Фиксатор Карновского предотвращает появление артефактов в виде вакуолизации, возникающей в результате обработки тканей в почках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом Ⅰ

Абстрактный: Антисмысловой олигонуклеотид(ASO) терапия была определена как новый метод лечениятрудноизлечимые болезни. Впочки, обработанные АСОВ проксимальных канальцах, помимо базофильных гранул, часто наблюдаются вакуоли. В некоторых сообщениях описывается, что эти вакуоли, вероятно, являются вторичным явлением, возникающим в результатеизвлечение ASOпри обработке тканей. В этом исследовании мы сравнили морфологию почек после фиксации фиксатором Карновского или 4% параформальдегидфосфатным буфером (PFA) с морфологией 10% нейтрально-буферного раствора формальдегида (NBF). Исследовали самок крыс Sprague-Dawley, которым четыре раза внутривенно вводили 50 мг/кг заблокированной нуклеиновой кислоты, содержащей антисмысловые олигонуклеотиды (LNA-ASO), в течение 1 или 2 недель. Микроскопически в почках, фиксированных НБФ, наблюдались вакуоли и базофильные гранулы в проксимальных канальцах. Базофильные гранулы указывают на накопление АСО. Более того, некоторые из вакуолей также содержали слабые базофильные гранулы, что позволяет предположить, что вакуоли имеют отношение к накоплению ASO. Хотя в проксимальных канальцах наблюдалась умеренная вакуолизация, большая часть вакуолизированного эпителия была отрицательной на молекулы повреждения почек -1 при иммуногистохимическом окрашивании. В образцах, подвергнутых фиксации Карновского, вакуоли в проксимальных канальцах не наблюдались, хотя наблюдались базофильные гранулы. В образцах, подвергнутых PFA-фиксации, в проксимальных канальцах наблюдались вакуоли и базофильные гранулы, аналогичные таковым в образцах, подвергнутых NBF-фиксации. В целом, наши результаты продемонстрировали возможность переоценки вакуолизации из-за артефактов во время обработки ткани при использовании традиционной фиксации NBF. Фиксатор Карновского считается полезной альтернативой для отличия искусственных вакуолей от истинной нефротоксичности. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Ключевые слова:антисмысловой олигонуклеотид, артефакт,фиксатор Карновского, вакуолизация, базофильная гранула, почка

Добавка Цистанхе Добавка для поддержки функции почек PhGs75% Ech 30% Act 12%

Недавно терапия антисмысловыми олигонуклеотидами (АСО) была признана новым методом лечения трудноизлечимых заболеваний1, 2. АСО представляют собой короткие синтетические одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды, которые связываются с рибонуклеиновой кислотой и подавляют экспрессию генов3.

С токсикологической точки зрения токсичность, вызванная ASO, подразделяется на токсичность, зависящую от гибридизации, которая связана с последовательностью ASO, и токсичность, независимую от гибридизации, которая связана с химической модификацией. Независимая от гибридизации токсичность индуцируется тремя основными механизмами: 1) накоплением АСО, 2) провоспалительными эффектами и 3) эффектами связывания аптамеров4. Накопление АСО преимущественно наблюдается в печени и почках, а избыточное накопление приводит к дисфункции этих органов5. Провоспалительный эффект индуцируется стимуляцией врожденной иммунной системы посредством связывания с Toll-подобными рецепторами у грызунов и обезьян или активацией альтернативного пути комплемента посредством ингибирования фактора H ASO у обезьян6. Эффект связывания аптамера индуцирует активацию и агрегацию тромбоцитов/тромбоцитопению для связывания специфичного для тромбоцитов рецептора7. Более того, связывание аптамера с внутриклеточными белками гепатоцитов считается одной из причин гепатотоксичности8–10. Чтобы обнаружить эту токсичность, исследователи разработали несколько доклинических тестов; среди них гистопатологическое исследование является одним из наиболее чувствительных тестов для выявления накопления АСО.

Гистопатологически накопление АСО обычно наблюдается в виде базофильных гранул в цитоплазме купферовских клеток печени или проксимальных канальцах почек. Выраженное накопление базофильных гранул коррелирует с увеличением частоты или тяжести дегенеративных изменений, обычно наблюдаемых в виде вакуолизации или дегенерации/некроза эпителия проксимальных канальцев в почках4. Сами по себе базофильные гранулы не считаются токсикологически значимыми11; поэтому дифференциация накопления базофильных гранул от дегенеративных изменений важна для оценки токсичности, связанной с АСО.

Вакуоли, которые часто наблюдаются в проксимальных канальцах почек яванских макак, получавших ASO, содержат базофильный материал и демонстрируют такое же общее распределение внутри клеток, что и базофильные гранулы11, 12. В нескольких сообщениях предполагается, что процесс фиксации может влиять на появление накопления АСО в фаголизосомном компартменте5, 11. Кроме того, Генри и соавт. и Энгельхардт описали, что вакуоли в проксимальных канальцах, вероятно, являются вторичным явлением, возникающим в результате экстракции ASO во время обработки, поскольку вакуоли отсутствуют в перфузионно-фиксированных параформальдегидом/глутаральдегидом почках5, 11. Вакуоли в проксимальных канальцах обработанных яванских макак предположительно, с мипомерсеном появляются в процессе фиксации13.

Таким образом, хотя вакуолизация вследствие обработки АСО в некоторых случаях может быть артефактом, эта гипотеза не была четко доказана, и ни в одном отчете не указан подходящий метод фиксации для токсикологической оценки. Соответственно, в этом исследовании мы сравнили морфологию почек после фиксации фиксатором Карновского или 4% параформальдегидфосфатным буфером (PFA) с морфологией 10% нейтрально-буферного раствора формальдегида (NBF). Кроме того, мы продемонстрировали полезность фиксатора Карновского в качестве альтернативного фиксатора для предотвращения вакуолизации, вызванной артефактами.

Четырехнедельные самки крыс Sprague-Dawley были приобретены у Charles River Laboratories Japan Inc. (Канагава, Япония) и акклиматизированы к лабораторным условиям. Животных содержали в контролируемых условиях (12-часовой цикл света/темноты, температура 23±2 градуса, относительная влажность 50±25%) и им был предоставлен свободный доступ к стандартному коммерческому рациону (автоклавированный CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Токио, Япония) и водопроводную воду. Двадцать животных были распределены на следующие четыре группы (по пять животных в каждой): 1-группа, получавшая недельный физиологический раствор (Контроль- 1W), 2-группа, получавшая недельный физиологический раствор (Контроль{ {14}}W), группа, обработанная 1-недельной заблокированной нуклеиновой кислотой, содержащей антисмысловой олигонуклеотид (LNA-ASO) (ASO-1W), и группа, обработанная 2-неделю LNA ASO (АСО-2В). На момент начала введения LNA-ASO в дозе 50 мг/кг животным было 5 недель. LNA-ASO вводили внутривенно всего четыре раза по следующей схеме: дни 1, 4, 8 и 11 в группе ASO-2W; и дни 1, 2, 3 и 4 в группе ASO-1W. Животных в контрольных группах-1W и ASO-1W умерщвляли на 7-й день. Животных в контрольных группах-2W и ASO-2W забивали на день. 14. При каждом терминальном вскрытии образцы крови для выявления клинической патологии отбирали из полой брюшной вены под глубокой анестезией изофлураном. После забора крови всех крыс подвергали эвтаназии путем обескровливания путем немедленного перерезания брюшной аорты. Внешнюю поверхность тела, грудную и брюшную полости и внутренние органы макроскопически исследовали, а левые почки удаляли и обрабатывали для микроскопического исследования. Все процедуры проводили в соответствии с Правилами кормления и хранения экспериментальных животных и экспериментов на животных Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Образцы сыворотки получали центрифугированием образцов крови при 4 градусах. Биохимический анализ сыворотки проводился с использованием прибора TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Тотиги, Япония) для оценки уровней азота мочевины (АМК) и креатинина (CRE) в крови.

Почки фиксировали тремя фиксирующими растворами следующим образом: после поперечного разделения почки на три сегмента среднюю часть, включая почечную лоханку, фиксировали в 10% NBF на 5 дней; краниальную часть фиксировали фиксатором Карновского (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Токио, Япония); каудальную часть фиксировали в 4% PFA на 17 часов под углом 4 градуса, а затем помещали в 10% NBF на 24 часа. Каждый фиксированный образец обезвоживали и заливали в парафин. Срезы тканей готовили для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием антител, нацеленных на молекулу повреждения почек-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Миннеаполис, Миннесота, США; разведение 1:300) и лизосомально-ассоциированного мембранного белка 2 (LAMP{{). 13}} Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США; разведение 1:1000) после извлечения антигена (цитратный буфер, pH 6,0, нагреваемый в течение 10 минут или нагреваемый под давлением в течение 20 минут). В качестве вторичного антитела использовали Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Токио, Япония).

Служба поддержки Wecistanche:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Магазин для получения дополнительных технических характеристик:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop