Потеря катаболизма BCAA, опосредованная Krüppel-подобным фактором 6, способствует повреждению почек у мышей и людей

edmund.chen@wecistanche.com

Измененный клеточный метаболизм впочкаКлетки проксимальных канальцев (ПТ) играют решающую роль в остромповреждение почек (АКИ). Транскрипционный фактор Krüppel-подобный фактор 6 (KLF6) быстро и надежно индуцируется в начале ПТ ​​после ОПП. Мы обнаружили, что нокдаун Klf6, специфичный для PT (Klf6PTKD), защищает от ОПП ипочкафиброз у мышей. Комбинированный анализ иммунопреципитации РНК и хроматина показал, что экспрессия генов, кодирующих катаболические ферменты аминокислот с разветвленной цепью (BCAA), была сохранена у мышей Klf6PTKD, при этом KLF6 занимает промоторную область этих генов. И наоборот, индуцируемая сверхэкспрессия KLF6 подавляла экспрессию генов BCAA и усугублялаповреждение почеки фиброз у мышей. In vitro поврежденные клетки, сверхэкспрессирующие KLF6, имели сходное снижение экспрессии катаболического гена BCAA и были менее способны утилизировать BCAA. Кроме того, нокдаун BCKDHB, который кодирует одну субъединицу фермента, ограничивающего скорость катаболизма BCAA, привел к снижению выработки АТФ, в то время как обработка усилителем катаболизма BCAA BT2 увеличила метаболизм. Анализфункция почек, KLF6 и экспрессия генов BCAA при хронических заболеваниях человека.Болезнь почекпациентов показали значительные обратные корреляции между KLF6 и обоимифункция почек и выражение BCAA. Таким образом, направленное на KLF6-опосредованное подавление катаболизма BCAA может служить ключевой терапевтической целью при ОПП ипочкафиброз.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ

ХроническийБолезнь почек(CKD) вызывает значительную заболеваемость и смертность и имеет распространенность среди взрослого населения США около 15 процентов. ХБП может быть результатом повторяющихся приступов острогоповреждение почек(ОПН), связанный с экологическими или токсическими воздействиями, или являющийся вторичным по отношению к другим заболеваниям или их лечению. В большинстве случаев проксимальные канальцы (ПТ) являются основным местом повреждения при ОПП, поскольку высокая метаболическая активность ПТ-клеток делает их восприимчивыми к ишемическому повреждению, а их роль в экскреции лекарств и токсинов требует притока потенциально повреждающих агентов через клетки PT (1). Одним из таких классов агентов являются химиотерапевтические препараты, повреждающие ДНК, которые накапливаются в PT-клетках, вызывая ОПП и потерю нефронов. После повреждения клетки PT дедифференцируются и секретируют растворимые факторы, такие как члены семейства Wnt и Hedgehog, а также цитокины (1–4). Выжившие дедифференцированные PT-клетки могут повторно войти в клеточный цикл и пролиферировать для восстановления поврежденных PT с последующей редифференцировкой в ​​полностью функциональные PT-клетки (2). Однако клетки, которые вместо этого подвергаются остановке клеточного цикла в контрольной точке G2/M, могут не восстановиться, что приводит к атрофии и усилению профибротической передачи сигналов (5), запуску фиброза путем стимуляции дифференцировки резидентных фибробластов в миофибробласты, секретирующие белки внеклеточного матрикса, и привлечение иммунных клеток, таких как макрофаги и Т-клетки (1).

Ключевые слова:почка; острая почечная недостаточность; проксимальный каналец; фактор транскрипции; аминокислоты с разветвленной цепью

В дополнение к индукции патогенных сигнальных путей, поврежденные PT-клетки также демонстрируют резко измененный клеточный метаболизм. Неповрежденные клетки PT в значительной степени зависят от митохондриального окисления жирных кислот, цикла трикарбоновых кислот (TCA) и окислительного фосфорилирования для производства АТФ. Однако в условиях травмы окисление жирных кислот подавляется лишь с умеренной компенсаторной повышающей регуляцией гликолиза, так что общие уровни АТФ снижаются при повреждении PT (6). Кроме того, ингибирование окисления жирных кислот in vitro вызывало дедифференцировку и апоптоз эпителиальных клеток канальцев, а in vivo ухудшалоповреждение почекпосле лечения фолиевой кислотой (6). Интересно, что активация либо митохондриального окисления жирных кислот, либо пероксисомального окисления жирных кислот (ФАО) может защитить отповреждение почек(6, 7), предполагая, что сохранение клеточного метаболизма может быть терапевтической целью при ОПП. Транскриптомные исследования биоптатов почек при ХБП человека, а также после ишемического реперфузионного повреждения (ИРИ) у мышей демонстрируют нарушение регуляции метаболизма жирных кислот, а также метаболизма аминокислот (6, 8). Хотя роль окисления PT-жирных кислот при ОПП была описана ранее, роль метаболизма PT-аминокислот при ОПП еще предстоит изучить. Кроме того, механизмы повреждения PT, описанные на сегодняшний день, в основном изучались с использованием моделей мышей с нокаутом и гиперэкспрессией отдельных сигнальных молекул, но механизмы, с помощью которых глобальные пути, как фиброзные/воспалительные, так и метаболические, и переключение между нормальным восстановлением и атрофией регулируются при ОПП, плохо охарактеризованы.

Факторы транскрипции действуют как основные регуляторы фундаментальных биологических процессов благодаря их способности регулировать экспрессию множества нижестоящих мишеней и формировать петли обратной связи. При ОПП сильно активируются хорошо изученные факторы транскрипции, такие как члены семейства FOS и JUN. Недавние исследования молекулярных ответов на IRI в образцах человека и профилирование трансляции PT после односторонней обструкции мочеточника (UUO) у мышей также выявили фактор транскрипции Zin-finger Krüppel-подобный фактор 6 (KLF6) как аналогичный ген ответа на раннее повреждение (9, 10). ). KLF включают семейство транскрипционных факторов цинкового пальца с высококонсервативными С-концевыми ДНК-связывающими доменами и вариабельными N-концами, которые широко экспрессируются, в том числе впочка(11). KLF6 играет роль во многих процессах, таких как пролиферация и дифференцировка клеток, апоптоз, реакция на повреждение ДНК и митохондриальная функция (12).почкафиброз с контекстно-зависимыми эффектами (13, 14). В рамкахпочкаKLF6 экспрессируется в гломерулярных подоцитах и ​​является важным регулятором митохондриальной функции при фокально-сегментарном гломерулосклерозе (ФСГС) (15). В дополнение к его экспрессии в гломерулярных подоцитах, KLF6 также вариабельно экспрессируется в PT, но его роль в PT клетках либо при нормальной функции, либо после повреждения не понятна. Сверхэкспрессия KLF6 в клетках HK-2 приводила к дедифференцированному фенотипу со сниженной экспрессией E-кадгерина и повышенной экспрессией виментина, а также приводила к повышенной экспрессии воспалительного белка макрофагов-3 (16). Кроме того, экспрессия KLF6 увеличивалась в ответ на высокий уровень глюкозы, и этот эффект блокировался нокдауном TGFB1 или обработкой нейтрализующим антителом TGF- 1. Прямая обработка TGF- 1 также индуцировала экспрессию KLF6, что указывает на возможную петлю положительной обратной связи в клетках HK-2 (16). Также было показано, что KLF6 индуцируется в раковых клетках in vitro субапоптотическими дозами повреждающего ДНК химиотерапевтического препарата цисплатина (17). Чтобы определить роль PT KLF6 в ответ на повреждение ДНК, мы использовали встречающийся в природе токсин аристолоховую кислоту I (AAI). Нефропатия, связанная с ААИ, имеет клиническое значение (18), а токсичность ААИ очень специфична для ПТ, что позволяет изучать роль ПТ KLF6 конкретно в ответ на повреждение ПТ. Более того, ИАИ достоверно вызывает как ОПП, так и переход к фиброзу у мышей, в отличие от большинства схем лечения цисплатином (19). AAI проникает в клетки PT через базолатеральные переносчики органических анионов (OAT) 1–3 и оказывает как генотоксическое действие за счет образования аддуктов аристолактама (AL)-ДНК, так и цитотоксическое действие, вызывая повреждение митохондрий, которое генерирует активные формы кислорода и специфически ингибирует нормальный Функции PT, такие как рецептор-опосредованный эндоцитоз (18–20). Здесь мы демонстрируем посредством модуляции экспрессии KLF6, в частности, в PT посредством исследований усиления и потери функции на мышах, что KLF6-опосредованное подавление катаболизма аминокислот с разветвленной цепью (BCAA) способствует ОПП. и последующеепочкафиброз.

Полученные результаты

Лечение AAI увеличивает экспрессию почечного PT Klf6. Поскольку несколько членов семейства KLF экспрессируются в эпителиальных клеткахпочка(21), мы первоначально провели qRT-PCR для этих эпителиальных Klfs впочкакора головного мозга, собранная через 24 часа после однократной дозы PT-специфического токсина, AAI, по сравнению с носителем (диметилсульфоксид [ДМСО]) у мышей C57BL/6. Klf4, Klf5 и Klf6 значительно повышались, в то время как Klf15 значительно подавлялись (рис. 1А), и эти изменения в экспрессии генов происходили до значительного повышения уровня креатинина в сыворотке (рис. 1В). Чтобы определить, является ли активация Klf6 временной или продолжительной, мы вводили AAI в виде нескольких инъекций по 3 дозы либо в течение двух инъекций, либо в течение 3 недель (активная фаза), либо в течение 3 недель с последующими 3 неделями без AAI (фаза ремоделирования) (рис. 1C). . PT оставался интактным через 24 часа после одной инъекции, но после двух инъекций клетки PT подвергались клеточной гибели, а у мышей, получавших многократные дозы AAI, наблюдалась потеря PT, воспалительные инфильтраты, белок.

цилиндры и фиброз в конце фазы ремоделирования (рис. 1D). Экспрессия Klf6 оставалась значительно повышенной в активной фазе и фазе ремоделирования повреждения (Fig. 1E), указывая на роль KLF6 в острой и фиброзной фазах повреждения. KLF6 экспрессируется в гломерулярных, тубулярных и воспалительных клетках, и для определения вклада специфичной для PT экспрессии Klf6 в наблюдаемое увеличение экспрессии Klf6 в корковом слое почек мы провели секвенирование РНК (RNA-seq) в микрорассеченных сегментах S2/S3 PT 24 ч после одной инъекции ААИ, до гибели ПТ-клеток. Klf6 сильно активировался на уровне, сравнимом с хорошо известными факторами транскрипции раннего ответа Fos и Jun, что указывает на то, что ранняя индукция экспрессии матричной РНК (мРНК) Klf6 впочкауправляется его экспрессией в клетках PT (Fig. 1F). Эти результаты согласуются с недавно опубликованными данными одноклеточной/ядерной РНК-секвенции, показывающими повышающую регуляцию Klf6 в PT-клетках у травмированных мышей и людей.почки(22, 23). Наконец, интеллектуальный анализ данных массивов экспрессии из ранее опубликованных исследований временной динамики IRI (8) подтвердил раннюю индукцию экспрессии KLF6 в течение 2 часов после ОПП, аналогично Fos и Jun (рис. 1G). Эти данные свидетельствуют о том, что Klf6 является ранним индуцируемым геном ответа на повреждение после лечения PT-специфическим токсином AAI и после IRI и остается повышенным, несмотря на прекращение AAI.

PT-специфическая потеря KLF6 ослабляет повреждение почек в активной фазе и фазе ремоделирования после лечения AAI.Чтобы определить вклад PT-специфического KLF6 в повреждение, вызванное AAI, мы создали мышей с PT-специфическим нокдауном Klf6 (Klf6PTKD) путем скрещивания мышей Klf6fl/fl (24) с мышами Pepck-Cre (25). Мыши Klf6PTKD были жизнеспособны и фертильны, со значительным нокдауном экспрессии PT-специфического белка KLF6, но без изменений экспрессии мРНК Klf6 в печени по сравнению с мышами Klf6fl/fl (приложение SI, рис. S1 A-C). Не было явных различий впочкагистология или функция между мышами Klf6fl/fl и Klf6PTKD в возрасте 24 недель (приложение SI, рис. S1 D и E), а также уровни экспрессии OAT от 1 до 3 (Slc22a6, Slc22a7 и Slc22a8), путь проникновения AAI PT, существенно не различались (приложение SI, рис. S1F).

Контрольным мышам (Klf6fl/fl) и Klf6PTKD вводили носитель (ДМСО) или 3 мг/кг ААИ внутрибрюшинно каждые 3 дня в течение 3 недель и подвергали эвтаназии через 3 дня после последней инъекции ААИ для оценки активной фазы повреждения или через 3 недели после последняя инъекция AAI для оценки фазы ремоделирования травмы (рис. 1C). У мышей Klf6fl/fl и Klf6PTKD было одинаковое количество аддуктов AL-ДНК как после одной инъекции, так и в конце активной фазы и фазы ремоделирования (приложение SI, рис. S1 G и H), что свидетельствует об одинаковом PT поглощении AAI и восстановлении AL. Аддукты -ДНК у мышей Klf6fl/fl и Klf6PTKD. Во время инъекций мыши, получавшие AAI, теряли вес по сравнению с мышами, получавшими ДМСО, с аналогичным снижением примерно на 18 процентов от исходного уровня как у мышей Klf6fl/fl, так и у мышей Klf6PTKD при последней инъекции AAI с последующим восстановлением аналогичного количества массы тела ( Приложение SI, рис. S2A).Почкамасса тела относительно начальной (день 0) массы тела была одинаковой у мышей Klf6fl/fl и Klf6PTKD, получавших ДМСО и AAI, в конце активной фазы (приложение SI, рис. S2B). На этапе реконструкции,почкиу мышей Klf6fl/fl, получавших AAI, вес значительно меньше, чем у мышей, получавших ДМСО, но у мышей Klf6PTKD, получавших AAI,почкавеса были сохранены (приложение SI, рис. S2B).Функция почекоценивали путем измерения концентрации креатинина в сыворотке (рис. 2А) и азота мочевины (рис. 2В). Концентрации креатинина в сыворотке и концентрации азота мочевины были значительно повышены у мышей, получавших ААИ, по сравнению с ДМСО; однако повышение было значительно меньше у мышей Klf6PTKD по сравнению с мышами Klf6fl/fl (рис. 2А и В). Гистологический анализ с использованием окрашивания гематоксилином и эозином и периодической кислотой по Шиффу показал, что как у мышей Klf6fl/fl, так и у мышей Klf6PTKD, получавших ААИ, были шеддинговые канальцы с остатками базальных мембран, воспалительные инфильтраты, локализованные преимущественно в

наружная кора и множественные белковые слепки как в коре, так и в мозговом веществе (рис. 2 C и D). Однако эти признаки были менее выраженными у мышей Klf6PTKD по сравнению с мышами Klf6fl/fl, с сохранением канальцев и меньшими воспалительными инфильтратами. Анализ области ПТ был проведен с использованием флуоресцентного окрашивания лектином лотоса для выявления интактных щеточных краев ПТ в полностью дифференцированных ПТ-клетках и иммунофлуоресценции на цитокератин -20 (KRT-20) для выявления поврежденных ПТ (8). По сравнению с мышами, обработанными ДМСО, мыши Klf6fl/fl и Klf6PTKD, обработанные AAI, имели значительную потерю зрелого PT, о чем свидетельствует потеря окрашивания лектина Lotus и индукция экспрессии KRT-20, что указывает на повреждение PT как в активная фаза и фаза ремоделирования (рис. 2E и Приложение SI, рис. S2C). У мышей Klf6PTKD, получавших AAI, наблюдалось значительное сохранение зрелого PT по сравнению с мышами Klf6fl/fl, что сопровождалось сходными уровнями индукции KRT- 20 как в активной фазе, так и в фазе ремоделирования. Трихромное окрашивание фазы ремоделированияпочкипоказали обширное отложение фиброзного материала у мышей Klf6fl/fl со значительно меньшим фиброзом у мышей Klf6PTKD (рис. 2F, синее окрашивание; Приложение SI, таблица S1). Отложение компонента фиброзного матрикса коллагена I, обнаруженное с помощью иммунофлуоресценции (рис. 2G и Приложение SI, рис. S2D), показало, что коллаген I был значительно увеличен у мышей Klf6fl/fl с AAI, но не у мышей Klf6PTKD с AAI по сравнению с ДМСО в активная фаза. В фазе ремоделирования коллаген I был значительно увеличен у мышей Klf6fl/fl и Klf6PTKD с AAI, со значительно более низкой процентной площадью у мышей Klf6PTKD с AAI по сравнению с мышами Klf6fl/fl с AAI. Интерстициальные воспалительные клетки, состоящие из CD68 плюс макрофаги и GR-1 плюс миелоидные моноциты, присутствовали в Klf6fl/fl.

и мыши Klf6PTKD, получавшие AAI, но были значительно менее распространены у мышей Klf6PTKD как в активной фазе, так и в фазе ремоделирования (Fig. 2H). Таким образом, потеря специфического для PT KLF6 защищает от AAI-индуцированного повреждения PT, фиброза и воспаления, несмотря на наличие сходных количеств аддуктов AL-ДНК по сравнению с контрольными мышами, получавшими AAI. PT-специфическая потеря KLF6 снижает воспалительную сигнализацию и сохраняет клеточный метаболизм после лечения AAI. Мы стремились понять механизмы, с помощью которых потеря PT KLF6 защищает от повреждений, и поэтому мы провели секвенирование РНКпочкаcortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- или<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

Чтобы определить пути, потенциально прямо или косвенно регулируемые KLF6, мы дополнительно проанализировали дифференциально экспрессируемые гены, классифицировав их на основе наличия и местоположения сайтов связывания KLF6, используя данные секвенирования иммунопреципитации хроматина KLF6 (ChIP-Seq) из проекта Encyclopedia of DNA Elements. . Гены класса 2 были определены как имеющие по крайней мере 1 сайт связывания KLF6 в пределах ±1 т.п.н. от сайта начала транскрипции (TSS), гены класса 1 как имеющие по крайней мере 1 сайт связывания KLF6 между ±1 и 10 т.п.о. Гены TSS и класса 0 как не имеющие сайта связывания KLF6 в пределах ±10 kb от TSS. Было 538 генов, которые регулировались как с повышением у мышей Klf6fl/fl, так и со значительно сниженным уровнем у мышей Klf6PTKD по сравнению с мышами Klf6fl/fl в активной фазе. Анализ обогащения путей этих 538 генов показал, что пути, связанные с врожденным иммунитетом (например, TYROBP, фагосомы и макрофаги) и связанные с клеточной адгезией (например, интегрин, фокальная адгезия), были значительно обогащены (рис. 3А). Классификация генов по сайтам связывания KLF6 показала, что большинство ДЭГ (428/538) не имеют сайтов связывания KLF6 (класс 0), а анализ обогащения генов класса 2 (72) и генов класса 0 по отдельности показали, что значение этих путей в значительной степени определяется генами класса 0, что указывает на то, что более низкая экспрессия этих генов у мышей Klf6PTKD, вероятно, была косвенным эффектом меньшего повреждения PT в результате специфичного для PT нокдауна Klf6 (Fig. 3A).

CISTANCHE УЛУЧШИТ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК

Было 388 генов, которые были подавлены у мышей Klf6fl/fl и значительно сохранены (активированы) у мышей Klf6PTKD по сравнению с мышами Klf6fl/fl. Анализ обогащения путей показал, что эти гены представляют собой метаболические пути с заметным метаболизмом аминокислот и метаболизмом жирных кислот (рис. 3B и Приложение SI, рис. S4). Анализ обогащения генов класса 2 (1{{10}}3) и генов класса 0 (246) показал, что, несмотря на то, что только ~25% генов имеют сайты связывания KLF6 в пределах ±1 т.п.н. от TSS ( класс 2), это подмножество генов было движущей силой для очень значимых значений P этих путей. Поразительно, метаболические пути специфических аминокислот (Val, Leu и Ile [BCAA] и Gly, Ser и Thr) были одинаково значимы, когда анализировались только гены класса 2, что предполагает потенциальную прямую регуляцию этих путей с помощью KLF6 (рис. 3B). . Напротив, высокая значимость путей метаболизма жирных кислот и сигнального пути PPAR в значительной степени обусловлена ​​генами класса 0, что предполагает косвенное сохранение этих путей в результате PT-специфического нокдауна Klf6. Анализ обогащения набора генов для конкретных метаболических путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) (деградация жирных кислот, метаболизм аминокислот, цикл ТСА и гликолиз) с использованием всех дифференциально регулируемых генов подтвердил, что они значительно активируются (сохраняются) в Klf6PTKD против мышей Klf6fl/fl (рис. 3C).

Индукция KLF6 обостряетТравма почеки подавляет катаболические гены BCAA после лечения ИАИ. Чтобы определить, будет ли сверхэкспрессия KLF6 иметь противоположные эффекты, мы использовали систему «tet-on» для создания мышиной модели с индуцируемой доксициклином (DOX) экспрессией человеческого KLF6 (hKLF6OE; двойной трансгенный CAG-rtTA,TRE-hKLF6). мыши) (приложение SI, рис. S5A). У мышей hKLF6OE наблюдалась устойчивая индукция экспрессии hKLF6 после добавления в рацион DOX в течение 7 дней без существенных различий в экспрессии Klf6 у мышей (приложение SI, рис. S5B), ипочкине обнаруживали явных гистологических повреждений или потерифункция почекпосле непрерывного лечения DOX в течение 15 недель (приложение SI, рис. S5 C и D) по сравнению с контрольными мышами (TRE-hKLF6 с лечением DOX). Однако, чтобы выяснить, усугубляет ли индукция hKLF6 при ПТ ОПП ипочкафиброза, hKLF6OE и контрольных мышей лечили более низкой дозой 1 мг/кг AAI или ДМСО каждые 3 дня в течение 2 недель с последующей эвтаназией еще через 3 дня (активная фаза) или еще 2 недели (фаза ремоделирования) (приложение SI, рис. , S6A). Контрольные мыши и мыши hKLF6OE, получавшие AAI, потеряли одинаковое количество массы тела (приложение SI, рис. S6B) ипочкавеса были одинаковыми во всех группах (приложение SI, рис. S6C). Мыши hKLF6OE имели значительно повышенный уровень креатинина и азота мочевины в сыворотке по сравнению с контрольными мышами после лечения AAI в активной фазе (рис. 4 A и B). Это сопровождалось потерей зрелого PT с более высокой долей KRT-20-положительного PT, что усугублялось у мышей hKLF6OE в обе временные точки (рис. 4 C–E и Приложение SI, рис. S6D) и увеличивалось. фиброз в обеих фазах (рис. 4F и Приложение SI, рис. S6E). qRT-PCR анализ генов, кодирующих ферменты метаболического пути BCAA, показал супрессию генов BCAA после лечения AAI у контрольных мышей и мышей hKLF6OE с дальнейшим подавлением у мышей hKLF6OE по сравнению с контрольными мышами (рис. 4G). Кроме того, экспрессия нескольких генов BCAA также была либо значительно снижена (Hibch), либо имела тенденцию к снижению экспрессии у hKLF6OE по сравнению с контрольными мышами даже без лечения AAI (обработка ДМСО) (рис. 4G). Эти данные свидетельствуют о том, что индукция hKLF6 у взрослых мышей приводит кпочкаболее восприимчив к ОПП и возможному фиброзу со значительным нарушением регуляции генов, кодирующих катаболизм BCAA.

Индукция KLF6 подавляет катаболизм BCAA, который является важным субстратом для производства АТФ in vitro.Митохондриальный катаболизм BCAA может способствовать окислительному фосфорилированию за счет продукции ацетил-КоА и сукцинил-КоА (приложение SI, рис. S4B). Чтобы выяснить, регулирует ли KLF6 BCAA и клеточный метаболизм in vitro, мы сначала оценили экспрессию метаболических генов BCAA в клетках HK-2 со сверхэкспрессией KLF6 (KLF6-OE) с обработкой AAI или без нее. Как и у мышей hKLF6OE, сверхэкспрессия KLF6 только в клетках HK-2 приводила к тенденции к подавлению нескольких генов, кодирующих ферменты BCAA, особенно BCKDHB. Обработка контрольных клеток KLF6-Con 25 мкМ AAI в течение 6 ч значительно подавляла экспрессию нескольких ферментов, и они были дополнительно подавлены в клетках KLF6-OE, обработанных AAI (рис. 5A). К

Рис. 3. Потеря KLF6 подавляет профибротические пути и сохраняет метаболические пути после лечения ААИ. (A) Классификация и анализ обогащения путей генов с повышенной экспрессией у мышей Klf6fl/fl после AAI, но со значительно меньшей активацией у мышей Klf6PTKD после AAI в соответствии с классом сайтов связывания: класс 2 с сайтом связывания KLF6 больше или равным 1 в пределах ±1 кб TSS; класс 1 с сайтом связывания KLF6 больше или равным 1 на расстоянии ± 1–1 0 т.п.н. от TSS; и класс 0 без сайта связывания KLF6 в пределах ± 10 кб от TSS. (B) Классификация и анализ обогащения путей генов, экспрессия которых снижена у мышей Klf6fl/fl после AAI, но значительно менее подавлена ​​(т.е. сохранена) у мышей Klf6PTKD после AAI в соответствии с классом сайтов связывания: класс 2 с больше или равно 1 сайт связывания KLF6 в пределах ±1 т.п.о. от TSS; класс 1 с сайтом связывания KLF6 больше или равным 1 на расстоянии ± 1–10 кб от TSS; и класс 0 без сайта связывания KLF6 в пределах ±10 кб от TSS. (C) Графики анализа обогащения набора генов с использованием всех дифференциально экспрессируемых генов для деградации жирных кислот KEGG (FA DEGRAD), метаболизма аминокислот (AA METAB) и цикла TCA (KEGG_TCA).

определить, привело ли это подавление экспрессии гена BCAA в присутствии AAI к изменениям в катаболизме BCAA, мы измерили внутриклеточные концентрации BCAA. После обработки AAI клетки KLF6- Con продемонстрировали снижение BCAA, что согласуется с повышенным катаболизмом BCAA, возможно, как компенсацию потери окисления FA (рис. 5B). Однако этот эффект был утрачен в клетках KLF6-OE, у которых не наблюдалось снижения внутриклеточного уровня BCAA после обработки AAI, что согласуется со сниженной способностью катаболизировать BCAA (рис. 5B), и это коррелирует со снижением митохондриальной продукции АТФ. по сравнению с клетками KLF6-Con, обработанными AAI (рис. 5C).

Стандартная среда, используемая для измерения продукции АТФ, содержит высокие концентрации глюкозы (10 мМ глюкозы, 1 мМ глутамина и 2 мМ пирувата), и чтобы определить, может ли избыточная экспрессия KLF6 изменить использование различных источников энергии, мы вместо этого провели анализы скорость потребления кислорода (OCR) в средах с ограничением энергии (бессывороточная среда с 1 мМ глюкозой, без глютамина и без пирувата). Клетки KLF6-OE имели сниженный митохондриальный OCR (определяемый как исходный OCR минус немитохондриальный OCR, определенный после введения ротенона/антимицина А), но имели аналогичную компенсацию после блокирования гликолиза 2-дезоксиглюкозой (2- DG) и аналогичные FAO (снижение OCR после блокирования FAO этимоксиром) (рис. 5 D и E). Поскольку митохондриальный ответ на потерю гликолиза и OCR в результате окисления ЖК не изменились в клетках KLF6-OE, это предполагает, что общая функция митохондрий не была затронута, а скорее неспособность использовать BCAA в качестве источника может объясняют исходное снижение митохондриального OCR в этих условиях ограничения энергии. Чтобы определить, приведет ли потеря катаболизма BCAA к снижению продукции митохондриального АТФ, мы создали клетки HK-2 с нокдауном BCKDHB (приложение SI, рис. S7). BCKDHA и BCKDHB кодируют две субъединицы большого белкового комплекса кетокислотной дегидрогеназы с разветвленной цепью (BCKDH), которая катализирует первую необратимую и ограничивающую скорость стадию катаболизма BCAA и ингибируется фосфорилированием киназой BCKDH (BCKDK) (28). Чтобы сместить контрольные клетки BCKDHB-SCR и нокдаун клеток BCKDHB-sh в сторону митохондриальной продукции АТФ, их предварительно инкубировали в 2-DG для блокировки гликолиза в течение 1 часа перед проведением анализа скорости продукции АТФ. Нокдаун BCKDHB привел к значительному снижению производства АТФ, что свидетельствует о том, что BCAA используются для производства АТФ в организме человека.почкаклетки (рис. 5F). И наоборот, чтобы

Рис. 4. У мышей hKLF6OE обострениеповреждение почекс подавлением генов BCAA. (A и B) Концентрации креатинина в сыворотке (A) и азота мочевины (B) у контрольных мышей и мышей hKLF6OE, получавших ДМСО или AAI в активной фазе. n=4 до 9 на группу; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" по="" сравнению="" с="" тем="" же="" генотипом="" с="" дмсо;="" **p="">< 0.01="" по="" сравнению="" с="" контролем="" с="" aai;="" однофакторный="" дисперсионный="" анализ="" с="" поправкой="" сидака="" для="" множественного="" тестирования.="" (c="" и="" d)="" репрезентативные="" гистологические="" изображения,="" окрашенные="" гематоксилином="" и="" эозином="" (c)="" и="" периодической="" кислотой="" шиффа="" (d).="" желтые="" стрелки:="" отделяющиеся="" канальцы;="" черные="" стрелки:="" остатки="" базальных="" мембран;="" желтые="" стрелки:="" белковые="" цилиндры;="" и="" черные="" стрелки:="" воспалительные="" инфильтраты.="" (шкала,="" 100="" мкм.)="" (e)="" иммунофлуоресцентное="" окрашивание="" цитокератина-20="" (krt-20)="" в="" качестве="" маркера="" поврежденного="" pt="" (красный)="" с="" окрашиванием="" лектином="" лотоса="" (ll="" )="" как="" маркер="" неповрежденного="" пт="" (зеленый).="" (шкала="" баров,="" 250="" мкм.)="" (f)="" иммунофлуоресцентное="" окрашивание="" для="" -sma="" (зеленый)="" с="" дополнительным="" окрашиванием="" для="" edu="" (пурпурный).="" (шкала="" шкалы,="" 100="" мкм.)="" (g)="" экспрессия="" мрнк="" генов="" bcaa="" у="" контрольных="" мышей="" и="" мышей="" hklf6oe,="" получавших="" дмсо="" или="" aai="" в="" активной="" фазе.="" n="5" по="" 9="" на="" группу;="" $p=""><0,01, $$p=""><0,001 по="" сравнению="" с="" контролем="" с="" дмсо;="" все="" hklf6oe="" с="" aai="" имеют="" p=""><0,001 по="" сравнению="" с="" hklf6oe="" с="" дмсо;=""><0,05,><0,01,><0,001 по="" сравнению="" с="" контролем="" при="" таком="" же="" лечении;="" множественные="" t-тесты="" с="" коррекцией="" частоты="" ложных="" открытий="" с="" использованием="" двухступенчатой="" ​​повышающей="" модели="" бенджамини,="" крейгера="" и="" йекутиэли.="" данные="" представляют="" собой="" среднее="" значение="" ±="" sem,="" где="" n="" указывает="" количество="" биологических="">

усилить катаболизм BCAA, мы обработали клетки HK-2 BT2, который ингибирует BCKDK, тем самым блокируя ингибирующее фосфорилирование BCKDH. В условиях ограничения энергии обработка BT2 увеличивала OCR в клетках, обработанных ДМСО, который сохранялся после ингибирования гликолиза, а не из-за изменения FAO или немитохондриального OCR (рис. 5 G и H). Эти результаты показывают, что опосредованное KLF 6- подавление катаболизма BCAA снижает выработку митохондриального АТФ, что, вероятно, усугубляет повреждение PT в условиях клеточного стресса, при котором существуют аналогичные условия ограничения энергии из-за нарушения FAO.

Экспрессия гена BCAA снижена у разных мышей и людейТравмы почек. Чтобы определить, происходит ли потеря экспрессии гена BCAA до потери PT и повышения уровня креатинина при повреждении, вызванном AAI, мы провели qRT-PCR у мышей C57BL/6, получавших однократную дозу AAI и подвергнутых эвтаназии через 24 часа. Bckdhb, Hibch и Mccc2 уже значительно подавлялись в этот момент времени, при этом другие гены (например, Acadm) демонстрировали сильную тенденцию к подавлению (Fig. 6A). Изучить экспрессию гена BCAA у других мышей.повреждение почекмоделей мы провели qRT-PCR у мышей, получавших цисплатин (рис. 6B) или подвергнутых UUO (рис. 6C). В обеих моделях экспрессия Klf6 сильно повышалась по сравнению с носителем/контролем. У мышей, получавших цисплатин, некоторые из протестированных генов BCAA были значительно подавлены, с тенденцией к подавлению других генов (рис. 6B). У мышей, подвергшихся UUO, все протестированные гены были значительно подавлены как через 3, так и через 7 дней после UUO (рис. 6C), что позволяет предположить, что подавление генов BCAA происходит рано после травмы.

Рис. 5. Сверхэкспрессия KLF6 подавляет экспрессию гена BCAA, продукцию АТФ и утилизацию BCAA in vitro. (A) Экспрессия метаболических генов KLF6 и BCAA в клетках HK-2, стабильно экспрессирующих контрольные (Con) или сверхэкспрессирующие (OE) плазмиды KLF6, обработанные ДМСО или AAI. n=4 на группу; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" по="" сравнению="" с="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}}5,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0,001="" по="" сравнению="" с="" той="" же="" клеточной="" линией="" с="" дмсо;="" двусторонний="" дисперсионный="" анализ="" с="" поправкой="" тьюки="" для="" множественного="" тестирования.="" (b)="" количественное="" определение="" общего="" количества="" bcaa="" в="" клетках="" con="" и="" oe,="" обработанных="" дмсо="" или="" aai.="" n="6" на="" группу;=""><0,05 по="" сравнению="" с="" con="" дмсо;="" односторонний="" дисперсионный="" анализ="" с="" поправкой="" сидака="" для="" множественного="" тестирования.="" (c)="" процентное="" изменение="" скорости="" продукции="" митохондриального="" атф="" в="" клетках="" con="" и="" oe,="" обработанных="" aai,="" по="" сравнению="" с="" дмсо.="" n="27" до="" 30="" на="" группу;=""><0,05,><0,001 по="" сравнению="" с="" дмсо,=""><0,05 по="" сравнению="" с="" con="" aai;="" односторонний="" дисперсионный="" анализ="" с="" поправкой="" сидака="" для="" множественного="" тестирования.="" (d)="" измерения="" ocr="" для="" клеток="" con="" и="" oe="" в="" ограниченных="" средах.="" где="" указано,="" добавляли="" 2-dg,="" этомоксир="" (eto)="" и="" комбинацию="" ротенон/антимицин="" a="" (rot).="" n="16" на="" группу.="" (e)="" количественные="" оценки="" базального="" митохондриального="" ocr="" (начальный="" ocr="" минус="" ocr="" после="" rot),="" немитохондриального="" ocr="" (ocr="" после="" rot)="" и="" изменений="" в="" ocr="" после="" добавления="" 2-dg="" (митохондриальная="" компенсация="" после="" 2-dg)="" и="" этомоксир="" (фао).="" n="16" на="" группу;="" **p=""><0,01 по="" сравнению="" с="" con;="" двусторонний="" дисперсионный="" анализ="" с="" поправкой="" тьюки="" для="" множественного="" тестирования.="" (f)="" скорость="" продукции="" митохондриального="" атф="" в="" клетках="" bckdhb-scr="" и="" bckdhb-sh.="" n="14" на="" группу;="" **p=""><0,05, непарный="" t-критерий.="" (g)="" измерения="" ocr="" в="" клетках="" hk-2="" в="" ограниченных="" средах="" в="" отсутствие="" или="" в="" присутствии="" bt2.="" где="" указано,="" были="" добавлены="" 2-dg,="" eto="" и="" rot.="" (h)="" количественные="" оценки="" базального="" митохондриального="" ocr,="" немитохондриального="" ocr="" и="" изменений="" в="" ocr="" после="" добавления="" 2-dg="" и="" этооксира="" в="" клетки="" hk-2="" в="" отсутствие="" или="" в="" присутствии="" bt2.="" n="8" на="" группу;="" *="" p=""><0,05 по="" сравнению="" с="" отсутствием="" bt2;="" двусторонний="" дисперсионный="" анализ="" с="" поправкой="" тьюки="" для="" множественного="" тестирования.="" данные="" представляют="" собой="" среднее="" значение="" ±="" sem,="" где="" n="" указывает="" количество="" биологических="">

Аналогичным образом, сбор данных ранее описанного массива экспрессии из тубулоинтерстициального компартмента 36 пациентов с ХБП (гипертоническая и диабетическаязаболевания почек) по сравнению с пациентами из контрольной группы (6) показали, что несколько генов BCAA подавляются аналогично мышам, получавшим AAI (рис. 6D). Для дальнейшего выяснения отношений междуфункция почек, экспрессии KLF6 и экспрессии генов BCAA при ХБП человека, мы использовали опубликованную матрицу экспрессии из тубулоинтерстициального компартмента серии из 164 пациентов с различнымизаболевания почек (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 мл/мин/1,73 м2) (P < 0,001="" для="" всех="" генов),="" демонстрируя,="" что="" эти="" изменения="" в="" экспрессии="" генов="" могут="" возникать="" на="" ранней="" стадии="" по="" отношению="" к="" функциональным="" изменениям.="" в="" совокупности="" эти="" данные="" свидетельствуют="" о="" том,="" что="" klf6-опосредованное="" подавление="" генов,="" критически="" важных="" для="" катаболизма="" bcaa,="" может="" играть="" решающую="" роль="" в="">повреждение почекв мышиных моделяхпочкафиброза, а также при ХБП у человека.

Обсуждение

В этом исследовании мы демонстрируем роль PT-специфического KLF6 in vivo в условияхпоражение почек.KLF6 строго и последовательно регулируется в начале ПВ в ответ наповреждение почек, но это неадекватная реакция, о чем свидетельствует защитный эффект потери PT Klf6 после лечения клинически значимым и высоко специфичным для PT токсином AAI. Кроме того, мы демонстрируем потенциальное значение нарушения регуляции метаболизма BCAA при травмированном ПТ как возможного фактора ОПП и последующего фиброза. Потеря Klf6 привела к сохранению экспрессии катаболических ферментов BCAA, при этом несколько генов, кодирующих эти ферменты, имели сайты связывания KLF6 в непосредственной близости от их TSS, что позволяет предположить, что KLF6 может быть транскрипционным супрессором катаболизма BCAA. Хотя ранее было показано, что другой член семейства KLF, KLF15, регулирует экспрессию аминотрансферазы 2 с разветвленной цепью скелетных мышц (Bcat2) (30), о регуляции других ферментов BCAA не сообщалось. Мы предполагаем, что KLF6 подавляет экспрессию нескольких генов, кодирующих ферменты BCAA.

При неповрежденном ПТ экспрессия Klf6 низкая и вариабельно экспрессируется в одних ПТ-клетках, но не в других. Быстрая и надежная повышающая регуляция, которая происходит после нескольких типов травм, указывает на физиологически важную роль KLF6. Недавно было показано, что в фибробластах KLF6 активируется в ответ как на онкогенный, так и на окислительный стресс, что приводит к клеточному старению, в то время как подавление KLF6 приводит к накоплению маркеров повреждения ДНК и нестабильности генома (31). Т.о., физиологическая роль KLF6 при повреждении может заключаться в индукции клеточного старения, позволяющей репарировать повреждения ДНК, которые могут возникнуть в результате токсических или окислительных/ишемических повреждений. Тем не менее, в поврежденных клетках PT вторым последствием повышающей регуляции Klf6, по-видимому, является подавление катаболизма BCAA, которое, в частности, в клетках PT, вероятно, вредно. Интересно, что, несмотря на частичный нокдаун PT-специфического Klf6 на исходном уровне у мышей Klf6PTKD, это все еще могло оказывать явный защитный эффект после травмы. Это имеет важное терапевтическое значение, так как предполагает, что только небольшая манипуляция уровнями или активностью KLF6 (например, с помощью низкомолекулярных ингибиторов) может показать терапевтическую эффективность. Действительно, факторы транскрипции более вероятны, чем другие семейства генов.

в геноме человека, чтобы иметь чувствительность к дозе (32). Точно так же одно ограничение нашей мышиной модели индуцируемой сверхэкспрессии KLF6 заключается в том, что она не ограничена PT-клетками, и поэтому будущие исследования должны быть сосредоточены на использовании клеточно-специфичной индуцируемой модели для выяснения роли KLF6, зависящей от клеточного контекста.

Ранее мы показали, что потеря Klf6 в гломерулярных подоцитах была вредной при ФСГС из-за его роли в транскрипционной активации синтеза цитохром-с-оксидазы 2 (Sco2). Потеря Klf6 при ФСГС приводила к усилению фиброза с повышенной активацией внутреннего пути апоптоза (15). Опрос доступных наборов данных одноклеточной РНК-seq показывает, что у здоровых мышейпочки,Klf6 экспрессируется в гораздо большей доле подоцитов, чем в клетках PT, и на гораздо более высоком уровне (ссылка 33; https://susztaklab.com/). Следовательно, KLF6, вероятно, играет более важную физиологическую роль в нормальных подоцитах, чем в клетках PT, тогда как другие известные митохондриальные главные регуляторы (например, Ppara) экспрессируются в клетках PT гораздо сильнее, чем в подоцитах. Т.о., потеря Klf6 в подоцитах, вероятно, имеет более вредный эффект, чем в PT-клетках. Контрастные роли KLF6 в разных типах клеток в пределахпочкапараллели с предыдущими выводами о клеточно-специфических эффектах в сердце и печени. Таким образом, нокдаун Klf6 в сердечных миоцитах у мышей ослаблял сердечный фиброз после чрезмерной нагрузки ангиотензином II, указывая на роль KLF6 в распространении фиброза, но нокдаун Klf6 в сердечных миофибробластах не влиял на фиброз (14). Наоборот, в печени нокдаун Klf6 в гепатоцитах мыши не влиял на фиброз печени после длительного введения CCl4, но сверхэкспрессия KLF6 в звездчатых клетках печени приводила к уменьшению фиброза, что позволяет предположить, что KLF6 является защитным (13).

CISTANCHE УЛУЧШИТ БОЛИ В ПОЧЕКАХ

Потеря ФАО во времяповреждение почекв настоящее время известно как важное событие в патологииповреждение почеки действительно может непосредственно способствовать фиброзу. В отсутствие FAO, который является основным источником энергии для неповрежденного PT, другие потенциальные источники энергии могут приобретать большее значение. BCAA участвуют в цикле ТСА за счет производства ацетил-КоА и сукцинил-КоА. Недавнее исследование показало, что BCAA, меченные 13C, не только способствуют образованию промежуточных продуктов цикла TCA в организме.почканопочкаимели четвертое место по включению 13C в промежуточные продукты цикла ТСА тестируемых органов после поджелудочной железы, мышц и белой жировой ткани (34), что позволяет предположить, что BCAA являются потенциально важными участниками цикла ТСА. Тем не менее, значение катаболизма BCAA в содействии циклу TCA как в норме, так и при травмахпочки, ранее не исследовалась. Например, неизвестно, будет ли потеря катаболизма PT BCAA сама по себе вызывать изменения в гомеостазе и/или репарации PT, и эти исследования потребуют создания новых моделей мышей, таких как PT-специфические мыши с нокдауном Bckdhb. В обстановкепочкатравмы, при резком угнетении ФАО дополнительное угнетение

гены, кодирующие метаболические ферменты BCAA, могут лишить клетки канальцев важного альтернативного потенциального источника энергии. Важно отметить, что экспрессия гена BCAA уже снижалась через 24 часа после однократной инъекции, до каких-либо изменений в сывороточном креатинине или потере PT, что указывает на то, что это снижение было специфическим последствием повреждения PT и не было связано со снижением потребности в энергии PT, приводящим к из-за снижения СКФ и, как следствие, снижения потребности в поглощении растворенных веществ. Эти пути были сохранены у мышей Klf6PTKD, которые были защищены от повреждений, и дополнительно подавлены у мышей hKLF6OE, которые имели более серьезные повреждения. Кроме того, клетки KLF6-OE снижали выработку митохондриального АТФ после обработки AAI по сравнению с клетками KLF6-Con, а внутриклеточные BCAA снижались в клетках KLF6-Con, что согласуется с их катаболизмом. , это снижение не было обнаружено в клетках KLF6-OE. Кроме того, нокдаун BCKDHB в клетках HK-2 приводил к снижению продукции митохондриального АТФ. Таким образом, сохраненная экспрессия генов BCAA у мышей Klf6PTKD может обеспечить защиту от повреждений, обеспечивая жизненно важные промежуточные продукты цикла TCA в условиях сильно сниженного окисления жирных кислот. Будущие исследования с использованием мышей с генетическими манипуляциями катаболизма BCAA и/или лечением BT2 позволят нам исследовать динамику между катаболизмом BCAA и FAO в организме.повреждение почек.

Мы показали, что потеря экспрессии генов BCAA приводит к снижению митохондриального дыхания и продукции АТФ, и это представляет собой один из механизмов, посредством которого потеря катаболизма BCAA может способствоватьповреждение почек. Альтернативным механизмом может быть накопление BCAA, что может иметь токсический эффект. Действительно, это было показано в условиях ИРИ сердца. Было показано, что накопление BCAA из-за потери катаболизма ингибирует митохондриальную утилизацию пирувата за счет посттрансляционной инактивации пируватдегидрогеназы, тем самым удаляя дополнительный источник клеточной энергии и усугубляя повреждение (35). Это было обращено либо за счет увеличения катаболизма BCAA путем лечения мышей BT2, либо за счет увеличения метаболизма глюкозы за счет сверхэкспрессии GLUT1. Недавнее исследование также показало обострение сердечной ИРИ из-за потери катаболизма BCAA у мышей с диабетом. Это сопровождалось усилением окислительного стресса и снова было обращено вспять реактивацией катаболизма BCAA (36). Известно, что BCAA и, в частности, лейцин активируют передачу сигналов комплекса 1 рапамицина (mTOR) млекопитающих (mTORC1). В мышиной модели поликистозаБолезнь почек,в которых клетки, окружающие кисты, имеют активацию mTOR

сигнальный путь, добавление BCAA дополнительно активировало сигнальный путь mTORC1, что приводило к усилению пролиферации (37). Транскрипционное профилирование гепатоцеллюлярной карциномы выявило снижение экспрессии гена BCAA, что приводит к накоплению BCAA в опухолевой ткани. Это было связано с повышенной передачей сигналов и пролиферацией mTORC1, которые были снижены за счет ограничения BCAA или лечения BT2 и усугублялись у мышей, получавших диету с высоким содержанием BCAA (38). Передача сигналов mTORC1 необходима для функции PT, и исследования с использованием ингибиторов mTOR вповреждение почекпоказали противоречивые результаты, вероятно, из-за различных режимов дозирования, сроков лечения и моделей травм (39–42). Передача сигналов mTORC1 приводит к множеству клеточных ответов, включая рост и пролиферацию клеток, синтез липидов, митохондриальный синтез и подавление аутофагии (43). Вполне вероятно, что либо недостаточная, либо чрезмерная активация передачи сигналов mTORC1 может быть вредной и что для правильной клеточной функции необходим баланс. Например, чрезмерная активация передачи сигналов mTORC1 при повреждении PT может привести к пагубному подавлению аутофагии, которая необходима для удаления поврежденных митохондрий и, как было показано, важна для восстановления после PT.травмы (39, 42, 44, 45). Таким образом, накопление лейцина может иметь пагубную роль вповреждение почексверхактивацией передачи сигналов mTORC1 и подавлением аутофагии. В заключение мы показали, что устойчивая повышающая регуляция Klf6, которая происходит вповреждение почекявляется пагубным, при котором потеря PT-специфического Klf6 сохраняла экспрессию гена BCAA и ослабляла ОПП и, в конечном итоге, фиброз. И наоборот, индукция KLF6 у мышей подавляла экспрессию гена BCAA и приводила кпочкачувствительный К.. восприимчивый к чему-либопоражение почек.Кроме того, гены, кодирующие несколько ферментов BCAA, имеют сайты связывания KLF6, что позволяет предположить, что KLF6 может быть транскрипционным регулятором катаболизма BCAA. Понижающая регуляция катаболизма BCAA in vitro путем сверхэкспрессии KLF6 и лечения AAI или путем нокдауна BCKDHB привела кснижение продукции митохондриального АТФ. В совокупности этоданные свидетельствуют о том, что терапевтическая направленность на сохранениеКатаболизм BCAA может обеспечить альтернативный митохондриальныйисточник энергии в условияхповреждение почекв котором ФАОуменьшен.