Многие исследования подтвердили, что аллергические заболевания являются результатом не только активации врожденного иммунитета 2

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

3. Обсуждение

Патогенез атопического дерматита (АД) до конца не ясен, но заболевание опосредуется аномальным иммунным ответом иммуноглобулина Е (IgE) при дисфункции кожного барьера. Среди них тучные клетки (ТК) могут вызывать IgE-опосредованные аллергические заболевания, включая БА. Когда тучные клетки активируются, они высвобождают связанные с мембраной цитоплазматические частицы, что приводит к высвобождению множества молекул. Эти молекулы играют важную роль в патогенезе БА и защите хозяина [27]. Поскольку ингибирование активации или дегрануляции тучных клеток помогает регулировать различные IgE-опосредованные реакции гиперчувствительности, тучные клетки являются одной из идеальных мишеней для изучения противоаллергических препаратов. В нашем исследовании тучные клетки дегранулировались в ответ на соединение 48/80 и ионофор кальция A23187, а также анти-DNP/IgE плюс DNP/HSA. Мы обнаружили, что эталон эффективно ингибировал эффект дегрануляции тучных клеток, проявляя свою противоаллергическую реакцию. Более того, увеличение внутриклеточного кальция и активация МАРК ингибировались в сравнении с эталоном. Кроме того, инфильтрация тучных клеток кожи, вызванная DNCB, и расчесывание, вызванное соединением 48/80, также уменьшались. Следовательно, механизм антиатопического дерматита неферина оказывает мультипликативное действие на кератиноциты и тучные клетки.

Патогения атопического дерматита (DA) не се comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos себе activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una Variad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel Importante en la patogenesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido Que La Inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitas ayuda a регулярные varias reacciones de hypersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos Ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitas se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ion-foro de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, эль-aumento де calcio внутриклеточной у ла activación де MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Цитоплазма тучных клеток, обнаруженных в тканях, заполнена крупными плотными частицами заранее сформированных медиаторов воспаления [28]. Процесс высвобождения этих медиаторов из секреторных гранул тучных клеток называется дегрануляцией. Поскольку ингибирование дегрануляции тучных клеток может регулировать различные IgE-опосредованные реакции гиперчувствительности, тучные клетки являются одной из идеальных мишеней для изучения противоаллергических препаратов [29,30]. Наши результаты показывают, что эталон оказывает очень хорошее влияние на дегрануляцию тучных клеток независимо от использования антигена, стимулятора рецептора или ионофора. Это показывает, что эталон является потенциальным противоаллергическим средством (рис. 2).

В качестве индикаторов активации ТК можно использовать все предварительно хранящиеся гранулы, вновь синтезированные медиаторы и даже гранулы и их компоненты [31]. Кроме того, стандартным методом является измерение внутриклеточной концентрации Ca4t. Большинство стимуляторов секреции МС (например, антиген, соединение 48/80), которые обычно использовались в лаборатории, вызывали повышение внутриклеточной концентрации Са2+. Фактически, увеличение внутриклеточной концентрации Ca2 plus также может вызвать дегрануляцию ТК. Обычно увеличение внутриклеточного Ca4t индуцируется активацией ТК соединениями, такими как тапсигаргин (специально блокирующий Сарко/эндоплазматический Са2 плюс АТФазу, SERCA) и ионофоры (т.е. иономицин и А23187) [32,33]. Следовательно, при Ca2t-зависимой активации ТК измерение притока Са2t также считается методом определения условий активации ТК. В исследованиях MC Fura-2 широко используется для определения внутриклеточных изменений Ca2 plus. В наших экспериментах мы обнаружили, что интенсивность флуоресценции активированных тучных клеток была значительно подавлена ​​после обработки эталоном (рис. 3). В предыдущих сообщениях указывалось, что увеличение внутриклеточной концентрации Ca4t соответствовало высвобождению гистамина [34]. Следовательно, мы делаем вывод, что высвобождение гистамина также будет ингибироваться лечением эталоном. Для проверки этой гипотезы необходимы дальнейшие эксперименты.

Тучные клетки имеют существенно разные функциональные результаты.доза цистанхеК ним относятся дегрануляция, образование предшественников арахидоновой кислоты, хемотаксис и продукция цитокинов, и все они в некоторой степени зависят от сигналов кальция, независимо от стимуляторов [32]. Активированные ТК высвобождают цитокины, которые являются основными медиаторами аллергии и воспалительных заболеваний [32]. 35]. Продукция цитокинов активированными тучными клетками является результатом индукции транскрипции генов цитокинов в этих клетках. Стимуляция тучных клеток приводит к активации NF-kB и AP-1 и продукции многих цитокинов [36].Каскадно-сигнальные пути MAPK играют существенную роль в регуляции экспрессии цитокинов. Активация этих путей посредством активации PKC PI приводит к активации различных генов, включая гены воспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и TNF [37]. Наши недавние исследования показали, что эталон может ингибировать цитокины, высвобождаемые при активации кератиноцитов. В то же время мы также обнаружили, что активация пути МАРК также будет ингибироваться при лечении эталоном [18]. В нашем текущем исследовании мы показали, что эталон может также снижать экспрессию цитокинов за счет ингибирования активации MAPK в тучных клетках (рис. 4 и 5). Активация NFkB также снижается из-за ингибирования активации MAPK (рис. 6).

Цистанхе может омолаживать

В ряде исследований сообщалось, что у пациентов с БА повышен уровень различных цитокинов, что приводит к дисфункции кожного барьера, включая цитокины, секретируемые кератиноцитами, и цитокины, происходящие из Th{0}} [38,39]. Кроме того, сообщается, что эти секретируемые цитокины могут также подавлять экспрессию белков плотных контактов (Т) и генов терминальной дифференцировки, включая филаггрин (FLG), лорикрин (LOR) и инволюкрин (IVL) [39,40]. Экспрессия ](Pro)филаггрина снижена при AD и обратно связана с триптазой MC и IL-6[41]. IL-1 опосредует хроническое воспаление у мышей с нарушенным кожным барьером [35]. В предыдущем исследовании сообщалось, что экспрессия FLG, IVL и LOR снижалась после применения DNCB на спинной коже мышей NC/Nga [42,43]. В настоящем исследовании экспрессия FLG, IVL и LOR была значительно снижена в дорсальной коже контрольной группы, что указывало на нарушение эпидермального барьера. Введение эталона значительно восстановило сниженную экспрессию FLG, IVL и LOR после лечения DNCB, в то время как введение эталона немного увеличило экспрессию IVL и LOR по сравнению с контрольной группой (рис. 8). Известно, что соединение 48/80 является эффективным активатором тучных клеток кожи. Реакция кожи, стимулируемая соединением 48/80, может вызывать царапанье за ​​счет высвобождения гистамина из тучных клеток [44]. Гистамин, высвобождаемый из активированных тучных клеток, играет важную роль в увеличении проницаемости сосудов, вызванном соединением 48/80. Во время зуда у человека также учитывается гистамин, высвобождаемый тучными клетками при различных раздражителях. стал важным посредником. Следовательно, ингибирование дегрануляции тучных клеток является важным шагом в регуляции высвобождения гистамина во время расчесывания. В этом исследуемом соединении 48/80 вызывало эффективную активацию тучных клеток кожи. Однако предварительная обработка эталоном значительно снижала уровень дегрануляции тучных клеток (рис. 2).Преимущества экстракта цистанхеЭти результаты показывают, что эталонный поведенческий эффект против царапин может быть обусловлен снижением проницаемости сосудов за счет регуляции дегрануляции тучных клеток (рис. 9).

Общеизвестно, что пациенты с АД страдают от дисфункции кожного барьера, воспаления кожи или того и другого, поэтому трудно найти подходящие методы лечения. Поэтому обычно рекомендуется комбинированная терапия. Наши недавние исследования доказали, что он никогда не обладает иммуномодулирующей функцией и способностью восстанавливать барьер. Таким образом, важным ориентиром в лечении АД в будущем является поддержание функции кожи и улучшение увлажнения кожи и восстановление барьера. Референс также может уменьшить расчесывание, вызванное аллергенами и раздражителями. Более того, атопический марш представляет собой заболевание, связанное с феноменом, которое возникает и прогрессирует поэтапно. Атопический дерматит часто наблюдается в младенчестве. Пищевая аллергия часто возникает после 1-2лет. Аллергический ринит часто может начаться до и после школы. Симптомы астмы появляются в разное время, но чаще всего после аллергического ринита. После детства атопический дерматит и некоторые пищевые аллергии могут улучшиться или исчезнуть. Аллергический ринит и астму нелегко вылечить [45,46]. Поэтому они являются коморбидными явлениями при заболеваниях. Натуральные продукты, в том числе эталоны, обладают терапевтическим потенциалом сопутствующих заболеваний, и их эффективность при сопутствующих заболеваниях заслуживает изучения в будущем.

4. Материалы и методы

4.1. Клетки базофильного лейкоза крыс

Клетки базофильного лейкоза крысы (RBL-2H3) были подарком от TLHwang, Университет Чан Гун, Таоюань, Тайвань. Клетки RBL-2H3 представляют собой тучные клетки слизистой оболочки, которые используются для изучения индуцированной антигеном или ионофором кальция дегрануляции, внутриклеточного Ca4t и передачи сигнала [29]. Клетки культивировали в среде EMEM, содержащей 10% FBS, с пенициллином и стрептомицином при 37°, 5% CO2. Модифицированную среду Дульбекко Iscove (IM) и эмбриональную бычью сыворотку (FBS) приобретали у Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, USA).

4.2. Анализ МТТ

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид (MTT) используется для измерения метаболическую активность клеток. Клетки RBL-2H3 высевали в 24-луночный культуральный планшет в количестве 5 × 10+/лунку. После 24 ч обработки лекарственным средством добавляли 30 мкл MTI на лунку и помещали в инкубатор для клеток при 37° на 2-4 ч, затем фиолетовые кристаллы формазана растворяли в ДМСО. Считыватель ELISA использовали для измерения интенсивности поглощения при длине волны 550 нм в качестве теста на жизнеспособность клеток.

4.3. Измерение уровня внутриклеточного Ca2 плюс

[Ca2t] I измеряли с помощью fura-2, как описано ранее[47]. Клетки RBL-2H3 ресуспендировали в IMDM, содержащем 5 мкМ Fura2-AM и 1,2 мМ CaClz, при 37 градусах в течение 30 минут. После загрузки Fura-2 кератиноциты осаждали и ресуспендировали в свежей DMEM. Аликвоту (2 мл) переносили в кювету с мешалкой, содержащую 1,2 мМ CaClz. Флуоресценцию Fura-2-Ca анализировали при длинах волн возбуждения 340 и 380 нм (длина волны испускания 505 нм) в PerkinElmer LS{{19 }} спектрофлуориметр (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Данные записывались с интервалом в 5 с[47].

4.4. Количественная полимерная цепная реакция (кПЦР)

Клетки RBL{{0}}H3 высаживали в чашку для культивирования диаметром 3,5 см. После того, как клетки наполнялись до 90%, клетки выращивали в статическом состоянии в течение 24 часов. После предварительной обработки клеток эталоном в течение 20 мин их стимулировали TNF-a/IFN-y в течение 1 или 24 ч соответственно. Клетки соскабливали, центрифугировали (16,000×g, 10 мин, 4 град.) и экстрагировали супернатант. РНК очищали с использованием набора для выделения общей РНК (GeneDirex@, Vegas, NV, USA). В соответствии с рабочей процедурой набора для синтеза кДНК (BIO-RAD) реагенты добавляли по порядку и использовали в соответствии с указанными условиями для превращения РНК в кДНК. Кроме того, использовали PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). В общей сложности добавляли 7,5 мкл ddH2O, 2 мкл кДНК, 0,25 мкл прямого и обратного праймеров и 10 мкл SYBR GREEN и однородно перемешивали. Последовательности праймеров показаны в таблицах 1 и 2. Затем количество РНК определяли с использованием системы ПЦР в реальном времени ABI StepOnePlusTM.

4.5. Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг используется для анализа изменений различных белков в клетках. Клетки RBL{{0}}H3 высевали в культуральную чашку диаметром 3,5 см. После того как клетки наполнялись до 90% и находились в состоянии голодания в течение 24 часов, их предварительно обрабатывали эталоном в течение 20 минут, а затем стимулировали TNF-α или IFN-γ в течение 30 минут или 1 часа соответственно. После выскабливания их измельчали ​​ультразвуком и центрифугировали (13 200 об/мин, 10 мин, 4 град.). После центрифугирования отбирали надосадочную жидкость и определяли количество белка с помощью набора для анализа белков Пирса (Pierce, Рокфорд, Иллинойс, США). Его подвергали электрофорезу в 10-процентном SDS-полиакриламидном геле, а затем электропорации с мембраной PVDF. После завершения переноса мембрану PVDF помещали в раствор TBS-T (трис-буферный раствор/0,05% твин 20), содержащий 5% сухого обезжиренного молока, и встряхивали в течение 1 ч, чтобы избежать неспецифического связывания. Затем TBS-T использовали для промывания 3 раза по 10 минут каждый раз. Затем добавляли первичные антитела (разведение 1:1000) и выдерживали при 4 градусах в течение ночи, а затем промывали 3 раза TBS-T каждые 10 мин. После добавления вторичных антител (разведение 1:1000) в течение 1 ч мембрану PVDF промывали 3 раза TBS-T по 10 мин каждый раз. Наконец, был добавлен проявитель, и мембрана была помещена в систему экстракции химической люминесценции (BIOSTEP Celvin") для съемки.

4.6. Динитрохлорбензол(2,4-динитрохлорбен2ен, DNCB), индуцированный атопическим дерматитом, вызывает воспаление кожи у мышей.

Сначала мышей разделили на четыре группы: контрольная группа, группа DNCB (отрицательная группа), контрольная (3 мг/кг и 1{2}} мг/кг) с группой DNCB и дексаметазон (0,2 мг/кг) с группой DNCB. Группа DNCB (положительная группа). Дексаметазон — это кортикостероидный гормон, который может уменьшить отек и аллергические реакции. В этом эксперименте in vivo и эталон, и дексаметазон растворяли в ДМСО, а ДНХБ растворяли в 75-процентном этаноле с помощью ультразвукового удара. Первый вводили путем внутрибрюшинной инъекции, а для второго 100 мкл наносили на кожу спины, а 20 мкл наносили на правое ухо. За три дня до эксперимента мышам анестезировали и удаляли волосы на спине, а небольшой измерительный магнит (SCT-MAG-TF) встраивали в заднюю часть задних лап мышей.Цистанче ЧингисханПосле отдыха в течение трех дней было подтверждено, что мыши находятся в хорошем физическом состоянии, а кожа на спине в области депиляции была нормальной, и эксперимент был начат. Во время эксперимента были сделаны фотографии, чтобы зафиксировать изменения внешнего вида кожи. Первый этап ({{0}} дней) - период аллергического атопического дерматита. После измерения основных значений у мышей в группе DNCB, контрольной (3 и 10 мг/кг) и экспериментальной группе DNCB, а также экспериментальной группе 0,2 мг/кг дексаметазона и DNCB, 1 процент DNCB равномерно наносили на кожу спины и Правое ухо. На пятые сутки внутрибрюшинно вводили препараты сравнения и дексаметазон. Второй этап (с 5-го по 14-й день) — повторная индукция атопического дерматита.продление жизни цистанхеВ 3 экспериментальных группах 0,5% DNCB равномерно наносили на кожу спины и правое ухо мышей. На следующий день были сделаны и записаны физиологические показатели кожи и снимки. После эвтаназии мышей на 15-й день с помощью избыточного количества углекислого газа (CO2) ткань спинной кожи удаляли для последующего экспериментального анализа.

4.7. Соединение 48/80-Индуцированное расчесывание у мышей BALB/c

Волосы кожи на спине мыши срезали и внутрикожно вводили 20 мкл раствора соединения 48/80. Вместо этого контрольным мышам вводили физиологический раствор. Сразу же после инъекции животное помещали в клетку для наблюдения (диаметр 11 см, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Japan), и автоматически и объективно определяли и оценивали поведение мыши по царапанию. Поведение царапания измеряли в течение 60 мин. MicroAct использует следующие параметры анализа для обнаружения волн, соответствующих непрерывному почесыванию мышей: порог 0,05 В; интервал событий, 0,05 с; минимальная продолжительность, 0,25 с; максимальная частота, 30 Гц; минимальная частота, 5Гц. 4.8.Статистический анализ

Программное обеспечение Sigma-Plot (версия 1 0.0) использовалось для статистического анализа.цистанче россияДанные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего с (*) и (#) в качестве примечаний. Статистическую значимость данных анализировали с помощью непарных двусторонних t-тестов Стьюдента. Значения p менее 0.05 и 0,01 считались значимыми.

5. Выводы

В этом исследовании мы определили, что эталон эффективно ингибирует дегрануляцию тучных клеток и снижает экспрессию провоспалительных цитокинов, что может уменьшить симптомы, подобные атопическому дерматиту, восстановить кожный барьер и уменьшить расчесы кожи. Далее мы доказали, что референс может воздействовать не только на кератиноциты кожи, но и влиять на активацию тучных клеток. Он имеет больший потенциал для применения при аллергических и воспалительных заболеваниях кожи.

Эта статья взята из Int. Дж. Мол. науч. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms