нангаку, М. (2019). Гипоксия-индуцируемый фактор-ингибиторы домена пролилгидроксилазы для лечения анемии при хроническом заболевании почек. Вклады в нефрологию, 198, 112–123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Шодель, ¨ Дж., и Рэтклифф, П.Дж. (2019). Механизмы передачи сигналов гипоксии: новые последствия для нефрологии. Nature Reviews Nephrology, 15 (10), 641–659.
Тако, Э., Глан, Р.П., Кнез, М., и Стангулис, Дж. К. (2014). Влияние пребиотиков пшеницы на популяцию бактерий кишечника и статус железа у цыплят-бройлеров с дефицитом железа. Журнал питания, 13, 58.
Тан, У.Х., Ван, З., Кеннеди, Д.Дж., Ву, Ю., Буффа, Дж.А., Агатиса-Бойл, Б., … Хазен, С.Л. (2015). Зависимый от кишечной микробиоты путь триметиламин-N-оксида (ТМАО) способствует как развитию почечной недостаточности, так и риску смертности при хроническом заболевании почек. Исследование тиражей, 116 (3), 448–455.
Тавараджа, С., и Чой, М.Дж. (2019). Применение стимуляторов эритропоэза у пациентов с ХБП и раком: клинический подход. Американский журнал болезней почек, 74(5), 667–674.
Ван, Ф., Ю, Х., Хуан, С., Чжэн, Л., Чжэн, П., Чжан, С., … Чен, Дж. (2020). Jian-PiYi-Shen регулирует экспрессию EPO и белка, рециркулирующего железо, у анемичных крыс с хроническим заболеванием почек: накопление фактора, индуцируемого гипоксией -2 посредством передачи сигналов ERK. Доказательная дополнительная и альтернативная медицина, 2020, 8894257.
Ван, С., Лв, Д., Цзян, С., Цзян, Дж., Лян, М., Хоу, Ф., … Чен, Ю. (2019). Количественное снижение содержания короткоцепочечных жирных кислот, особенно бутирата, способствует прогрессированию хронического заболевания почек. Клиническая наука, 133 (17), 1857–1870.
Вебстер, А.С., Наглер, Э.В., Мортон, Р.Л., и Массон, П. (2017). Хроническое заболевание почек. Ланцет (Лондон, Англия), 389 (10075), 1238–1252.
Се, X., Ян, X., Ву, Дж., Ма, Дж., Вэй, В., Фей, X., … Ван, М. (2020). Trib1 способствует восстановлению после острого повреждения почек, вызванного ишемией/реперфузией, путем регулирования поляризации почечных макрофагов. Границы в иммунологии, 11, 473.
Сюй, М., Нагати, Дж. С., Се, Дж., Ли, Дж., Уолтерс, Х., Мун, Ю. А., … Гарсия, Дж. А. (2014). Ацетатный переключатель регулирует стрессовый эритропоэз. Природная медицина, 20 (9), 1018–1026.
Юэ, Ю., Ву, С., Ли, З., Ли, Дж., Ли, С., Сян, Дж., … Дин, Х. (2015). Полисахариды дикого мармелада защищают от экспериментального воспалительного заболевания кишечника, усиливая барьерную функцию кишечника. Еда и функции, 6 (8), 2568–2577.

Чжао С. и Ли Л. (2018). Изотопная маркировка дансилгидразина LC-MS для всестороннего профилирования субметаболома карбоновой кислоты. Аналитическая химия, 90(22), 13514–13522.

Чжэн Л., Чен С., Ван Ф., Хуан С., Лю С., Ян С., … Чен Дж. (2020). Отчетливые реакции кишечной микробиоты на отвар Jian-Pi-Yi-Shen связаны с улучшением клинических результатов у 5/6 нефрэктомированных крыс. Границы фармакологии, 11, 604.