Активация макрофагов низкомолекулярными сахаридами из Cistanche Deserticola

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

［Воздержалсяract］

Изучить эффект активации иммунной системы и механизм воздействия низкомолекулярных сахаридов изЦистанхе пустынная(LMSC) на перитонеальных макрофагах мыши, RAW264. 7 кл. RAW264. 7 клеток были разделены на группу нормального контроля, группу положительного контроля LPS и группы лечения LMSC. RAW264. 7 клеток обрабатывали различными концентрациями LMSC от 3,91 до 62,5 г·л - 1. Для определения фагоцитарной активности макрофагов применяли анализ с нейтральным красным. Высвобождение NO определяли с помощью набора NO и уровней экспрессии белков, связанных с активацией макрофагов (TNF-, IL -6, IKK, p-IKK, IkB, p-IkB, NF-kB и p-NF-kB). были обнаружены вестерн-блоттингом. Результаты показали, что LMSC оказывает активирующее действие на макрофаги; это может значительно увеличить выброс NO в RAW264. 7 и способствуют экспрессии цитокинов TNF- и IL-6. Более того, LMSC значительно увеличивали фосфорилирование IKK, IκB и NF-κB p65. Кроме того, маннит, один из основных компонентов LMSC, значительно усиливал фагоцитарную активность макрофагов. Эти результаты показали, что LMSC могут активировать макрофаги путем усиления сигнального пути NF-κB, а маннит может быть одним из основных активных компонентов LMSC.

［Ключевые слова］ Низкомолекулярные сахариды; Цистанхе пустынная; иммунная активация; макрофаг; воспалительный фактор; NF-κB

Цистанхе пустынная YC Maэто растение из родаЦистанхе пустыннаяЮК Ма. Его мясистый стебель можно использовать как лекарство. Он имеет функции питания ян почек, питания эссенции и крови и увлажнения кишечника. Он известен как «пустынный женьшень». Химические компоненты Цистанхе включают фенилэтаноидные гликозиды, иридоидные гликозиды, сахара, лигнаны и многие другие типы. Современные фармакологические исследования показали, что цистанхе обладает многими биологическими свойствами, такими как нейропротекция, противоопухолевое, иммунорегулирующее, противовоспалительное и антиоксидантное [1]. Исследования показали, что отвар цистанхе и полисахариды могут значительно улучшить фагоцитарную способность и секреторную функцию макрофагов [2-3]. Однако нет отчета об исследовании активности его низкомолекулярных углеводов. Поэтому в этом исследовании использовалась система культивирования in vitro RAW264. 7 мышиных перитонеальных макрофагов для изучения иммуномодулирующей активности и связанных с ней механизмов низкомолекулярных углеводов Cistanche. Это исследование может предоставить больше экспериментальных данных для всестороннего пониманияИммуномодулирующий эффект Цистанхев будущем, чтобы в дальнейшем направлять его клиническое применение.

Цистанхе пустынная имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

1. Материалы

RAW264. 7 клеток были приобретены в Центре клеток Китайской академии медицинских наук; эмбриональная бычья сыворотка (FBS) была приобретена у PAN Biotech, Германия; антибиотики и среду DMEM приобретали у Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Липополисахарид из Escherichia coli O55:B5 (LPS) приобретали у Sigma Company, США. Набор оксида азота (NO) был приобретен в Нанкинском институте биоинженерии Цзяньчэн. Набор для хемилюминесценции ECL был приобретен у Thermo Fisher, США; антитело было приобретено у компании Cell Signaling Technology, США; Общие гликозиды цистанхе, низкомолекулярные сахара цистанхе и полисахариды цистанхе были получены нашей исследовательской группой самостоятельно. Массовая доля цистанхе общих гликозидов составила 78,76%. Массовая доля низкомолекулярных сахаровЦистанхе пустыннаясоставляет 58. 00 процентов, а массовая доляЦистанхе пустыннаяполисахаридов составляет 65,24 процента. Tanon-5200Многогелевая сплит-система визуализации была приобретена у Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Ридер Sunrise-Basic был приобретен у компании TECAN.

2. Метод

2. 1 Метод нейтрального красного для измерения фагоцитарной активности макрофагов

Возьмите мышиные перитонеальные макрофаги в логарифмической фазе роста после трипсинизации, подсчитайте клетки, доведите количество клеток до 5 × 104 клеток/мл и инокулируйте их в 96-луночный планшет для культивирования клеток, 100 мкл/лунку , при 37 градусах. Культивируют в условиях 5% CO2, после того как клетки прилипнут к стенке, удаляют культуральный супернатант, добавляют среду DMEM (10% FBS плюс 1% P/S), LPS (1 мг·л - 1) и Cistanche цистанхе соответственно Всего гликозидов,Цистанхекультивировали общие полисахариды и низкомолекулярные сахара Cistanche cistanche (3,91 ~ 62,5 г·л -1 соответственно, отфильтрованные через фильтрующую мембрану перед введением). После культивирования в течение 48 часов в каждую лунку добавляют по 100 мкл 0,075% нейтрального красного физиологического раствора, продолжают культивирование в течение 4 часов, аспирируют надосадочную жидкость, промывают 3 раза PBS, добавляют лизат клеток (ледяная уксусная кислота -этанол 1:1) 100 мкл, поместите на 4 градуса на 2 часа и измерьте оптическую плотность (A540 нм) после лизиса клеток.

2.2 Определение количества высвобождаемого NO в клеточном супернатанте

Инокулировать RAW264. 7 клеток в 48-луночном планшете (1 × 105 клеток/мл, 500 мкл/лунка), аспирируйте среду клеточной культуры после инкубации в течение ночи, добавьте среду DMEM (10 % FBS плюс 1 % P/S), 500 мкл каждого из LPS (1 мг·л -1) и Cistanche cistanche, общего количества гликозидов, общего количества полисахаридов и низкомолекулярных сахаров (3,91 ~ 62,5 г·л -1 соответственно). Через 24 часа индукционной культуры собирали супернатант. Определите концентрацию NO в клеточном супернатанте каждой группы с помощью набора NO, следуйте инструкциям и, наконец, определите оптическую плотность (A570 нм) с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

2. 3. Вестерн-блот

Инокулировать RAW264. 7 клеток в 6-луночный планшет, аспирируйте среду для культивирования клеток после инкубации в течение ночи, добавьте среду DMEM (10 % FBS плюс 1 % P/S), LPS (1 мг·л - 1) иЦистанхеобщее количество полисахаридов и низкомолекулярных сахаров (3,91 ~ 62,5 г·л -1) составляло по 2 мл каждый, и надосадочную жидкость удаляли после 24 часов индукционной культуры. Клетки дважды промывали PBS и отбрасывали. После трипсинизации клетки пипетируют. Центрифугировать, удалить супернатант, добавить 100 мкл лизирующего буфера NP40 и лизировать на льду в течение 40 мин. После центрифугирования отбирали надосадочную жидкость, определяли концентрацию белка методом ВСА и равномерно регулировали концентрацию белка каждого гистона. Возьмите такое же количество образцов белка и разделите их на 12-процентном SDS-PAGE при постоянном давлении. Затем используйте резервуар для электрофореза переноса Bio-Rad для переноса мембраны с постоянным током 350 мА в течение 1 часа и переноса белка на мембрану PVDF (предварительная обработка мембраны PVDF: замачивание в метаноле и уравновешивание буфером для переноса). После блокирования 5-процентным обезжиренным молоком (с TBST, содержащим 0,1 % Tween-20) в течение 1 ч при комнатной температуре мембрану промывали 3 раза TBST и инкубировали в разбавителе белковых первичных антител при 4 градус на ночь. Мембрану промывали 3 раза TBST через день и добавляли соответствующий разбавитель для инкубации в течение 1 часа. Мембрану промывали 3 раза TBST и полоски проявляли хемилюминесцентным проявителем ECL.

2. 4 анализа данных

Данные выражены в виде x ± s, и значимость разницы проверяется с использованием статистического программного обеспечения GraphPad Prism 6 для однофакторного дисперсионного анализа. Возьми П<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Результаты

3. 1. Влияние низкомолекулярных сахаров, общих гликозидов и общих полисахаридов Cistanche cistanche на фагоцитарную активность RAW264. 7 ячеек

Исследования химических компонентов цистанхе показывают, чтоЦистанхев основном содержитфенилэтаноидные гликозиды, иридоидные гликозиды и углеводы. В этом эксперименте отбирают общие гликозиды цистанхе (включая гликозиды фенэтилового спирта и иридоидные гликозиды), низкомолекулярные сахара и сахара. Три активных центра полисахаридов были исследованы на предмет их влияния на активацию RAW264. 7 кл. И полисахарид Cistanche cistanche, и низкомолекулярный сахар cistanche могут значительно повышать фагоцитарную активность RAW264. 7 клеток, но фагоцитарная активность группы общего введения гликозида существенно не меняется. Кроме того, положительный контрольный препарат LPS также значительно улучшал фагоцитарную активность RAW264. 7, как показано на рисунке 1. Приведенные выше результаты позволяют предположить, что низкомолекулярные сахара и полисахариды цистанхе могут иметь эффект активации RAW264. 7 кл.

3. 2. Влияние суммарных гликозидов, низкомолекулярных сахаров и полисахаридов Цистанхе на содержание оксида азота (NO) в клеточном супернатанте

Для дальнейшего изучения эффекта активации трех активных центров цистанхе на RAW264. 7 определяли содержание NO в супернатантах клеток, стимулированных различными препаратами. Результаты показали, что высвобождение NO в группе LPS было значительно выше, чем в контрольной группе (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Цистанхене имело существенного эффекта. Приведенные выше результаты показывают, что как полисахариды, так и низкомолекулярные сахара цистанхе могут способствовать высвобождению NO из RAW264. 7 кл. Среди них особенно значителен эффект низкомолекулярных сахаров цистанхе, как показано на рисунке 2.

3. 3. Влияние низкомолекулярного сахара Cistanche cistanche на экспрессию белков TNF- и IL-6 в RAW264. 7 ячеек

TNF- является важным медиатором воспаления, который появляется в процессе активации RAW264. 7, которые могут способствовать синтезу и высвобождению других цитокинов (таких как IL-6). Результаты показали, что экспрессия TNF- и IL -6 была значительно увеличена после стимуляции низкомолекулярным сахаром Cistanche cistanche, что позволяет предположить, что низкомолекулярный сахар Cistanche может способствовать экспрессии TNF. - и IL-6 в RAW264. 7 клеток, тем самым активируя клеточный иммунитет Фагоцитоз, см. рисунок 3.

3. 4. Регуляторный эффект низкомолекулярного сахара Cistanche cistanche на сигнальный путь IKK/IκB/NF-κB.

Чтобы изучить потенциальный механизм низкомолекулярных сахаров Cistanche cistanche в активации RAW264. 7, авторы исследовали его регуляторные эффекты на классический сигнальный путь IKK/IκB/NF-κB. Низкомолекулярный сахар Cistanche cistanche может значительно увеличивать фосфорилирование NF-κB и фосфорилирование его вышестоящих ключевых сигнальных белков IKK и IκB, а также снижать экспрессию общего белка IκB, указывая на то, что он оказывает активирующее действие на IKK/ Сигнальный путь IκB/NF-κB. Положительный контрольный препарат LPS также имеет аналогичный регулирующий эффект. Таким образом, низкомолекулярные сахара цистанхе могут активировать сигнальный путь IKK/IκB/NF-κB, тем самым вызывая синтез и высвобождение цитокинов, таких как TNF- и IL-6, и, наконец, вызывая иммунную активация RAW264. 7 ячеек, см. рисунок 4.

3. 5. Скрининг активных ингредиентов с активирующим макрофаги эффектом в низкомолекулярных сахарах Cistanche.

Наша лаборатория провела анализ низкомолекулярных сахаров, содержащихся вЦистанхена ранней стадии и обнаружили, что он в основном содержит маннит (16,53 процента), сахарозу (8,34 процента), фруктозу (25,38 процента) и глюкозу (7,75 процента) и другие ингредиенты. Поэтому автор использовал метод нейтрального красного для скрининга активационного эффекта вышеуказанных компонентов на макрофаги. Маннитол может значительно повышать фагоцитарную активность макрофагов дозозависимым образом, в то время как эффекты других компонентов не являются значительными. Это говорит о том, что маннит может быть одним из ключевых активных компонентов низкомолекулярных сахаров Cistanche cistanche для активации макрофагов, как показано на рисунке 5.

4. Дискуссия

Сообщалось, что цистанхе cistanche, паразитическое растение семейства Lydanaceae, обладает иммуномодулирующим действием, поэтому оно должно содержать иммуномодулирующие вещества. В этом эксперименте автор провел скрининг фагоцитарной активности мышиных перитонеальных макрофагов на различных очищенных участкахЦистанхеи обнаружили, что низкомолекулярные сахара и полисахариды цистанхе обладают эффектом активации макрофагов, но общие гликозиды цистанхе не очевидны. В то же время автор обнаружил, что низкомолекулярные сахара могут активировать макрофаги при более низких концентрациях, поэтому авторы выбралиЦистанхенизкомолекулярные сахара в качестве объекта последующих исследований.

Изучая влияние низкомолекулярного цистанхового сахара на экспрессию цитокинов TNF- и IL-6, авторы обнаружили, что низкомолекулярный цистаншовый сахар значительно увеличивает экспрессию TNF- и IL-6, что дополнительно доказали, что низкомолекулярный сахар цистанхе оказывает влияние на мышей. Перитонеальные макрофаги обладают активирующим действием. Поэтому автор дополнительно исследовал его потенциальный механизм действия. Провести исследование

Показано, что бактериальный липополисахарид (ЛПС) может индуцировать активацию мышиных макрофагов и мышиных глиальных клеток через сигнальные пути, такие как JAK2/STAT3, NF-kB, p38/ERK и MAPK [4-8]. Путь NF-κB признан классическим путем, поэтому в этом эксперименте тестировали сигнальные белки этого пути. Результаты показали, что низкомолекулярные сахара цистанхе могут значительно увеличить фосфорилирование NF-κB и фосфорилирование ключевых вышестоящих сигнальных белков IKK и IκB, предполагая, что низкомолекулярные сахара цистанхеЦистанхеможет активировать перитонеальные гиганты мыши через сигнальный путь IKK/IκB/NF-κB. Фаговые клетки высвобождают воспалительные цитокины и затем играют роль в активации клеточного иммунитета.

На начальном этапе лабораторных исследований химический состав низкомолекулярного сахарного экстрактаЦистанхе пустыннаябыл систематически проанализирован. Установлено, что низкомолекулярные сахара в основном содержат такие мономеры, как маннит, сахароза, фруктоза и глюкоза. Дальнейшие исследования показали, что маннитол может значительно улучшить фагоцитарную активность макрофагов. Поэтому предполагается, что маннит может быть ключевым компонентом низкомолекулярных сахаров, который активирует функцию клеточного иммунитета.

Таким образом, это исследование использовало макрофаги в культуральной системе Vitro и обнаружило, что низкомолекулярные сахараЦистанхеоказывают значительное активирующее действие на макрофаги и могут активировать перитонеальные макрофаги мыши через сигнальный путь NF-κB, а затем играть определенную роль. Маннит в составе низкомолекулярных сахаров может играть важную роль в активации фагоцитарной активности макрофагов.

использованная литература

[1] Ту Пэнфэй, Го Юхай. Методы выращивания пустынной цистанхе и ее хозяина тамарикса [M]. Пекин: Science Press, 2015:31.

[2] Гао Сяося, Чэнь Цзюнь, Пэн Яньли. Обзор исследований фармакологических эффектовЦистанхе пустыннаяполисахарид [J]. Еда и лекарства, 2015, 17(2):136.

[3] Ван Сянъянь, Ци Юнь, Цай Руслан и др. Активация макрофагами полисахарида Cistanche [J]. Китайский фармакологический бюллетень, 2009 г., 25(6):787.

[4] Лю Чжунъюань, Ли Яньпин. Биологическая активность и механизм бактериального липополисахарида [J]. Обзор медицинской науки, 2010, 16(2):166.

[5] Фу Чжихуэй, Сюй Лин, Хуан Цзяо и др. LPS через путь p38/MAPK и активацию NF-κB индуцирует экспрессию HIF-1 в RAW264. 7 клеток [J]. Журнал Чунцинского медицинского университета, 2016 г., 41(10): 1033.

[6] Хао Ютонг, Чен Чунхай, Ян Сюэсэнь и др. Сигнальный путь JAK2/STAT3 участвует в индуцированной липополисахарами активации микроглии［J］. Вестник Третьего военно-медицинского университета, 2009, 31(12):1119.

[7] Сун Сяоминь, Ляо Лиси, Дун Синь и др. Гликозиды Mulbascum ингибируют индуцированное липополисахаридами воспаление микроглии BV-2 и его механизм [J]. Китайский журнал традиционной китайской медицины, 2016 г., 41(13): 2506.