Лизосомальная перекисное окисление липидов регулирует иммунитет опухоли

Ингибирование лизосом, вызванное ингибиторами пальмитоилпротеинтиоэстеразы 1 (PPT1), такими как DC661, может вызывать гибель клеток, но механизм этого до конца не ясен. Запрограммированные пути гибели клеток (аутофагия, апоптоз, некроптоз, ферроптоз и пироптоз) не требовались для достижения цитотоксического эффекта DC661. Ингибирование катепсинов или хелатирование железа или кальция не устраняло цитотоксичность, индуцированную DC661-. Ингибирование PPT1 индуцировало лизосомальную перекисное окисление липидов (LLP), что приводило к проницаемости лизосомальных мембран и гибели клеток, которую можно было обратить вспять антиоксидантом N-ацетилцистеином (NAC), но не другими антиоксидантами перекисного окисления липидов. Лизосомальный переносчик цистеина MFSD12 был необходим для внутрилизосомного транспорта NAC и спасения LLP. Ингибирование PPT1 приводило к внутренней клеточной иммуногенности с поверхностной экспрессией кальретикулина, которую можно было обратить только с помощью NAC. Клетки, обработанные DC661-, активировали наивные Т-клетки и усиливали опосредованную Т-клетками токсичность. Мыши, вакцинированные клетками, обработанными DC661-, вызывали адаптивный иммунитет и отторжение опухоли в «иммунно-горячих» опухолях, но не в «иммунно-холодных» опухолях. Эти результаты демонстрируют, что LLP приводит к гибели лизосомальных клеток, уникальной иммуногенной форме гибели клеток, указывая путь к рациональным комбинациям иммунотерапии и лизосомального ингибирования, которые могут быть проверены в клинических испытаниях.

Преимущества цистанхе тубулозной-противоопухолевой

Введение

Обнадеживающая активность в клинических испытаниях с участием лизосомального ингибитора гидроксихлорохина (HCQ) (1), идентификация пальмитоилпротеинтиоэстеразы 1 (PPT1) в качестве молекулярной мишени производных хлорохина (2) и запуск новых ингибиторов PPT1 в клиническую практику В исследованиях (3, 4) необходимо понять механизм, с помощью которого лизосомальные ингибиторы вызывают гибель клеток, и влияние лизосомального ингибирования на опухолевый иммунитет. Канонический механизм гибели лизосомальных клеток, описанный для HCQ, включает проницаемость лизосомальных мембран (LMP), утечку катепсинов и активацию каспазо-опосредованного апоптоза (5, 6). Ранее мы показали, что лизосомальный ингибитор DC661 проникает в клетки кислого микроокружения опухоли и локализуется в лизосомах более эффективно, чем HCQ (2, 7). DC661 вызывает мощную гибель клеток во многих линиях раковых клеток (2). DC661 связывает и ингибирует PPT1, дезактивирует лизосому и ингибирует аутофагию. DC661 также индуцирует LMP и повышает уровень расщепленной каспазы 3 (2, 7). В последние годы были определены новые механизмы гибели клеток, которые имеют иммуногенные последствия и включают некроптоз, ферроптоз и пироптоз (8). Было показано, что лизосомно-зависимая аутофагия разрушает MHC класса I (9), а также компоненты иммунопротеасомы (10), что позволяет предположить, что ингибирование аутофагии может усиливать процессинг антигена. Однако иммуногенные эффекты ингибирования лизосом и последующей гибели клеток полностью не охарактеризованы. Чтобы восполнить этот пробел в знаниях, мы исследовали влияние DC661 на канонические механизмы гибели клеток, чтобы определить, является ли лизосомальная гибель клеток формой гибели клеток или просто предшественником одного из других установленных механизмов. Мы обнаружили, что HCQ и DC661 индуцировали значительное увеличение лишь небольшого количества белков в протеоме меланомы, и большинство из них были белками, связанными с аутофагией и апоптозом. Ингибиторы запрограммированной гибели клеток (апоптоз, некроптоз, ферроптоз и пироптоз) не уменьшали цитотоксические эффекты после лизосомального повреждения DC661. Лизосомальное перекисное окисление липидов (LLP) является основным фактором LMP-индуцированной гибели клеток, связанной с экспрессией кальретикулина (CALR) на поверхности клеток. Эту форму гибели клеток можно обратить вспять только с помощью антиоксиданта N-ацетилцистеина (NAC). Активность NAC нарушалась за счет ингибирования лизосомального импортера цистеина MFSD12. LLP вызывал иммуногенные фенотипы, способствующие уничтожению, опосредованному Т-клетками. Эти результаты показывают, что лизосомальная гибель клеток является потенциально уникальной формой иммуногенной гибели клеток.

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

Полученные результаты

Лизосомальное ингибирование вызывает значительные изменения в протеоме, связанные с аутофагией и апоптозом. Чтобы установить цитотоксические эффекты лизосомальных ингибиторов, мы оценили жизнеспособность клеточных линий меланомы A375P, карциномы толстой кишки RKO и MIA PaCa-2, обработанных вакуолярным ингибитором H+-АТФазы бафиломицином-А1 (1 00 нМ); Ингибиторы PPT1 DC661 (3 мкМ) или HCQ (10 мкМ или 30 мкМ); пальмитатный миметик гексадецилсульфонилфторид (HDSF; 60 мкМ); ингибиторы катепсина пепстатин А (PepA; 10 мкг/мл), E64 (PepA; 10 мкг/мл) или PepA+E64; и гидробромид метилового эфира, разрушающего лизосомальные мембраны Leu-Leu (20 мкМ), в течение 48 часов. Только бафиломицин-А1 и DC661 вызывали значительное снижение жизнеспособности клеток в линиях раковых клеток (рис. 1А и дополнительный рисунок 1А; дополнительный материал доступен в Интернете с этой статьей; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), при этом DC661 продуцирует более глубокое снижение жизнеспособности клеток, чем бафиломицин-А1. Основываясь на этих данных и фармакологических свойствах производных хлорохина, подобных лекарственным средствам, мы сосредоточили наше исследование на производных хлорохина как на инструментах для понимания гибели лизосомальных клеток. Непредвзятый глобальный протеомный анализ был применен к клеткам меланомы A375P, обработанным DC661 (3 мкМ) или менее активным HCQ (10 мкМ или 30 мкМ) в течение 24 часов. Из 4264 белков, определенных количественно с высокой степенью достоверности, только 87 и 55 белков были значительно увеличены при использовании DC661 (3 мкМ) и HCQ (30 мкМ) соответственно; кроме того, 14 и 15 белков были значительно снижены при использовании DC661 (3 мкМ) и HCQ (30 мкМ) соответственно (абсолютное кратное изменение более 2; q <0,05) при использовании DC661 (3 мкМ) или HCQ (30 мкМ) соответственно. , по сравнению с управлением транспортным средством. Более низкая доза HCQ (10 мкМ) не выявила существенных изменений белка по сравнению с контролем носителя. Топ-50 белков, уровень которых значительно увеличился после лечения DC661, в основном были связаны с аутофагией и апоптозом, и аналогичные изменения наблюдались при более высоких дозах HCQ (рис. 1B). По этим причинам мы решили сосредоточить дальнейшие исследования на более мощном DC661. Примерами наиболее крупных изменений белков, связанных с аутофагией и апоптозом, были налогсвязывающий белок 1 (TAX1BP1; увеличение в 15- раз); BCL2-взаимодействующий белок 3 (BNIP3; увеличен в 6- раз); сосед белка 1 гена BRCA1 (NBR1; увеличен в 12- раза); секвестосома-1 (SQSTM1/p62; увеличение в 5- раз); коактиватор ядерного рецептора 4 (NCOA4; увеличен в 3- раз); и LC3B (MAP1LC3B; увеличено в 3- раз). Аполипопротеин B-100 (APOB; увеличение в 66- раз) был получен из фетальной сыворотки теленка и далее не изучался. Иммуноблоттинг подтвердил, что обработка DC661 или более высокими концентрациями HCQ вызывала заметное увеличение экспрессии рецепторов груза аутофагии NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 и NCOA4 в зависимости от дозы и времени (дополнительные рисунки 1, B и C). CRISPR/Cas9 KO PPT1 в клетках A375P фенокопировал эффекты DC661 на эти белки по сравнению с их аналогами WT (дополнительный рисунок 1D). Однако экспрессия рецепторов груза аутофагии и относительное увеличение, вызванное лечением DC661, были разными в зависимости от рака толстой кишки, рака поджелудочной железы и других клеточных линий меланомы, в которых DC661 демонстрирует цитотоксичность (дополнительная фигура 1E). Это предполагает, что сами рецепторы груза аутофагии, хотя и увеличиваются на уровне белка, вряд ли несут ответственность за гибель клеток после лечения DC661. Чтобы подтвердить это, мы сосредоточились на рецепторах груза аутофагии TAX1BP1 и BNIP3, поскольку они обладают известными проапоптотическими эффектами в раковых клетках (рис. 1C). TAX1BP1 является адаптером груза аутофагии (11), а также регулирует апоптоз, индуцированный ингибиторами синтеза белка или агентами, повреждающими ДНК, в раковых клетках (12). Нокдаун TAX1BP1 с помощью миРНК (рис. 1D) не влиял на цитотоксичность, индуцированную DC661-, в краткосрочных (рис. 1E) и долгосрочных анализах жизнеспособности (рис. 1F). Эти результаты продемонстрировали, что TAX1BP1 не играет существенной роли в цитотоксичности, опосредованной DC661-. BNIP3 представляет собой проапоптотический белок, который нарушает биоэнергетику митохондрий и регулирует митофагию (13). Эффективный нокдаун BNIP3 (рис. 1G) не влиял на цитотоксичность, индуцированную DC661- (рис. 1, H и I). Эти результаты показали, что цитотоксические эффекты DC661 не зависят от экспрессии BNIP3. Затем мы изучили влияние истощения клеток канонических генов аутофагии, необходимых для производства аутофагосом, на эффективность DC661 путем нокдауна unc-51, например киназы 1, активирующей аутофагию (ULK1) и гена 7, связанного с аутофагией (ATG7). Эффективный нокдаун ULK1 или ATG7 (дополнительный рисунок 2, A и B) ингибировал аутофагический поток (дополнительный рисунок 2C), но не влиял на цитотоксичность, индуцированную DC661- (рисунок 1, J-M). Эти результаты показали, что отсутствие основного механизма аутофагии не отменяет цитотоксические эффекты DC661. Ингибирование лизосом с помощью DC661 индуцирует множественные пути запрограммированной гибели клеток. Каноническая точка зрения состоит в том, что гибель лизосомальных клеток происходит в результате апоптоза (5). Иммуноблоттинг показал, что обработка DC661 приводила к активации каспаз -3, -7 и -9 и расщеплению PARP-1, подтверждая, что DC661 активировал апоптоз (рис. 2А). Ингибитор панкаспазы Z-VAD-FMK предотвращал активацию каспазы с помощью DC661, но не ингибировал накопление LC3B и p62, демонстрируя, что активация апоптоза и блокада аутофагии разделимы после лизосомального ингибирования (рис. 2B). Блокирование апоптоза с помощью ZVAD-FMK не увеличивало и не ограничивало цитотоксичность DC661, что позволяет предположить, что апоптоз необязателен для гибели лизосомальных клеток (рис. 2, C и D). Цитотоксические эффекты DC661 были сходными в первичных клетках костного мозга с двойной КО Bax/Bak, неспособных подвергаться апоптозу, и клетках WT (рис. 2E). Блокада апоптоза также не влияла на цитотоксичность, индуцированную DC661-, в клетках рака толстой кишки и рака поджелудочной железы (дополнительный рисунок 2, D – F). Поскольку мы обнаружили, что апоптоз необязателен для гибели клеток, индуцированной DC661-, мы исследовали, индуцирует ли DC661 некроптоз, другую форму запрограммированной гибели клеток, регулируемую взаимодействующей с рецептором протеинкиназой (RIPK) и белком, подобным домену киназы смешанного происхождения ( МЛКЛ). Уровни фосфорилированных и активированных форм RIPK и MLKL увеличивались после обработки DC661 с 0,1–1 мкМ (рис. 2F). При концентрации 3 мкМ DC661 наблюдалось отсутствие фосфорилированного RIPK1, но стойкое фосфорилирование MLKL, что позволяет предположить, что при этой более высокой концентрации могут быть задействованы дополнительные формы гибели клеток. Предварительная обработка ингибиторами RIPK1 некростатином-1 или некростатином-1 или ингибитором MLKL некросульфонамидом предотвращала фосфорилирование RIPK1 после обработки DC661 (1 мкМ) в клетках меланомы (рис. 2G), но не смогла спасти DC{{192 }}индуцированная цитотоксичность в клетках меланомы (рис. 2H) или рака толстой кишки или клеток рака поджелудочной железы (дополнительная фигура 2G). Эти данные позволяют предположить, что некроптоз активируется, но не является обязательным для DC661-опосредованной гибели клеток.

Рисунок 1. Ингибирование лизосомальной аутофагии вызывает значительные изменения в белках апоптоза и аутофагии. (А)

Лизосомы являются одним из основных мест хранения железа. Нарушение внутриклеточного метаболизма железа в сочетании со снижением восстановительной способности может вызвать неапоптотическую гибель клеток, известную как ферроптоз. Отличительным признаком ферроптоза является активация простагландин-эндопероксидсинтазы 2 (PTGS2), гомолога 1 регулятора транспорта катионов (CHAC1) и цистеинил-тРНК-синтетазы (CARS) (14). Все три из этих маркеров ферроптоза подвергались положительной регуляции транскрипции под действием DC661 (рис. 3А), что позволяет предположить, что лизосомальное ингибирование индуцирует ферроптоз. DC661 индуцировал сдвиг флуоресценции в клетках A375P, обработанных C11-BODIPY, что указывает на перекисное окисление липидов, характерное для ферроптоза. Этот сдвиг, вызванный DC661-, был значительно обращен вспять в присутствии ингибиторов ферроптоза ферростатина-1 или липрокстатина-1, вводимых в эффективной концентрации (рисунок 3B и дополнительный рисунок 3A), что дополнительно указывает на то, что DC661 индуцированный ферроптоз. Однако ингибирование ферроптоза не устраняло цитотоксичность, связанную с DC661 (рис. 3, C и D). Совместное лечение раковых клеток хелатором железа дефероксамином (DFO) и DC661 не устраняло цитотоксичность DC661 (рис. 3E). Лечение ферростатин-1, губрокстатином-1 или DFO не спасло DC661 от ингибирования краткосрочной жизнеспособности или долгосрочного клоногенного роста в клетках меланомы, толстой кишки и раковых клеток поджелудочной железы (дополнительный рисунок 3, B). –E и дополнительный рисунок 4, A–D). Эти данные показывают, что ферроптоз активируется, но не требуется для гибели клеток, опосредованной DC661-. Пироптоз — это форма запрограммированной гибели клеток, связанная с воспалительной реакцией, которая включает активацию каспаз, обрабатывающих гастрин (GSDM), что приводит к образованию пор на плазматической мембране и последующему высвобождению связанных с повреждением молекулярных структур, таких как высокоподвижные молекулы. групповой ящик 1 (HMGB1). Обработка DC661 в нескольких клеточных линиях меланомы (A375P, A375, WM35 и WM793) приводила к активации каспазы-инициатора-8 и -9 и каспазы-исполнителя-7, типичной для пироптоза, и вызывала расщепление полноразмерного GSDME, аналогичное по степени известному индуктору пироптоза PLX4720 и PD0325901 (дополнительная фигура 5A). DC661 вызывал более сильное внеклеточное высвобождение HMGB1, чем известный индуктор пироптоза, BRAF, и ингибирование MEK в 1% FBS (15), что отражает функциональное последствие активированного пироптоза. Затем мы проверили, улучшит ли ингибирование пироптоза с помощью GSDME KO цитотоксические эффекты DC661. Обработка DC661 вызывала накопление LC3II и SQSTM1/p62 и активацию каспаз, но высвобождение HMGB1 почти полностью прекращалось в клетках человека GSDME-KO WM35, демонстрируя, что функциональное последствие ингибирования пироптоза было достигнуто (рис. 3F). Однако обработка DC661 вызывала одинаковую цитотоксичность в YUMM1.7 WT, пустом векторе (EV) и клетках Gsdme KO1 и KO2 как в условиях 10%, так и в 1% FBS (рисунок 3G и дополнительный рисунок 5B). Одним из распространенных результатов множественных форм гибели клеток является выброс ЛДГ. DC661 вызывал значительное увеличение высвобождения ЛДГ, и это нельзя было обратить вспять путем ингибирования апоптоза, некроптоза или ферроптоза (дополнительная фигура 5C). Эти результаты показали, что DC661 индуцирует несколько способов гибели клеток, включая апоптоз и пироптоз, а также некроптоз и ферроптоз, но ни один из этих способов гибели клеток не требуется для гибели клеток, индуцированной DC661-. Ингибирование катепсина или хелатирование кальция не предотвращают гибель клеток в результате проницаемости лизосомальных мембран. Продемонстрировав, что активация каспазы (которая необходима для апоптоза и пироптоза) необязательна для гибели клеток, индуцированной DC661-, мы предположили, что высвобождение катепсина из лизосом может вызвать каспазозависимую гибель клеток. Химическое (DC661) или генетическое (миРНК PPT1 [siPPT1]) ингибирование PPT1 приводило к проницаемости лизосомальных мембран (LMP), в то время как HDSF, менее мощный необратимый ингибитор PPT1, который быстро истощается в клеточной культуре, не мог индуцировать LMP, как показало измерение. галектин-3-положительными точками (рис. 4А). LMP приводит к высвобождению катепсинов и другого содержимого лизосом в цитоплазму и считается ключевым проксимальным признаком гибели клеток на основе лизосом. LMP, индуцированный DC661, был связан со значительным увеличением активности цитоплазматического катепсина-L, которая значительно блокировалась ингибитором цистеиновой протеазы E64 (рис. 4B). Предыдущие сообщения предположили, что высвобождение катепсина из разрушенных лизосом способствует активации каспаз, что приводит к апоптотической гибели клеток (16–18). Полное ингибирование катепсина не предотвращало расщепление каспаз (рис. 4C) и не устраняло цитотоксичность, индуцированную DC661-, в краткосрочных и долгосрочных анализах жизнеспособности при меланоме (рис. 4, D и E), раке толстой кишки и поджелудочной железы. раковые клетки (дополнительный рисунок 6, A – C). Эти результаты противоречат каноническому представлению о гибели лизосомальных клеток, обусловленной катепсин-опосредованной гибелью клеток. Помимо высвобождения катепсина из лизосом с повышенной проницаемостью, высвобождение кальция из лизосом связано с клеточной дисфункцией при нарушении PPT1 (19). Обработка DC661 привела к значительному высвобождению кальция, которое было устранено предварительной обработкой постоянным хелатором кальция (Ca2+), BAPTA-AM. (Рисунок 4F). Примечательно, что BAPTA-AM не предотвращал DC661-индуцированную LMP (рис. 4G) или расщепление каспаз (дополнительные рисунки 6, D и E) и, что наиболее важно, не уменьшал DC661-индуцированную цитотоксичность (рис. 4G). Рисунок 4H). Эти результаты также наблюдались в клеточных линиях RKO и MIA PaCa-2, в которых не наблюдалось существенных различий в значениях IC50 с BAPTA-AM и DC661 (дополнительный рисунок 6F), что позволяет предположить, что гибель клеток, связанная с LMP, не зависит от кальция и катепсинов.

Рисунок 2. Апоптоз и некроптоз, индуцированные DC661-. (А)

Рисунок 3. Ферроптоз и пироптоз, индуцированные DC661-. (А)

ТОО управляет ЛМП. Установив, что ингибиторы основных путей гибели клеток (апоптоз, некроптоз, ферроптоз и пироптоз), катепсины (PepA и E64) и хелаторы ионов (BAPTA-AM [Ca2+] и DFO [Fe{{3}) }]) не предотвращал гибель клеток под действием DC661, и, обнаружив доказательства перекисного окисления липидов под действием C-11-BODIPY, мы провели глобальный анализ липидома через 2 и 4 часа после обработки DC661. DC661 индуцировал раннее и устойчивое увеличение в 3- до 10- раз каждого класса лизофосфолипидов (рис. 5А). Напротив, минимальные изменения или их отсутствие наблюдались в классах фосфолипидов, включая фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин и фосфатидную кислоту (дополнительная фигура 7A). Виды лизофосфолипидов могут генерироваться АФК, которые окисляют цепь насыщенных жирных кислот, которая затем отщепляется фосфолипазами (20). Чтобы определить, могут ли антиоксиданты предотвратить повреждение липидов, опосредованное АФК, мы исследовали цитотоксичность, индуцированную DC661-, в присутствии поглотителя пан-АФК N-ацетилцистеина (NAC) (21, 22) и предполагаемых ингибиторов перекисного окисления липидов Тролокса (23). ) и витамин С (аскорбиновая кислота) (24, 25). В отличие от любого другого протестированного до сих пор агента, совместное лечение с NAC устраняло цитотоксичность, связанную с DC661-, в нескольких клеточных линиях (рис. 5B и дополнительная рис. 7B). Долгосрочные анализы КОЕ показали, что NAC, в отличие от всех исследованных здесь ингибиторов гибели клеток, хелаторов ионов и ингибиторов катепсина, предотвращает цитотоксические эффекты DC661 в клетках A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 и MC38 ( Рисунок 5C и дополнительный рисунок 7C). Интересно, что тролокс и витамин С не устраняли цитотоксичность DC661 при меланоме человека, колоректальном раке, клетках рака поджелудочной железы, меланоме мышей и клетках колоректального рака (рис. 5D и дополнительный рисунок 7, D–H). Это несоответствие побудило нас проверить, влияют ли NAC, Тролокс и витамин С на LMP. Наши результаты показали, что NAC был единственным антиоксидантом, который значительно снижал LMP, индуцированный DC661- (рис. 5E). Мы предположили, что LLP стимулирует выработку LMP с помощью DC661, что может быть обращено вспять NAC, но не Тролоксом и витамином C. Для изучения процесса LLP мы использовали флуоресцентный зонд FOAM-LPO (26), который специфически локализуется в лизосоме и производит спектральный сдвиг от 586 до 512 нм (от красного к зеленому) при воздействии пероксидов липидов. Мы обнаружили, что DC661 индуцировал LLP по сравнению с контролем (рис. 5F). NAC снижал перекисное окисление липидов в лизосомах клеток меланомы, обработанных DC661-, тогда как тролокс и витамин С не смогли снизить LLP (рис. 5F). NAC, Тролокс и витамин С сами по себе не оказали существенного влияния на перекисное окисление липидов. Нокдаун PPT1 (дополнительная фигура 8A) или обработка высокими концентрациями HCQ (дополнительная фигура 8B) также индуцировали LMP, которую можно было обратить вспять с помощью NAC, тогда как химическое ингибирование ULK1 не индуцировало LMP (дополнительная фигура 8C). Важно отметить, что нокдаун siPPT1 также включал LLP, которую можно было обратить вспять с помощью NAC (дополнительная фигура 8D). Эти результаты показали, что ингибирование PPT1 индуцирует LLP, которое можно спасти с помощью NAC, и, вероятно, является причиной LMP, индуцированной ингибированием PPT1-. Кроме того, эти данные свидетельствуют о том, что LLP имеет решающее значение для гибели лизосомальных клеток.

Китайская трава цистанхе-противоопухолевое растение

Импорт цистеина в лизосомы с помощью MFSD12 ослабляет гибель лизосомальных клеток. Из трех ингибиторов перекисного окисления липидов только NAC предотвращал НЛП. Недавний отчет показал, что домен суперсемейства основных фасилитаторов, содержащий 12 (MFSD12), является важным компонентом импортера цистеина для лизосом и меланосом (27). Мы пришли к выводу, что NAC или его метаболит цистеин транспортируется в лизосому через MFSD12, где цистеин окисляется до дисульфида цистеина. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сравнили способность NAC снижать цитотоксичность DC661 в клетках siNT и siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Наши результаты показали, что NAC спасал DC661-индуцированную LMP в клетках siNT, но не спасал LMP в клетках siMFSD12 (рис. 6A). NAC уменьшал LLP клеток siNT-A375P, обработанных DC661-, но не клеток siMFSD12. Клетки siMFSD12, обработанные ДМСО или NAC, имели повышенную базальную LLP (рис. 6B) по сравнению с клетками siNT. В то время как NAC спасал цитотоксичность DC661 в клетках siNT, способность NAC снижать цитотоксичность DC661 была полностью отменена в клетках siMSFD12 (рис. 6C). Это показало, что нокдаун MFSD12 блокирует цитопротекторные эффекты NAC против DC661. NAC деацетилируется ацилазой в цитозоле (28). Чтобы определить, вызывает ли обработка NAC накопление цистеина или цистина внутри лизосом, мы использовали метод лизосомальной иммунопреципитации (Lyso-IP) (29) для очистки лизосом от клеток A375P, обработанных ДМСО и NAC (рис. 6D и дополнительный рисунок 9A), и выполнили целевая метаболомика для количественного определения NAC и связанных с ним метаболитов. Как и ожидалось, NAC был обнаружен в обработанном NAC лизате цельных клеток и связанных с ним несвязанных фракциях. Уровни L-цистеина были существенно повышены в лизосомах, обработанных NAC. L-цистин обнаруживался только в лизосомах, обработанных NAC. Поразительно, но мы не обнаружили значительного увеличения уровня глутатиона (сниженного) в группах, получавших NAC (рис. 6E); это было удивительно, поскольку общепринято считать, что лечение NAC вызывает увеличение выработки глутатиона, корректируя окислительно-восстановительный баланс. Эти результаты позволяют предположить, что цистеин, импортируемый в лизосомы через импортер MFSD12, имеет решающее значение для спасения LLP, LMP и гибели лизосомальных клеток. LLP иммуногенен. Некоторые формы регулируемой гибели клеток, индуцированные DC661 (пироптоз, некроптоз, ферроптоз), идентифицированы как иммуногенные. Ранее иммуногенная гибель клеток была описана для химиотерапевтических препаратов на основании характерных особенностей, которые включают проявление молекулярных паттернов, связанных с повреждением, включая экспрессию CALR на клеточной поверхности и высвобождение белка HMGB1 и аденозинтрифосфата (АТФ) (30). CALR действует как сигнал «съешь меня» при воздействии на поверхность клеток во время клеточного стресса. Внеклеточное высвобождение HMGB1 и АТФ действует как сигнал «найди меня», распознаваемый фагоцитирующими клетками. Мы сравнили две модели: клетки B16F10, которые в моделях сингенных опухолей почти полностью лишены инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, и клетки MC38, которые в моделях сингенных опухолей действительно содержат инфильтрирующие опухоль лимфоциты. Во-первых, мы продемонстрировали, что обработка DC661 или siPpt1 значительно индуцирует поверхностную экспрессию CALR, которую можно полностью отменить при одновременной обработке NAC в клетках MC38 (рис. 7, A и B). Аналогичные результаты наблюдались в клетках B16F10 (рис. 7C). Ингибиторы основных путей гибели клеток (апоптоз, некроптоз, ферроптоз и пироптоз) не смогли предотвратить поверхностную экспрессию CALR (рис. 7D). Чтобы определить, вызвана ли гибель иммуногенных клеток, индуцированная DC661, активацией MHC класса I, клетки B16F10 и MC38 обрабатывали DC661 (3 мкМ) или ДМСО в течение 24 часов. Мы обнаружили, что лечение DC661 не увеличивало экспрессию MHC класса I и активацию иммунопротеасом (рис. 7E и дополнительные рисунки 9, B и C).

Рисунок 4. Ингибирование катепсина или хелатирование кальция не предотвращают гибель клеток, вызванную DC661-. (А)

Чтобы понять влияние ингибирования аутофагии на праймирование Т-клеток, мы провели эксперимент по праймированию и совместному культивированию in vitro с использованием спленоцитов C57BL6/J, как описано ранее (31). Для прайминга мы подвергали спленоциты воздействию клеток B16F10 или MC38, обработанных DC661- или ДМСО. Затем эти примированные спленоциты культивировали с живыми клетками B16F10 или MC38 и измеряли цитотоксичность (рис. 8А). Спленоциты, примированные клетками B16F10, обработанными DC661-, вызывали значительное увеличение IFN- по сравнению со спленоцитами, подвергнутыми воздействию клеток B16F10, обработанных ДМСО. Уничтожение пролиферирующих клеток B16F10, опосредованное праймированными Т-клетками, было значительно увеличено в спленоцитах, примированных DC661-, по сравнению со спленоцитами, примированными ДМСО (рис. 8, B и C). Клетки MC38, обработанные DC661, продуцировали даже большую цитотоксичность IFN и праймированных Т-клеток по сравнению с клетками B16F10 (рис. 8, D и E). Совместное лечение NAC с DC661 позволило полностью отменить высвобождение IFN из спленоцитов и притупить цитотоксичность примированных Т-клеток (рис. 8, F и G). Нокдаун кальретикулина с помощью siCalr в клетках MC38 (дополнительная фигура 9D) аннулировал эффективность праймирования лечения DC661 и значительно снижал цитотоксичность примированных Т-клеток (рисунок 8, H и I). В совокупности эти данные подтверждают механистическую роль усиления регуляции CALR, связанной с LLP, в стимулировании противоопухолевого Т-клеточного иммунитета. Затем мы расширили эти результаты in vitro на исследование противоопухолевой вакцинации in vivo на моделях иммунокомпетентных и иммунодефицитных мышей. Для этого анализа in vitro замораживанию-оттаиванию или обработанным DC661- клеткам B16F10 или MC38 вводили подкожно в левый фланг, чтобы защитить иммунокомпетентных мышей C57BL/6 или NOD/SCID от повторного заражения живыми опухолевыми клетками того же типа, инъецированными. 7 дней спустя на правом фланге (рис. 9А). Обработанные DC661-клетки B16F10 не смогли предотвратить отторжение опухоли, несмотря на анализы in vitro, что позволяет предположить, что DC661 индуцировал иммуногенную гибель клеток (рис. 9B и дополнительная фигура 9E). Напротив, инокуляция одного фланга клетками MC38, обработанными DC661-, способствовала полному отторжению живых клеток MC38, имплантированных на противоположный фланг (рис. 9C и дополнительная фигура 9F). Чтобы определить, имеет ли адаптивный иммунитет решающее значение для эффекта вакцины, который DC661, по-видимому, оказывает на опухоли MC38, мы повторили эксперимент на мышах NOD/SCID. Поразительно, мы обнаружили, что клетки MC38, обработанные DC661-, не индуцировали отторжение опухолей повторного заражения у иммунодефицитных мышей NOD/SCID (рис. 9D и дополнительная фигура 9G), что указывает на то, что для наблюдаемого эффекта вакцины необходим адаптивный иммунитет. Чтобы проверить надежность этого открытия, мы выбрали другую хорошо известную линию иммуногенных раковых клеток мыши, CT26, и провели эксперимент по вакцинации, как указано выше. Как и ожидалось, имплантация клеток CT26, обработанных DC661-, в один бок мыши давала вакциноподобный эффект и предотвращала рост живых клеток CT26, имплантированных на другой бок (рис. 9E и дополнительная фигура 9H). Наши результаты показали, что LLP, индуцированная DC661-, имеет решающее значение для LMP-опосредованной иммуногенной гибели клеток, которая обращается за счет импорта цистеина в лизосому с помощью лизосомального транспортера MFSD12 (рис. 9F).

Обсуждение

Ингибирование лизосом представляется многообещающим терапевтическим подходом в доклинических исследованиях, а клинические испытания HCQ дали обнадеживающие, но неоднозначные результаты (1, 32). PPT1 является молекулярной мишенью HCQ, а более мощные ингибиторы PPT1, такие как DC661 (2) и GNS561 (3), индуцируют LMP-опосредованную гибель клеток in vitro. Точный механизм гибели лизосомальных клеток и его роль в иммуногенности опухоли полностью не выяснены. Противоопухолевый иммунитет усиливается, когда ингибирование аутофагии сочетается с иммунотерапией (9, 10, 31). Предлагаемые механизмы клеточной иммуногенности после ингибирования аутофагии включают MHC класса I и активацию иммунопротеасом, которые поддерживают улучшенную обработку и презентацию антигена. Кроме того, потеря белков аутофагии или ингибирование аутофагии хлорохином усиливали реакцию CD8+ Т-клеток за счет увеличения поверхностных уровней MHC класса I в дендритных клетках (33). Ранее мы показали, что системное ингибирование PPT1 может реполяризовать макрофаги с фенотипа M2 на M1. Ингибиторы PPT1 могут повышать уровни STING, что приводит к высвобождению интерферона и усилению опосредованного Т-клетками уничтожения на моделях меланомы (31). Здесь мы продемонстрировали, что LLP сама по себе вызывает присущую опухолевым клеткам иммуногенную форму клеточной гибели. Мы обнаружили, что лизосомальное ингибирование вызывает очень мало изменений белков в раковых клетках, а наиболее значительно повышенные уровни белков включают рецепторы груза аутофагии и регуляторы апоптоза. Наш подход, направленный на различные функции некоторых из этих генов, продемонстрировал, что белки, индуцированные лекарствами, вряд ли являются основными регуляторами гибели клеток. Генетическое ингибирование ULK1 или ATG7 также не спасло цитотоксичность DC661. Мы продемонстрировали, что лизосомальное ингибирование активирует множественные формы запрограммированной гибели клеток, включая апоптоз, некроптоз, ферроптоз и пироптоз, но каждая из них необязательна для цитотоксичности, индуцированной лекарственными средствами. Следует отметить, что механизмы запрограммированной гибели клеток могут перекрываться, и совместное нацеливание на множественные механизмы гибели клеток может обеспечить цитозащиту от гибели клеток после проницаемости лизосомальных мембран. Наша работа исключила катепсин- и кальций-зависимые механизмы гибели лизосомальных клеток и подчеркнула важность LLP как критического детерминанта гибели клеток. Мы обнаружили доказательства LLP, которое было обратимым под действием антиоксиданта, транспортируемого в лизосому, NAC, и имело решающее значение для проницаемости лизосомальных мембран и цитотоксичности. NAC был единственным агентом, способным смягчить или обратить вспять гибель клеток, вызванную DC661-, и эта способность зависела от присутствия лизосомального переносчика цистеина MFSD12. Отсутствие проникновения в лизосомы, вероятно, является причиной того, что другие предполагаемые ингибиторы перекисного окисления липидов, тролокс и витамин С, не смогли предотвратить цитотоксичность DC661. NAC превращается в цистеин, который импортируется в лизосомы и окисляется до дисульфидной формы цистина. Цистин экспортируется в цитозоль с помощью другого лизосомального переносчика, цистиноза, где он восстанавливается до цистеина, который ремобилизует внутренние источники питательных веществ, реактивирует мишень рапамицинового комплекса 1 и способствует аутофагии (34). Этот окислительно-восстановительный цикл цистеина в цистин (лизосомы) и обратно в цистеин (цитозоль) может быть возможным спасательным механизмом NAC против цитотоксичности DC661 или более общего лизосомального повреждения при других заболеваниях, где NAC доказал свою терапевтическую полезность (35). . NAC не только обращал вспять DC661-индуцированные LLP и LMP, но также и поверхностную экспрессию иммуногенного маркера гибели клеток кальретикулина. Экспрессия белка CALR на клеточной поверхности была необходима для усиленной цитотоксичности, опосредованной Т-клетками, индуцированной DC661-примированными спленоцитами, демонстрируя, что лизосомальное ингибирование приводит к специфической форме внутренней клеточной иммуногенности.

Хотя предыдущие исследования показали, что лизосомальное ингибирование может усилить противоопухолевую активность ингибирования иммунных контрольных точек при установленных опухолях боковых частей (9, 31), наше исследование является первым, насколько нам известно, продемонстрировавшим вакциноподобный эффект для опухолей MC38, но не для опухолей B16 в опухолевые клетки, предварительно обработанные DC661 перед имплантацией. Это демонстрирует, что гибель лизосомальных клеток может индуцировать присущую клеткам иммуногенность, но этих изменений самих по себе недостаточно для того, чтобы обратить «иммунно-холодное» микроокружение опухоли в «иммунно-горячее» опухолевое микроокружение. Наши предыдущие исследования на моделях микроокружения опухоли «иммунного холода» B16 и BRafCA PtenloxP Tyr: генно-инженерные мышиные модели CreERT2 (31) продемонстрировали, что системное лизосомальное ингибирование оказывает воздействие на опухолеассоциированные макрофаги и супрессорные клетки, полученные из миелоидных клеток, которые были достаточны для усиления эффективность иммунотерапии. Возможно, присущая клеткам иммуногенность также играет роль в этих иммунных холодовых опухолях, которые становятся более чувствительными к ИКД после лизосомального ингибирования. Вакциноподобный эффект лизосомального ингибирования, наблюдаемый в контролируемой лабораторной среде, может или не может быть применим в клинике, но он может объяснить, почему у некоторых пациентов, получавших дабрафениб, траметиниб и HCQ при ранее леченной меланоме с мутацией BRAF, наблюдалась такая глубокая и продолжительная меланома с мутацией BRAF. ответ на этот режим (32). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять, как ингибирование PPT1 вызывает лизосомальные АФК и перекисное окисление липидов. PPT1-зависимая регуляция V-АТФазы и лизосомального закисления не является достаточным объяснением, поскольку бафиломицин ингибирует лизосомальное закисление, но не продуцирует LMP (данные не показаны). Последствия этих результатов позволяют предположить, что лизосомальные ингибиторы, которые повышают внутреннюю иммуногенность опухолевых клеток, могут рационально сочетаться с терапией, усиливающей активацию Т-клеток или инфильтрацию в микроокружение опухоли, что потенциально дает синергетический эффект.

Рисунок 5. N-ацетилцистеин предотвращает гибель клеток, вызванную DC661-. (А)

Методы

Культура клеток. Человек A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) и мышиные клеточные линии B16F10 (CRL-6475) были приобретены у ATCC. Человеческие линии A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 и мышиные YUMM1.7 (WT, Gsdme EV и Gsdme KO1 и KO2) были получены собственными силами. Мышиные клетки MC38 и CT26 были предоставлены Энди Минном из Пенсильванского университета. FL5.12 и IL-3-зависимые Bax-/-Bak-/- (Bax/Bak DKO) первичные клетки костного мозга были получены от Кэтрин Э. Веллен, Университет Пенсильвании. Линия клеток Panc-1 человека (CRL-1469, ATCC) была предоставлена ​​Беном З. Стэнгером, Университет Пенсильвании. Мышиная клеточная линия YUMMER 1.7 была получена от Сяовея (Джорджа) Сюй, Пенсильванский университет. Все клеточные линии тестировались на наличие микоплазмы два раза в год на основных объектах Пенсильванского университета и аутентифицировались с использованием дактилоскопии коротких тандемных повторов в центре геномики Института Вистар. Клеточные линии A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 и Bax/Bak DKO культивировали в RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Клеточные линии A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 и MC38 культивировали в DMEM (Invitrogen, 11995); и клетки YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV и Gsdme KO1 и KO2) (15) культивировали в DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). В культуральную среду добавляли 10% фетальную бычью сыворотку (12306C, MilliporeSigma) и 1× антимикотический раствор антибиотика (Gibco, 15140-122). Клеточные линии FL5.12 и Bax/Bak DKO поддерживали в полной среде RPMI с добавлением 50 мкМ -меркаптоэтанола (Life Technologies, 21985-023), 10 мМ HEPES (H3537, MilliporeSigma), а также 0,35 нг/мл и 3,5 нг. /мл IL-3 соответственно. Клеточные линии YUMMER1.7 и YUMM1.7 (WT, Gsdme EV и Gsdme KO) поддерживали в полной среде с добавлением 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Клетки WM35 и WM793 культивировали в среде MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), содержащей 10% FBS в 1× среде Лейбовица L-15 (Corning, 10-045-CV), 7,5% мас./об. бикарбоната натрия ( Corning, 25-035-CI), 1× антимикотический раствор антибиотика (Gibco, 15140-122) и 5 ​​мкг/мл инсулина (MilliporeSigma, I0516). Клетки выращивали при 37 градусах в присутствии 5% CO2. Химикаты и реагенты. Закупленные химикаты включали сульфат HCQ (Spectrum Chemicals, 747-36-4) и DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) использовали для окрашивания клеток на кальций в соответствии с инструкциями производителя. Список антител и ингибиторов представлен в дополнительной таблице 1 и дополнительной таблице 2.

Рисунок 6. NAC меняет LLP в зависимости от MFSD12-способом. (А – С)

Экстракция и расщепление белка для жидкостной хроматографии и тандемного масс-спектрометрического анализа для протеомики. {{0}}.7 × 106 клеток меланомы A375P культивировали в культуральных чашках диаметром 60 мм. Клетки обрабатывали ДМСО (контроль), DC661 (3 мкМ), HCQ (10 мкМ) или HCQ (3{{70}} мкМ) в течение 24 часов при концентрации приблизительно 5{{ 112}}% слияния. Замороженные клеточные осадки лизировали 50 мМ Трис, pH 7,4, 1% SDS, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,15 мМ ФМСФ, 1 мкг/мл пепстатина, и 1 мкг/мл лейпептина. Осветленные лизаты (10 мкг каждый) подвергали электрофорезу на расстоянии 0,5 см в бис-трис-гель с последующей фиксацией и окрашиванием коллоидным кумасси. Каждую дорожку геля размером 0,5 см вырезали, окрашивали, восстанавливали трис(2-карбоксиэтил)фосфином, алкилировали иодацетамидом и расщепляли трипсином, как описано ранее (36). Гидролизаты (1 мкг) анализировали методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) на масс-спектрометре Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) в сочетании с nanoAQUITY UPLC (Waters). Аналитическое разделение проводили на колонке Peptide BEH C18 размером 1,7 мкм × 250 мм (Waters, 186003546) с использованием 245-минутного градиента с 0,1% муравьиной кислоты в воде (подвижная фаза A) и ацетонитриле (подвижная фаза B) следующим образом. : 5%–30% B в течение 225 минут, 30–80% B в течение 5 минут, 15-минуту удерживать 80 % B и вернуться к исходным условиям. Полные спектры МС были получены с разрешением 70,000, диапазоном сканирования 400–2,000 m/z, целевой автоматической регулировкой усиления 3 × 106 ионов и максимальным временем инжекции 3 × 106 ионов. 50 миллисекунд. Зависимые от данных спектры MS2 были получены для 20 наиболее распространенных ионов с разрешением 17 500, шириной изоляции 1,5 m/z, целевой автоматической регулировкой усиления 5 × 104 ионов и максимальным временем инжекции 50 миллисекунд. Сопоставление пептидов было установлено как предпочтительное, а неназначенные и однозарядные ионы были отклонены (37). Необработанные данные МС были проанализированы с использованием MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) с базой данных последовательностей человека Uniprot (доступ 10 октября 2019 г.) и общей базой данных примесей, включая трипсин, кератины, бычьи белки, и микоплазма (38). В поиске использовали специфичность триптического пептида с максимум двумя пропущенными расщеплениями, фиксированную модификацию цистеина (карбамидометилирование) и переменное окисление метионина или N-концевое ацетилирование (39). Для пептидов и белков использовали пороговое значение FDR 1%. Включено совпадение между прогонами; количество белков определяли с помощью количественного анализа без меток (40). Статистический анализ проводился с использованием Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Белки должны были быть идентифицированы как минимум по 3 уникальным пептидам и иметь 3 действительных значения (отличное от нуля количественное определение) в пределах группы образцов, а примеси и обратные белки были отфильтрованы из набора данных. Отсутствующие значения были вменены из нормального распределения. Парные сравнения между условиями выполнялись на уровне белка с использованием 2-хвостового t-критерия Стьюдента с FDR на основе перестановок с s0=0.1 и 250 рандомизациями. Значительные изменения определялись как FDR менее 5% и абсолютное кратное изменение более 1,5 или 2,0, как указано. Лизо-ИП. Клетки A375P были инфицированы лентивирусом pLJC5-Tmem192-3xHA и отобраны с использованием пуромицина в концентрации 1 мг/мл (MilliporeSigma, P4512). Приблизительно 3 × 106 клеток A375P, меченных НА, обрабатывали либо 10 мМ NAC, либо контрольным водным носителем в течение 24 часов в ранее описанных условиях культивирования. После обработки клетки промывали PBS, собирали в 0,5 мл холодного KPBS и осторожно гомогенизировали, используя 20 движений в гомогенизаторе Dounce объемом 2 мл. Около 2,5% гомогената оставляли для анализа цельноклеточного лизата, а оставшуюся часть центрифугировали при 3,000g в течение 2 минут при 4 градусах для удаления остатков клеточных мембран. Гомогенатный супернатант затем переносили в чистую пробирку емкостью 1,5 мл и инкубировали с 50 мкл гранулами анти-HA (Pierce, 88836) или гранулами анти-DDK/Flag (OriGene, TA150042) в течение 15 минут при 4 градусах. Затем образцы осаждали, помещая пробирки на DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) и осторожно встряхивая в течение 2 минут при комнатной температуре. Супернатант оставляли для анализа несвязавшейся фракции. IP промывали 3 раза KPBS, содержащим 8 мМ CaCl2. Lyso-IP экстрагировали 80% MeOH для метаболомического анализа. Экстракция липидов и анализ с использованием ЖХ-МС/МС для глобального липидома. Клетки меланомы А375Р высевали в чашки диаметром 60 мм по 0,7 × 106 клеток на чашку. Когда клетки достигали примерно 50% слияния, их обрабатывали ДМСО (контроль), DC661 (3 мкМ) или HCQ (30 мкМ) в течение 24 часов. Клетки промывали 2 раза HBSS, соскабливали в ледяной метанол и переносили в стеклянные пробирки для экстракции липидов смесью хлороформ/метанол/0,88% NaCl (2:1:1), содержащих внутренний стандарт липидов EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Образцы перемешивали на встряхивании, а затем обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 5 минут на льду. После центрифугирования при 500 g в течение 15 минут при 40 градусах нижнюю фазу перенесли в другую стеклянную пробирку. Верхнюю фазу реэкстрагировали с использованием синтетической нижней фазы. После обработки ультразвуком и центрифугирования нижнюю фазу объединяли с первым сбором нижней фазы. Образцы сушили в атмосфере азота, ресуспендировали в смеси 10% хлороформа/90% метанола и переносили в стеклянные флаконы LTQ. Образцы липидов анализировали на масс-спектрометре Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X и системе UHPLC Vanquish Horizon. Для аналитического разделения использовали колонку Accucore C30 (2,1 мм × 150 мм, Thermo Fisher Scientific) с соотношением ацетонитрил/вода 50:50 и изопропанол/ацетонитрил/вода 88:10:2, каждая из которых содержала 5 мМ формиата аммония и 0,1% муравьиной кислоты. Данные ЖХ-МС/МС получали отдельно в положительной и отрицательной полярностях со следующими параметрами прибора: сканирование MS1 120, 000 разрешение; зависимый от данных MS2 по 20 наиболее распространенным ионам с разрешением 15,000; ширина изоляции 0,4 м/з; и ступенчато нормализованная энергия столкновения 20:30:40 (43).

Рисунок 7. N-ацетилцистеин предотвращает DC661-индуцированную поверхностную экспрессию кальретикулина. (ОБЪЯВЛЕНИЕ)

Липиды идентифицировали и количественно определяли с использованием LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Идентифицированные виды липидов были отфильтрованы по ожидаемым аддуктам и степени идентификации в зависимости от класса. Площади пиков были нормализованы в соответствии со стандартами EquiSPLASH для поддерживаемых классов и дополнительно нормализованы на основе общей площади для каждого образца для поправки на изменение количества клеток. Статистический анализ проводился на основе лог-преобразованных данных с использованием Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Экстракция метаболитов и анализ метабалона с использованием ЖХ-МС/МС. Полярные метаболиты экстрагировали из целых клеток, несвязанных с Lyso-IP фракций и связанных с Lyso-IP образцов с использованием 80% метанола и хранили при температуре –8{{30}} градусов до жидкостной хроматографии. –масс-спектрометрический (ЖХ-МС) анализ. Экстракты анализировали методом ЖХ-МС с использованием масс-спектрометра Thermo Scientific Q-Exactive HF-X с зондом HESI II в сочетании с системой УВЭЖХ Thermo Vanquish Horizon. Разделение LC осуществляли с использованием колонки ZIC-HILIC (2,1 мм × 150 мм, размер частиц 5 мкм, EMD Millipore) с защитной колонкой ZIC-HILIC (2,1 мм × 20 мм, EMD Millipore), выдерживаемой при 45 градусах со скоростью потока. 0,2 мл/мин. Хроматографию проводили в кислых условиях для снижения реакционной способности тиоловых групп. Подвижной фазой А была вода, а В — ацетонитрил, обе содержали 0,1% муравьиной кислоты. Градиент ЛК составлял 85% B в течение 2 минут, 85% B до 20% B в течение 15 минут, 20% B до 85% B в течение 0,1 минуты и 85% B в течение 8,9 минут. Автосамплер поддерживали при температуре 4 градуса и вводили 4 мкл каждого образца на анализ. Использовали следующие параметры МС: скорость потока покровного газа – 40 а.е.; расход вспомогательного газа – 10 ед.; расход продувочного газа – 2 а.е.; температура вспомогательного газового нагревателя, 350 градусов; напряжение распыления: 3,75 кВ для положительного режима и 3,5 кВ для отрицательного режима; капиллярная температура 375 градусов; и уровень воронки RF — 40%. Все образцы анализировались методом полной МС с переключением полярности. Полные МС-сканы были получены в диапазоне от 65 до 975 м/з при разрешении 120,000 с автоматической регулировкой усиления, равной 1 × 106 ионов, и максимальным временем ввода 100 миллисекунд. Необработанные данные анализировали с помощью TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Целевые метаболиты идентифицировались по точной массе и времени удерживания в предпочтительной полярности на основе аналитических стандартов. Для обнаружения пиков использовался алгоритм ICIS со сглаживанием 1. Относительную количественную оценку проводили с использованием интегрированной площади пика, и эти значения корректировали до общего количества на образец (определяемого как общая площадь пика). Редактирование PPT1-CRISPR/Cas9. Немишеневые и КО-клетки A375P PPT1- готовили, как описано ранее (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) был подарком Фэн Чжана (плазмида Addgene, 48139). Олигогиды направляющей РНК (IDT) отжигали, фосфорилировали, а затем лигировали с переваренной и дефосфорилированной BbsI плазмидой pX459 в соответствии с протоколами лаборатории Чжана, доступными через Addgene. Лигированные плазмиды трансформировали в клетки Stbl3 (Invitrogen). Секвенирование препаратов плазмид подтвердило наличие желаемых последовательностей направляющей РНК. Клетки A375P трансфицировали с использованием липофектамина 3000 (Invitrogen, L3000015) с последующей селекцией пуромицина. Анализы Surveyor подтвердили редактирование гена PPT1 с помощью CRISPR/Cas9, а нокдаун PPT1 был подтвержден вестерн-блоттингом с антителом PPT1 (Origene). Последовательности олигогидных РНК следующие: нецелевая направляющая РНК вперед (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), нецелевая направляющая РНК обратная (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), направляющая РНК 1 человека вперед (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), обратная направляющая РНК 1 человека PPT1 (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), направляющая РНК PPT1 человека 3 вперед (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) и человеческая направляющая РНК 3 PPT1 назад (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Клоны, выращенные из одиночных клеток, используемые в этой статье, включают следующее: клон C8 представляет собой человеческий гид 1 и клон B5 представляет собой человеческий гид 3. Иммуноблоттинг. Один миллион клеток поместили в чашку диаметром 10 см и обработали на следующий день; клетки собирали соскабливанием. Лизаты цельных клеток готовили с использованием лизирующего буфера SDS. Концентрацию белка измеряли с использованием набора для анализа белка Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30–50 мкг белка использовали для SDS-PAGE и переносили на мембрану из ПВДФ (Bio-Rad, 1620177). Мембрану блокировали с использованием 5% БСА или 5% обезжиренного молока в соответствии с оптимизированными условиями и инкубировали с первичным антителом в течение ночи при температуре 4°С. Мембраны из ПВДФ промывали 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с видоспецифичными вторичными антителами, конъюгированными с HRP. Мембраны впоследствии промывали и проявляли с использованием субстрата Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) и авторадиографических пленок (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Для исследования пироптоза белковые лизаты разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и переносили на мембраны из ПВДФ. После блокирования в 5% BSA мембраны PVDF инкубировали с указанными первичными антителами в течение ночи при 4°С, промывали PBS/Tween и инкубировали со связанными с пероксидазой вторичными антителами. Иммунореактивность определяли с использованием вторичных антител, конъюгированных с HRP (CalBioTech), субстрата хемилюминесценции (Thermo Fisher Scientific) и системы визуализации ChemicDoc MP (Bio-Rad). Для экспериментов с супернатантом клетки культивировали в среде, не содержащей FBS, чтобы избежать искажения SDS-PAGE. Клеточные супернатанты собирали и центрифугировали в течение 10 минут при 500 g и температуре 4 градуса для удаления клеточного дебриса. Полученные супернатанты концентрировали 10× с использованием Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) центрифугированием в течение 30 минут при 4500 g и 4 градусах. Концентраты смешивали с буфером для образцов и анализировали посредством вестерн-блоттинга, как описано выше. Окрашивание белкового геля осуществляли с использованием красителя Понсо красным. Анализ активности LMP и катепсина L. Человеческая плазмида pEGFP-hGal3 была подарком Тамоцу Йошимори (плазмида Addgene, 73080) и использовалась для создания линии A375P-Galectin-3. Был приобретен каркас контрольного плазмидного вектора pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Плазмиды трансфицировали (1 мкг/мл) в клетки A375P с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) в соответствии с протоколом производителя; трансфицированные клетки стабильно отбирали с использованием G418 (Gibco, 10131035). Для LMP было подсчитано в общей сложности 25 A375P-галектин-3 точечно-положительных клеток в нескольких полях изображения. Процент пунктта-положительных клеток подсчитывали в каждом поле отдельно и средний процент рассчитывали для каждой группы. Набор для анализа Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) использовали в соответствии с протоколом производителя. Клетки визуализировали под инвертированным микроскопом Zeiss Axio Observer 7. Необработанную интегральную интенсивность Magic Red рассчитывали с использованием программного обеспечения Fiji - ImageJ (NIH). МТТ (3-[4, 5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид) анализ жизнеспособности клеток. 2000 клеток высевали в трех экземплярах в каждую лунку планшета с 96-лунками и проводили 3-дневные анализы МТТ с использованием набора Cell viability Kit (Roche, 11465007001) в соответствии с протоколом производителя. Предварительную обработку ингибитором проводили в течение 1 часа с последующей совместной обработкой клеток ингибиторами с DC661 или без него. Для расчета IC50 использовали метод нелинейной регрессии (подбор кривой).

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Анализ образования колоний. 2,000 клеток на лунку высевали в планшет с 6-лунками и обрабатывали на следующий день; клетки находились под обработкой в ​​общей сложности 8 дней. Колонии, образовавшиеся в каждой лунке, промывали PBS, фиксировали холодным метанолом при –20 градусах в течение 20 минут и окрашивали 0,5% водным раствором кристаллического фиолетового (V5265; MilliporeSigma).

Анализ исключения красителя трипанового синего. Реакционную смесь для анализа трипанового синего готовили путем смешивания 1 части 0,4% трипанового синего (25- 900-CI, Corning) и 1 части разбавленных образцов клеток. Смесь инкубировали в течение 1 минуты и подсчитывали клетки на Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Рисунок 8. DC661-индуцированная поверхностная экспрессия кальретикулина направляет Т-клетки против опухолевых клеток. (А)

Рисунок 9. Инокуляция клеток, обработанных DC661-, вызывает отторжение опухоли в определенных контекстах. (А)

ПЕНА-ЛПО. LLP изучали с использованием флуоресцентного зонда FOAMLPO. FOAM-LPO синтезировали, как описано ранее (26). Клетки культивировали на 8-луночном планшете μSlide (там же, 80807) и обрабатывали ингибиторами, а также с DC661 или без него. Клетки инкубировали со средой, содержащей FOAM-LPO (1 М), в атмосфере 5% CO2 и 95% воздуха в течение 5 минут при 37 градусах. Клетки дважды промывали средой, а затем клетки наблюдали под микроскопом (инвертированный микроскоп Zeiss Axio Observer 7) для обнаружения смещения флуоресценции от 586 до 512 нм в ответ на LLP. qRT-PCR и праймеры. Клетки A375P (3 × 105) культивировали в чашках диаметром 60 мм и обрабатывали ДМСО или DC661 (3 мкМ) в течение 24 часов. Тотальную РНК выделяли с помощью набора для выделения РНК (QIAGEN, 74134) в соответствии с протоколом производителя. кДНК синтезировали с использованием набора для обратной транскриптазы iScript с 500 нг очищенной РНК согласно протоколу производителя (Thermo Scientific, K1642). Реакцию кПЦР проводили с использованием SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121), содержащей 1 мкл кДНК. Все измерения проводились в трех экземплярах, а BACTIN использовался в качестве внутреннего стандарта для расчетов ΔCT. Анализ экспрессии генов проводился с использованием следующих праймеров: PTGS2/COX-2 прямой (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 обратный (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS прямой (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS обратный (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 прямой (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), обратный CHAC1 (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), прямой BACTIN (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) и обратный BACTIN (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

Трансфекция миРНК. Исследования генетического нокдауна человеческих ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 и MFSD12 были проведены на клеточных линиях A375P. Исследования генетического ингибирования мышиного Ppt1 и кальретикулина проводили на клетках MC38. Нецелевая миРНК (sc{{10}}), ULK1 человека (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), мышиный Ppt1/Cln1 (sc-142398) и кальретикулин /Calregulin (sc-29895) siRNA были приобретены у Santa Cruz Biotechnology. Эти миРНК состоят из пулов из 3–5 миРНК, специфичных для мишени. Проточной цитометрии. Индукцию ферроптоза измеряли с использованием C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Клетки A375P высевали в 6-луночный планшет и обрабатывали ДМСО, ферростатин{{40}} (10 мкМ), губрокстатин-1 (2 мкМ), эластин (5 мкМ). ), DC661 (3 мкМ) или их комбинацию в течение 24 часов. Клетки собирали центрифугированием при 300 g в течение 5 минут. Клетки ресуспендировали в 500 мкл 1X HBSS (Corning, 21-023-CV), содержащем 1 мкМ C11-BODIPY, и инкубировали при 37 градусах в течение 15 минут. Клетки осаждали и ресуспендировали в 500 мкл 1X HBSS, а интенсивность флуоресценции измеряли на цитометре BD LSRII с использованием 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Количественную оценку экспрессии кальретикулина на клеточной поверхности для определения иммуногенной гибели клеток проводили, как описано ранее (45), с помощью проточной цитометрии. Клетки B16F10 или MC38 культивировали и обрабатывали NAC (10 мМ) или DC661 (3 мкМ) в течение 24 часов. Клетки MC38 обрабатывали siPpt1 или siNT в течение 48 часов в присутствии или в отсутствие 10 мМ NAC в течение 24 часов. Клетки окрашивали антителом CALR (Cell Signaling Technology, 12238), вторым антителом козы против кролика Alexa Fluor 647 (Invitrogen) и йодидом пропидия (PI) (Biolegend, 421301). Окрашенные образцы были получены на проточном цитометре BD LSRII с использованием 710/50 Blue и 670/30 Red для улавливания флуоресценции PI и CALR соответственно (установка Flow Core Университета Пенсильвании), а анализ ограничивался CALR-положительными и PI-отрицательными клетками. во избежание ложноположительных событий. Примирование Т-клеток и процент цитотоксичности. Опухолевые клетки B16 или MC38 (5 × 104) культивировали и обрабатывали NAC (10 мМ) или DC661 (1 мкМ или 3 мкМ) соответственно в течение 24 часов. Для генетического ингибирования Calr клетки MC38 обрабатывали миРНК Calr или немишеневой миРНК (siNT) в течение 48 часов с последующей обработкой либо ДМСО, либо 3 мкМ DC661 в течение 24 часов. Затем спленоциты культивировали с DC661 с клетками B16 или MC38 или без них в присутствии IL-2 (5 МЕ/мл) и совместно культивировали в течение 72 часов. Праймирование подтверждали с помощью IFN-ELISA (Biolegend, 430815) супернатанта. Затем примированные спленоциты совместно культивировали со свежекультивированными клетками B16 или MC38 с соотношением мишень-эффектор (B16 или MC38 к спленоцитам) 1:20 и 1:50 для клеток B16 и MC38 соответственно. Высвобождение ЛДГ, связанное с гибелью клеток B16 или MC38, а затем процентную цитотоксичность измеряли в соответствии с протоколом производителя (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Анализы противоопухолевой вакцинации и исследования химиотерапии на известных моделях рака. Самки мышей дикого типа C57BL/6, мышей NOD/SCID и BALB/c в возрасте от шести до восьми недель были получены из лаборатории Джексона. Для экспериментов по противоопухолевой вакцинации клетки WT B16F10, MC38 и CT26 обрабатывали DC661 (3 мкМ) в течение 36 часов в колбах площадью 175 см2. Затем супернатанты и отделенные клетки собирали в пробирку falcon объемом 50 мл. Клетки центрифугировали и промывали ледяным PBS. Для вакцинации 150 мкл клеточной суспензии вводили подкожно в левый бок иммунокомпетентных мышей C57BL/6, иммунодефицитных мышей NOD/SCID (1,8 × 104 клеток B16F10, 1,5 × 106 клеток MC38 на мышь) или сингенных мышей BALB/c (3,0 × 106 клеток CT26 на мышь). Замораживание-оттаивание клеток, ресуспендированных в PBS, вводили в качестве отрицательного контроля. Через неделю в правый бок инъецировали живые раковые клетки того же типа (3 × 104 клеток B16F10, 2 × 105 клеток MC38 или 5 × 105 клеток CT26 на мышь) с равным объемом матригеля (Corning, 354248). вакцинированных мышей. Опухоли измеряли с помощью электронного штангенциркуля, а объем рассчитывали как L × W2 × 0,5. Рост опухоли регулярно контролировали в течение последующих дней, а отсутствие опухолей считали признаком эффективной противоопухолевой вакцинации. Исследования вакцинации DC661-MC38 были повторены на мышах NOD/SCID. Статистика. Статистическую значимость определяли с помощью непарного 2-хвостового t-критерия Стьюдента при сравнении двух групп. Тест 1-способ ANOVA использовался при сравнении более чем двух групп. Нулевая гипотеза была значительно отвергнута, если значение P было меньше 0,05. Данные показаны как среднее значение ± SEM. Одобрение исследования. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, одобренными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Пенсильванского университета.

Китайская трава цистанхе-противоопухолевое растение

Рекомендации

1. Зех Х.Дж. и др. Рандомизированное предоперационное исследование II фазы ингибирования аутофагии высокими дозами гидроксихлорохина и гемцитабина/наб-паклитаксела у пациентов с раком поджелудочной железы. Клин Рак Рез. 2020;26(13):3126–3134.

2. Ребекка В.В. и др. PPT1 способствует росту опухоли и является молекулярной мишенью производных хлорохина при раке. Рак Дисков. 2019;9(2):220–229.

3. Брун С. и др. GNS561, новый ингибитор аутофагии, активный против раковых стволовых клеток при гепатоцеллюлярной карциноме и метастазах колоректального рака в печени. Дж. Рак. 2021;12(18):5432–5438.

4. Брун С. и др. GNS561, ингибитор PPT1 на клинической стадии, эффективен против гепатоцеллюлярной карциномы посредством модуляции лизосомальных функций. Аутофагия. 2022;18(3):678–694.

5. Оберле С. и др. Пермеабилизация лизосомальных мембран и высвобождение катепсина являются Bax/Bak-зависимым, усиливающим событием апоптоза в фибробластах и ​​моноцитах. Гибель клеток. Разница. 2010;17(7):1167–1178.

6. Бойя П., Кремер Г. Пермеабилизация лизосомальных мембран при гибели клеток. Онкоген. 2008;27(50):6434–6451.

7. Ребекка В.В. и др. Единый подход к воздействию на сигнальную роль лизосом в области деградации и роста. Рак Дисков. 2017;7(11):1266–1283.

8. Тан Р. и др. Ферроптоз, некроптоз и пироптоз в противораковом иммунитете. Дж Гематол Онкол. 2020;13(1):110.

9. Ямамото К. и др. Аутофагия способствует иммунному уклонению от рака поджелудочной железы за счет разрушения MHCI. Природа. 2020;581(7806):100–105.

10. Дэн Дж. и др. Ингибирование ULK1 преодолевает нарушение презентации антигена и восстанавливает противоопухолевый иммунитет при мутантном раке легких LKB1. Нат Рак. 2021;2(5):503–514.

11. Лазару М и др. Убиквитинкиназа PINK1 привлекает рецепторы аутофагии для индукции митофагии. Природа. 2015;524(7565):309–314.

12. Цой Ю.Б. и др. TAX1BP1 сдерживает вызванный вирусом апоптоз, способствуя опосредованной зудом деградации митохондриального адаптера MAVS. Мол Клеточная Биол. 2017;37(1):е00422-16.

13. Рикка С. и др. Bnip3 ухудшает биоэнергетику митохондрий и стимулирует митохондриальный обмен. Гибель клеток. Разница. 2011;18(4):721–731.

14. Леу Джи и др. Механистические основы нарушения ферроптоза в клетках, экспрессирующих африканскоцентрический вариант S47 р53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Эркес Д.А. и др. Мутантные ингибиторы BRAF и MEK регулируют иммунное микроокружение опухоли посредством пироптоза. Рак Дисков. 2020;10(2):254–269.

16. Серрано-Пуэбла А., Бойя П. Пермеабилизация лизосомальных мембран при гибели клеток: новые данные и последствия для здоровья и болезней. Энн, Нью-Йоркская академия наук. 2016;1371(1):30–44.

17. Тирусангу П. и др. Аутофагия, индуцированная хинакрином, при раке яичников запускает опосредованную катепсином-L проницаемость лизосомальных/митохондриальных мембран и гибель клеток. Раков (Базель). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC и др. Катепсин-зависимый апоптоз, запускаемый супраоптимальной активацией Т-лимфоцитов: возможный механизм толерантности к высоким дозам. Дж Иммунол. 2004;172(9):5405–5414.

19. Мондал А. и др. Дефицит Ppt1- нарушает регуляцию лизосомального гомеостаза Ca++, способствуя патогенезу на мышиной модели заболевания CLN1. J Наследовать Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Энгель К.М. и др. Фосфолипазы и активные формы кислорода являются производными липидных биомаркеров у здоровых и больных людей и животных – в центре внимания лизофосфатидилхолин. Фронт Физиол. 2021;12:732319.

21. Фу Р и др. Эффективность N-ацетилцистеина в фенотипическом подавлении мышиных моделей болезни Нимана-Пика типа C1. Хум Мол Жене. 2013;22(17):3508–3523.

22. Боз З. и др. N-ацетилцистеин предотвращает индуцированный оланзапином окислительный стресс в нейронах гипоталамуса mHypoA-59. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Харе С. и др. ASS1 и ASL подавляют рост светлоклеточной почечно-клеточной карциномы за счет изменения метаболизма азота. Рак Метаб. 2021;9(1):40.

24. Генготек А и др. Сравнение защитного действия аскорбиновой кислоты на взаимодействие окислительно-восстановительной и эндоканнабиноидной систем in vitro культивированных фибробластов кожи человека, подвергнутых воздействию УФ-излучения и перекиси водорода. Арч Дерматол Рез. 2017;309(4):285–303.

25. Де Раедт Т. и др. Использование уязвимостей раковых клеток для разработки комбинированной терапии опухолей, вызванных Ras. Раковая клетка. 2011;20(3):400–413.

26. Чжан X и др. Мониторинг перекисного окисления липидов в пенистых клетках с помощью лизосомно-нацеливаемого и ратиометрического зонда. Анальная хим. 2015;87(16):8292–8300.

27. Вэй С.Ю. и др. Анализ, основанный на биоинформатике, показывает повышенный уровень MFSD12 как ключевого промотора клеточной пролиферации и потенциальной терапевтической мишени при меланоме. Онкоген. 2019;38(11):1876–1891.

28. Альдини Дж. и др. N-ацетилцистеин как антиоксидант и агент, разрушающий дисульфиды: причины. Свободный радикал Рез. 2018;52(7):751–762. 29. Абу-Ремайлех М. и др. Метаболомика лизосом обнаруживает V-АТФазу- и mTOR-зависимую регуляцию оттока аминокислот из лизосом. Наука. 2017;358(6364):807–813.

30. Чжоу Дж и др. Иммуногенная гибель клеток при терапии рака: существующие и новые индукторы. J Cell Мол Мед. 2019;23(8):4854–4865. 31. Шарма Г. и др. Ингибирование PPT1 усиливает противоопухолевую активность антитела против PD-1 при меланоме. JCI-инсайт. 2020;5(17):e133225.

32. Менерт Дж.М. и др. BAMM (аутофагия BRAF и ингибирование MEK при меланоме): исследование фазы I/II дабрафениба, траметиниба и гидроксихлорохина при распространенной меланоме с мутацией BRAFV600-. Клин Рак Рез. 2022;28(6):1098–1106. 33. Лой М. и др. Белки макроаутофагии контролируют уровни MHC класса I в дендритных клетках и формируют антивирусные ответы CD8(+) Т-клеток. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Жуаден П. и др. Мобилизация лизосомального цистеина формирует реакцию TORC1 и рост тканей на голодание. Наука. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Швальфенберг Г.К. N-ацетилцистеин: обзор клинической пользы (старый препарат с новыми хитростями). J Нутр Метаб. 2021;2021:9949453.

36. Бир Л.А. и др. Систематическое обнаружение биомаркеров сыворотки внематочной беременности с использованием профилирования белка 3-D в сочетании с количественным анализом без меток. J Протеом Рез. 2011;10(3):1126–1138. 37. Голдман А.Р. и др. Первичным эффектом на протеом светлоклеточной карциномы яичника с мутацией ARID1A является подавление пути мевалоната на посттранскрипционном уровне. Мол Протеомика клеток. 2016;15(11):3348–3360.

38. Кокс Дж., Манн М. MaxQuant обеспечивает высокую скорость идентификации пептидов, индивидуальную точность массы в диапазоне ppb и количественную оценку белков в масштабах всего протеома. Нат Биотехнология. 2008;26(12):1367–1372.

39. Кокс Дж. и др. Андромеда: поисковая система пептидов, интегрированная в среду MaxQuant. J Протеом Рез. 2011;10(4):1794–1805.

40. Кокс Дж. и др. Точная количественная оценка без меток по всему протеому за счет отсроченной нормализации и экстракции максимального соотношения пептидов, называемая MaxLFQ. Мол Протеомика клеток. 2014;13(9):2513–2526.

41. Тьянова С и др. Вычислительная платформа Perseus для комплексного анализа данных (проте)омики. Нац методы. 2016;13(9):731–740.

42. Тьянова С., Кокс Дж. Персей: биоинформатическая платформа для интегративного анализа протеомных данных в исследованиях рака. Методы Мол Биол. 2018;1711:133–148.

43. Алиса Г.М. и др. Изменения в липидном метаболизме стареющих фибробластов вызывают возрастную устойчивость клеток меланомы к таргетной терапии через транспортер жирных кислот FATP2. Рак Дисков. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ран Ф.А. и др. Геномная инженерия с использованием системы CRISPR-Cas9. Нат Проток. 2013;8(11):2281–2308.

45. Лю П. и др. Количественная оценка воздействия кальретикулина, связанного с иммуногенной гибелью клеток. Методы Энзимол. 2020;632:1–13.