KLRG1 маркирует инфильтрирующие опухоль субпопуляции Т-клеток CD4, связанные с прогрессированием опухоли и реакцией на иммунотерапию

Абстрактный

Современные методы обнаружения биомаркеров и идентификации мишеней в иммуноонкологии основаны на статических снимках опухолевого иммунитета. Чтобы тщательно охарактеризовать временной характер противоопухолевого иммунного ответа, мы разработали панель 34-параметрической спектральной проточной цитометрии и провели высокопроизводительный анализ в критических условиях.

Мы использовали две различные доклинические модели, которые резюмируют реакцию иммуноредактирования рака (NPKC1) и блокаду иммунных контрольных точек (ICB) (MC38) соответственно, и профилировали несколько соответствующих тканей в ключевых точках перегиба иммунного надзора и ускользания и / или реакции ICB и вокруг них.

Мишени относятся к важным биомолекулам в клетках, таким как белки, ферменты и рецепторы. Целевое распознавание - это использование химических и биологических методов для определения специфических свойств и функций этих биомолекул для применения в лечении заболеваний и разработке лекарств.

Иммунитет относится к способности организма противостоять вторжению чужеродных патогенов и росту эндогенных аномальных клеток. Ядром иммунной системы являются иммунные клетки и молекулы, которые имеют тесные связи и взаимодействия со своими мишенями.

При лечении заболеваний и разработке лекарств очень важна взаимосвязь между идентификацией мишеней и иммунитетом. Например, механизм действия многих лекарств заключается в распознавании мишеней, нацеливании на определенные белки, ферменты, рецепторы и другие молекулы, влиянии на их функции и регулировании передачи сигналов для достижения терапевтических эффектов. Клетки и молекулы иммунной системы также могут быть мишенями для лекарств. Например, противораковые препараты достигают терапевтических эффектов, влияя на иммунный ответ раковых клеток и регулируя клеточный апоптоз и пролиферацию.

Таким образом, при разработке лекарств и клиническом лечении всесторонний учет факторов идентификации мишеней и иммунитета может привести к более эффективной разработке лекарств и улучшению терапевтического эффекта. С этой точки зрения нам необходимо повышать иммунитет. Цистанхе может повысить иммунитет. Цистанхе богат различными антиоксидантными веществами, такими как витамин С, витамин С, каротиноиды и т. д. Эти ингредиенты могут удалять свободные радикалы, уменьшать окислительный стресс и улучшать иммунитет. системное сопротивление.

Нажмите порошок экстракта цистанхе трубчатой

Анализ данных, основанный на машинном обучении, выявил характер экспрессии KLRG1, который однозначно идентифицировал внутриопухолевые эффекторные популяции Т-клеток CD4, которые конститутивно связаны с опухолевой массой в моделях опухолей и теряются в опухолях, подвергающихся регрессии в ответ на ICB. Точно так же Helios-KLRG1 плюс подгруппа инфильтрирующих опухоль регуляторных Т-клеток (Tregs) была связана с прогрессированием опухоли от иммунного равновесия к ускользанию, а также была потеряна в опухолях, отвечающих на ICB.

Валидационные исследования подтвердили сигнатуры KLRG1 в инфильтрирующих опухоль Т-клетках CD4 человека, связанные с прогрессированием заболевания при раке почки. Эти результаты указывают на то, что популяции KLRG1 плюс CD4 Т-клеток являются подмножествами для дальнейшего исследования иммунитета к раку, и демонстрируют полезность профилирования продольного спектрального потока в качестве механизма динамического обнаружения биомаркеров и/или мишеней.

Введение

Иммунотерапия в настоящее время является одним из столпов лечения рака. Однако ответы на большинство иммунотерапевтических агентов остаются редкими, ограничиваются ограниченным числом типов опухолей и их трудно предсказать (1). Улучшение показателей ответа и разработка биомаркеров, предсказывающих ответ, являются центральными задачами в области иммунологии опухолей, но это остается сложной задачей.

Множество сложных многоклеточных взаимодействий может определять исход противоопухолевого иммунного ответа у любого конкретного пациента. Таким образом, отдельные биомаркеры или терапевтическая модуляция отдельных путей часто оказываются полезными у некоторых, но не у большинства больных раком.

Например, в настоящее время широко используются в клинической практике три иммунных биомаркера; (i) мутационная нагрузка опухоли (TMB), измеренная непосредственно или предполагаемая по наличию инвалидизирующих мутаций в механизме репарации ДНК (2-4), (ii) экспрессия PD-L1 с помощью иммуногистохимии (IHC) (5) и (iii) ранее существовавший иммунитет, измеряемый наличием Т-клеток CD8 внутри и вокруг опухолей, называемый Immunoscore(6).

Хотя каждый из них в значительной степени связан с реакцией на иммунотерапию в определенных условиях, чувствительность и специфичность этих предикторов остаются субоптимальными (7). Эти унимодальные подходы, вероятно, не в состоянии полностью охватить сложные механизмы, лежащие в основе противоопухолевого иммунитета, включая динамическую природу таких ответов, происходящих в тканях и с течением времени.

Таким образом, применение высоко мультиплексированных подходов к профилированию одноклеточных иммунных систем для обнаружения биомаркеров и обнаружения мишеней в кросс-тканевом, лонгитюдном режиме может обеспечить нюансированные иммунные фенотипы с большей прогностической и трансляционной полезностью.

С этой целью мы разработали панель 34-параметрической спектральной проточной цитометрии и конвейер анализа многомерных данных для изучения иммунных фенотипов на уровне белков, связанных с различными фазами цикла иммуноредактирования рака, включая ускользание от иммунного ответа и рост опухоли, а также иммунные контрольные точки. ответ блокады (ICB) в доклинических моделях.

Мы профилировали модели MC38, обработанные NPK-C1 и ICB, анализируя несколько тканей (опухоль, дренирующие и недренирующие лимфатические узлы и кровь) над и вокруг ключевых точек перегиба в прогрессии опухоли. Это облегчило глубокую характеристику динамики, лежащей в основе естественной и индуцированной ICB регрессии опухоли, перехода к иммунному равновесию и последующего перехода от равновесия к неконтролируемому ускользанию опухоли. Валидационные исследования наборов данных по одноклеточным ракам почки человека подтвердили трансляционную актуальность этих результатов.

Материалы и методы

Мыши. Самцы и самки мышей C57BL/6J (возраст 5-6 недель) были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн). На момент использования мышам было 6-8 недель. Все животные содержались в строгом соответствии с правилами NIH и Американской ассоциации по уходу за лабораторными животными. Все эксперименты и процедуры для этого исследования были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Медицинского центра Колумбийского университета (IACUC).

Сотовые линии. Клеточная линия NPK-C1 (первоначально LM7304) была предоставлена ​​доктором Кори АбатеШеном из Колумбийского университета. Дополнительные сведения см. в предыдущих ссылках (8,9). Клетки NPK-C1 поддерживали в среде R10, состоящей из среды RPMI (Corning; Corning, NY) с добавлением 10% FBS (HyClone; Logan, UT), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco; Gaithersburg, МД). Клетки карциномы толстой кишки MC38 были приобретены у Kerafast и культивированы в среде D10, состоящей из DMEM (Corning; Corning, NY) с добавлением 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco; Gaithersburg, MD).

Вызов опухоли и терапевтические инъекции. Клетки NPK-C1 при 70-90 процентном слиянии или клетки MC38 при 50-75 процентном слиянии собирали с 0.05-процентным трипсином (Gibco, Gaithersburg, MD), промывали PBS подсчитывали и ресуспендировали в концентрации 10×106 клеток/мл в охлажденном льдом PBS. В день 0 мышам 6-8 недельного возраста имплантировали в правый бок 1x106 клеток NPK-C1 или MC38. Измерения опухоли регистрировали по осям X, Y и Z (наибольший диаметр, наименьший диаметр и наибольшая высота соответственно) каждые 2-3 дней с помощью цифрового штангенциркуля, а объем опухоли рассчитывали путем умножения X*Y*Z. Анти-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) или антитела изотипа крысиного IgG2a (Bio X Cell; Ливан, Нью-Хэмпшир) разводили в стерильном PBS и вводили внутрибрюшинно (IP) в дозе 200 мкг/сут. мл на мышь в дни 3, 6, 9 и 12 после имплантации MC38.

Забор ткани. После эвтаназии мышей примерно 200 мкл крови выделяли путем пункции сердца с использованием иглы шприца, покрытой 0,2-процентным гепарином (StemCell Technologies; Ванкувер, Британская Колумбия), и помещали на лед в пробирки, содержащие 10 мкл 0,5 М ЭДТА (Корнинг; Корнинг, Нью-Йорк). Дренирующие опухоль и не дренирующие паховые лимфатические узлы вырезали и помещали в 48-луночные планшеты, содержащие 150 мкл среды R10 на льду.

Опухоли собирали, массировали, опухоль до 50 мг нарезали кубиками и помещали в среду X-Vivo 15 (Lonza; Базель, Швейцария) в 5 мл пробирки Эппендорфа на льду. ДНКазу (40 мкл раствора 20 мг/мл; Roche; Базель, Швейцария) и коллагеназу D (125 мкл раствора 40 мг/мл; Roche; Базель, Швейцария) добавляли к образцам опухоли перед инкубацией на шейкере при 37°C в течение 30 минут. Реакции переваривания гасили встряхиванием (30 секунд) и добавлением 5 мл среды R10. Растворы опухолей фильтровали через фильтры 70 мкм (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) и осаждали. Образцы крови подвергали лизису эритроцитов с двумя последовательными 2-минутными инкубациями в 2 мл буфера ACK (Quality Biological; Gaithersburg, MD) и гашением R10 перед осаждением. Лимфатические узлы физически дезагрегировали поршнем шприца объемом 1 мл в 48-луночном планшете, затем суспензии фильтровали через 40- мкм фильтры. Все образцы были помещены в планшеты с U-образным дном 96-для окрашивания.

Проточной цитометрии. Образцы промывали PBS. Мертвые клетки окрашивали ресуспендированием в 100 мкл PBS плюс краситель Live/Dead Fixable Blue (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Эту и все последующие стадии окрашивания или фиксации проводили в течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере для планшетов, защищенном от света. Образцы дважды промывали PBS, затем ресуспендировали в FACS (PBS плюс 3% FBS плюс 1 мМ EDTA плюс 10 мМ HEPES) с добавлением TruStain FcX (1:50; BioLegend; Сан-Диего, Калифорния) и блокатора моноцитов TruStain (1:20; BioLegend; Сан-Диего, Калифорния) и помещают на лед.

Поверхностные антитела были приготовлены в оптимальных разведениях (см. Дополнительную таблицу S1) в FACS с добавлением буфера Brilliant Stain Plus (BD; Franklin Lakes, NJ), а затем были добавлены к образцам в блокирующем растворе. После окрашивания образцы дважды промывали буфером FACS и фиксировали в 100 мкл буфера FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit (eBioscience; Сан-Диего, Калифорния). Образцы дважды промывали 1X пермеабилизирующим буфером (1X PW), а затем окрашивали в 1X PW плюс внутриклеточные антитела. Затем образцы дважды промывали в 1X PW, затем фиксировали в 100 мкл буфера FluoroFix (BioLegend: Сан-Диего, Калифорния), дважды промывали FACS, затем ресуспендировали в 200 мкл FACS и запечатывали в 96-луночных планшетах для сбора данных на следующий день в Cytek Aurora 5-лазерный цитометр.

Одновременно окрашенные образцы спленоцитов использовали для контроля одиночного окрашивания. Анализ и статистика. Эксперименты по продольному профилированию проводились по одному разу для моделей MC38 и NPK-C1. В общей сложности оценивали n=10-25 мышей в каждый момент времени. Данные проточной цитометрии были проанализированы в FlowJo v10.8.1 (BD; Franklin Lakes, NJ), а многомерные подключаемые алгоритмы UMAP и FlowSOM были загружены с FlowJo Exchange. До 30 тыс. живых клеток CD45 плюс инфильтрирующие опухоль клетки и до 15 тыс. живых клеток CD45 плюс клетки крови или LN на образец были объединены для многомерного анализа.

Все уменьшение размерности и кластеризация выполнялись в FlowJo. Статистический анализ был выполнен в GraphPad Prism v9.3.1. Для получения коэффициентов корреляции использовали корреляцию Пирсона, а для сравнения частот кластеров между группами использовали непарные Т-критерии Стьюдента с поправкой Уэлча. Методы анализа отдельных клеток описаны ранее (10,11).

Регулон KLRG1 был извлечен из консенсусного регулона metaVIPER KLRG1 от Obradovic, et al (11). Чтобы вычислить сигнатуру регулонов KLRG1, мы подобрали модель регрессии случайного леса с генами регулонов в качестве признаков и KLRG1 в качестве цели, а затем вычислили показатели важности генов регулонов по Джини, чтобы определить их влияние на экспрессию KLRG1. Оценку регулона KLRG1 каждой клетки давали взвешенной суммой показателей экспрессии всех генов регулона в клетке с показателями важности в качестве весов.

For more information:1950477648nn@gmail.com