Метформин улучшает стволовые клетки человека, полученные из жировой ткани, путем понижающей модуляции

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный:Жировая ткань играет важную роль в регуляции метаболического гомеостаза, сохраняя избыток жира и защищая другие органы от липотоксичности. Старение связано с центральным перераспределением жира, достигающим кульминации в уменьшении чувствительных к инсулину подкожных и увеличении инсулинорезистентных висцеральных жировых отложений. Стволовые клетки жировой ткани (ASCs) играют важную роль в регенерации жировой ткани. Старые ASC демонстрируют сниженную стволовость и регенеративный потенциал из-за накопления окислительного стресса и повреждения клеток, связанного с митохондриальной дисфункцией. Метформин является хорошо зарекомендовавшим себя противодиабетическим препаратом, который продемонстрировал омолаживающие эффекты на различных организмах и животных моделях. В этом исследовании мы проанализировали влияние лечения метформином на стволовость человеческих ASC в моделях клеточной культуры и цельной жировой ткани. Наши результаты показывают, что метформин улучшает стволовость АСК, снижая скорость их пролиферации и дифференцировки адипоцитов. Исследуя возможный основной механизм, мы наблюдали снижение активности mTOR и ERK в ASC, обработанных метформином. Кроме того, мы наблюдали увеличение активности аутофагии при лечении метформином. Мы пришли к выводу, что лечение метформином улучшает стволовость ASC за счет снижения передачи сигналов mTOR и ERK и усиления аутофагии. Будущие исследования in vivo на животных моделях и людях откроют путь для клинической адаптации этого хорошо зарекомендовавшего себя препарата для восстановления стволовости состарившихся стволовых клеток.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Ключевые слова:жировые стволовые клетки; жировая ткань; стволовость; дифференциация; распространение; метформин; mTOR; ЭРК; аутофагия

1. Введение

Жировая ткань является динамичным органом, играющим важную гомеостатическую роль в регулировании баланса питательных веществ, чувствительности к инсулину и иммуномодуляции. Эту роль выполняет жировая ткань, запасая и окисляя избыток жирных кислот, тем самым предотвращая стеатоз и липотоксичность в других органах [1]. Инсулинорезистентность, связанная с возрастом, является наиболее распространенным метаболическим заболеванием. Примерно 25% населения США старше 65 лет страдают сахарным диабетом, что приводит к более высокому уровню смертности, снижению функционального статуса, повышенному риску госпитализации и чрезмерной нагрузке на экономику здравоохранения [2]. Хотя связь между диабетом и ожирением давно признана, связь между старением и диабетом 2 типа остается неуловимой [3]. Первое наблюдение, связывающее снижение толерантности к глюкозе со старением, было сделано в 1921 г. [4]. С тех пор в нескольких исследованиях было установлено, что снижение чувствительности к инсулину является основной причиной возрастного нарушения метаболизма глюкозы [5,6]. В зависимости от анатомической локализации жировую ткань можно условно разделить на два депо: подкожное и висцеральное жировые депо. Расположение и функция депо жировой ткани важны с точки зрения чувствительности к инсулину; например, висцеральное депо более устойчиво, тогда как подкожное депо более чувствительно к инсулину [7]. Связанная с возрастом постепенная потеря объема подкожной жировой ткани приводит к снижению поглощения глюкозы и липидов, что приводит к перетоку липидов и эктопическому отложению липидов в мышцах и печени, способствуя развитию резистентности к инсулину [8].

Жировая ткань состоит из различных типов клеток. Ферментативное расщепление жировой ткани коллагеназой дает две основные фракции: фракцию адипоцитов и стромально-васкулярную фракцию (СВФ) [9]. СВФ включает стволовые клетки жирового происхождения (ASC), лимфоциты, эндотелиальные клетки, перициты и фибробласты [10]. ASC определяются иммунно-фенотипически как клетки CD34 плюс CD90 плюс CD29 плюс CD45-CD31 мезенхимального происхождения, проявляющие способность дифференцировки трех линий в кости, хрящи или жир [11,12]. В белой жировой ткани эти клетки в основном находятся в строме сосудов вокруг мелких кровеносных сосудов и могут пролиферировать и дифференцироваться в адипоциты [11]. Стволовые клетки жировой ткани (ASC) играют важную роль в регенерации жировой ткани, подвергаясь пролиферации, самообновлению и дифференцировке. Старение связано с потерей этих свойств стволовости в ИСК [13,14]. Связанное с возрастом уменьшение размера подкожного жира, как полагают, связано с измененной репликацией и дифференцировкой ASCs[15-17]. Финдейзен и др. предполагают накопление окислительного стресса в жировой ткани во время старения, что негативно влияет на способность к дифференцировке; [15] однако точный механизм (механизмы), лежащий в основе потери стволовости в ASCs, не ясен. Недавние исследования показали, что сниженная аутофагия, более высокая механистическая активность пути рапамицина (mTOR) и накопление активных форм кислорода (АФК) связаны с потерей стволовости в ASCs и индукцией преждевременного старения в ASCs [18-20].

Цистанхе может омолаживать

Метформин — антидиабетический препарат, обычно используемый для снижения уровня сахара в крови и улучшения чувствительности к инсулину. Его можно использовать для лечения различных метаболических нарушений, связанных со старением, таких как сердечно-сосудистые заболевания, рак и снижение когнитивных функций [21,22]. Эффекты метформина, увеличивающие продолжительность жизни, были продемонстрированы на червях, мышах и крысах посредством диетического ограничения, которое имитирует эффект стимуляции активности протеинкиназы, активируемой аденозинмонофосфатом (AMPK) [23]. Различные исследования показали, что метформин ингибирует мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR) [24,25]. Сигнальные пути AMPK-mTOR специфически регулируют характеристики клеточного гомеостаза, такие как аутофагия, пролиферация, энергетический метаболизм и синтез белка [26]. Было показано, что метформин ингибирует пролиферацию, дифференцировку и воспаление, уменьшая окислительный стресс и митохондриальный потенциал и улучшая общую стволовость различных типов взрослых стволовых клеток [27,28]. Влияние метформина на метаболизм и стволовость ИСК in vitro и in vivo неясно.

В этом исследовании мы использовали 2D-культуру ASC человека и методы культивирования всей жировой ткани человека для моделирования клеточной организации in vivo и тканевого микроокружения. Используя эти экспериментальные модели, мы изучили влияние лечения метформином на дифференцировку, пролиферацию и стволовость ИСК и исследовали молекулярные механизмы, участвующие в этих клеточных процессах.

2. Материалы и методы

2.1. Спецификации донора

Жировая ткань была собрана у пяти доноров-женщин, не страдающих диабетом, в возрасте 39 ± 13 лет и с ИМТ 27 ± 4, перенесших плановые процедуры пластической хирургии в Медицинском центре Университета Питтсбурга (UPMC). Процедура сбора тканей была одобрена Институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга (IRB No.0511186).

2.2. Выделение и культивирование ИСК человека

Клетки-предшественники жировой ткани выделяли следующим образом [19, 29]. Биоптаты жировой ткани после оперативных вмешательств передавались в лабораторию в стерильном герметичном контейнере. Ткань промывали фосфатно-солевым буфером Дульбекко (PBS; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) с последующим удалением волокнистого материала и кровеносных сосудов путем рассечения. Ткань разрезали на кусочки (1-2 мг) и расщепляли в буфере для расщепления (HBSS, содержащем 200 ед/мл коллагеназы (CLS Type II, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI). , США) и 2% без содержания БСА (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США)) при перемешивании в течение 60 мин при 37°; 1 мг жировой ткани/3 мл буфера для расщепления. Дисперсную ткань центрифугировали в течение 10 мин при 200×g при комнатной температуре. Флотирующие адипоциты аспирировали, а осевшие клетки стромально-васкулярной фракции (СВФ) суспендировали в буфере для лизиса эритроцитов (0,155 М NH4Cl, 5,7 мМ K2HPO4, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,3) и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Для удаления остатков тканей клеточную суспензию фильтровали через нейлоновую сетку (размер пор 100 мкм; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). После еще одного этапа центрифугирования (10 мин при 200×g) осажденный SVF суспендировали в среде ASC (среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM)/среда F-12 (1:1) с HEPES и L-глютамином (Thermo Fisher). Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), с добавлением 33 мкМ биотина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 17 мкМ пантотената (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 10 нг/мл EGF,1 нг/мл bFGF, 500 нг/мл инсулина, 2,5% фетальной телячьей сыворотки и 12,5 мкМ/мл гентамицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и засевают при плотности 50 000 клеток /см2 в колбах Т175.

После достижения 70 процента слияния клетки промывали PBS и трипсинизировали с использованием 0,05% раствора трипсин-ЭДТА 1x (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Трипсин инактивировали добавлением среды ASC плюс 10% FBS и удаляли центрифугированием при 300×g в течение 5 минут перед посевом клеток при плотности 5000 клеток/см². ASC снова выращивали до 70-процентного слияния перед разделением. ASC в пассажах 3-4 использовали в этом исследовании. Клетки обрабатывали различными концентрациями метформина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), рапамицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) или ингибитора U0126 согласно экспериментальной схеме.

2.3. Адипогенная дифференциация

Для индукции адипогенеза ASC высевали с плотностью 50,000 клеток/см² в 6-луночные планшеты для культивирования клеток. Адипогенез индуцировали с использованием среды для дифференцировки, состоящей из 0,2 мкМ инсулина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 0,5 мМ 1-метил{{9 }}изобутилксантин (IBMX) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 0,25 мкМ дексаметазона (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 10 мкг/мл трансферрина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США) Луи, Миссури, США) в ASCmedium. Через 3 дня дифференцировки среду меняли и клетки культивировали в среде для дифференцировки без IBMX в течение 14 дней.

2.4. Культура жировой ткани

Культивирование жировой ткани проводили в 6-луночных планшетах для культивирования клеток с некоторыми модификациями, как опубликовано Harms et al. [30]. Целую жировую ткань нарезали на более мелкие кусочки размером 3-5 мм и культивировали в 5 мл среды для культивирования клеток. Клеточные фильтры с размером пор 70 мкМ держали над фрагментами ткани, чтобы ткань оставалась погруженной в среду. Фрагменты ткани расщепляли коллагеназой, как описано выше для процедуры выделения ASC, и SVF анализировали на экспрессию генов стволовости, связанных с ASC.

2.5. Окрашивание масляным красным O

Для визуализации липидных капель клетки фиксировали 4-процентным параформальдегидом в PBS в течение 1 часа и окрашивали 0,3-процентным Oil Red O (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в изопропаноле/воде ( 60:40) на 1 ч. Окончательную промывку проводили дважды дистиллированной водой. Для количественного определения абсорбированного Oil Red O краситель элюировали изопропанолом (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и измеряли оптическую плотность при 518 нм.

2.6. Бодипи окрашивание

На 14-й день после индукции адипогенеза клетки окрашивали Bodipy (Invitrogen, Waltham, MA, USA) и Hoechst (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в течение 30 минут при 37°С. Изображения были получены с помощью флуоресцентного микроскопа и проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ.

2.7. ФлоуЦитометрия

ASC в третьем пассаже использовали для проточного цитометрического анализа на поверхностную экспрессию CD29 (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США), CD90 (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США), CD45 (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). , CD24 (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США) и CD31 (BD, Нью-Джерси, США). Клетки обрабатывали трипсином, промывали PBS и окрашивали антителами в буфере для окрашивания FACS (1% BSA в PBS). Неокрашенные ASC использовали в качестве контроля. Флуоресцентный сигнал измеряли с помощью проточного цитометра (Fortessa, BD, Франклин-Лейкс, Нью-Джерси, США), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (BD, Франклин-Лейкс, Нью-Джерси, США).

2.8. Остеогенная дифференциация

ASC выращивали до слияния в {{0}}луночных планшетах, а остеогенную дифференцировку индуцировали с использованием остеогенной среды (DMEM, 10% FBS, 0,1 мкМ дексаметазона, 10 мМ глицеринфосфата и 50 мкМ аскорбиновой кислоты). На 21-й день после дифференцировки клетки фиксировали в 4-процентном параформальдегиде (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и окрашивали ализариновым красным красителем (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). был выполнен с использованием программного обеспечения Image J.

2.9. Обнаружение апоптоза с помощью окрашивания аннексином V-APC/PI.

Апоптотическую гибель клеток измеряли с использованием набора Annexin V-APC/PI (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США). В общей сложности 10,000(клеток/лунку) ASC высевали на 6-луночные планшеты и инкубировали при 37°С с 5% CO2. Клетки обрабатывали метформином (0,25 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 2,5 мМ и 5 мМ) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Через 72 ч обработки клетки собирали путем трипсинизации и окрашивали 2,5 мкл AnnexinV-APC и 2,5 мкл буфера для связывания PIin, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15–20 минут и анализировали с помощью проточной цитометрии (Fortessa, BD, NJ, USA).

2.10. Обнаружение реактивных форм кислорода

Уровни АФК определяли с использованием зонда флуоресцентного красителя 2',7'-дихлорфлуоресцеиндиацетата (DCFH2-DA) (Invitrogen, Waltham, MA, USA). ASC (10 000 клеток/лунку) культивировали в 6-луночном планшете и инкубировали с метформином (5 мМ) при 37°С, 5% СО в течение 72 часов. После инкубации ИСК обрабатывали трипсином и окрашивали 50 мкМ красителя DCFH2-DA в течение 30 мин при 37°С и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

2.11. Окрашивание TMRM

ASCs (10, 000 клеток/лунку) культивировали в 6-луночном планшете, обрабатывали различными дозами метформина (5 мМ) в течение 72 ч и инкубировали при 37°С с 100 нМ TMRM (Sigma-Aldrich , Сент-Луис, Миссури, США) в течение 30 мин при 37°С. После инкубации клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Image] использовали для количественной оценки флуоресценции микроскопических изображений.

2.12. Количественная экспрессия генов ОТ-ПЦР

Тотальную РНК выделяли с помощью набора RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany), а синтез кДНК осуществляли с помощью набора для синтеза кДНК RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Ген-специфические праймеры были приобретены у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США. Количественный анализ экспрессии проводили с использованием Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Количественную оценку мРНК проводили с использованием -актина для нормализации. Данные для транскриптов каждого гена нормализовали путем вычисления разности (ACt) между генами Ct-домашнего хозяйства и Ct-мишенями. Относительное увеличение или уменьшение экспрессии рассчитывали путем сравнения эталонного гена с геном-мишенью (AACT) с использованием формулы для относительной экспрессии (=24ACt).

2.13. Вестерн-блот

Вестерн-блот анализ выполняли в основном так, как описано [19]. Метод, используемый для нормализации уровней белка, представлял собой «набор для анализа белка Пирса ВСА» (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Клеточные лизаты (15 мкг общего белка на дорожку) готовили в буфере для образцов с додецилсульфатом натрия (SDS), разделяли с помощью SDS-PAGE и наносили на поливинилидендифторидные мембраны. Использовали следующие антитела: мышиные антитела к -актину человека (Proteintech, IL, USA), перилипин (Cell Signaling, MA, USA), фосфор-P70S6K (Cell Signaling, MA, USA), тотальный P70S6K (Cell Signaling, MA, USA). США), pERK1/2 (Cell Signaling, Массачусетс, США), общий ERK1/2 (Cell Signaling, Массачусетс, США), конъюгат антимышиного IgG HRP (Proteintech, IL, USA) и кроличий антикрысиный IgG HRP ( Протеинтек, Иллинойс, США). Программное обеспечение Image J использовалось для денситометрического анализа. 2.14.Статистический анализ

Статистический анализ проводили в GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США). Для анализа FACS использовали FlowJo. Значимость разницы между средними оценивали с помощью t-критерия Стьюдента или дисперсионного анализа. Чистая ошибка представлена ​​как среднее значение ± SEM. Значения были значимыми при значениях p<><0.01 and=""><>

3. Результаты

Метформин является хорошо зарекомендовавшим себя антидиабетическим препаратом, который, как было показано, играет важную роль в увеличении продолжительности жизни [31]. Чтобы изучить влияние лечения метформином на стволовость стволовых клеток, полученных из жировой ткани, мы выделили ASC из жировой ткани доноров-людей путем расщепления коллагеназой. Выделенные ASC были прикреплены к пластику и имели фибробластную или веретенообразную морфологию. Анализ проточной цитометрии показал, что ASC были положительными в отношении маркеров мезенхимальных стволовых клеток, таких как CD29, CD90 и CD24, но отрицательными в отношении маркера кроветворной линии CD45 и маркера эндотелиальной линии CD31 (рис. 1A). В дополнение к отображению типичного фенотипа ASC, ASC показали сильный адипогенный и остеогенный потенциал дифференцировки, идентифицированный окрашиванием Bodipy и Alizarin Red S соответственно (рис. 1B).cistanche แอ ม เว ย์Охарактеризованные ИСК были использованы для дальнейших экспериментов в нашем исследовании.

В литературе сообщалось, что метформин снижает адипогенную дифференцировку стволовых клеток. Мы стремимся изучить регуляцию дифференцировки ASCs адипоцитами при лечении метформином. ASC обрабатывали 1, 2,5 и 5 метформином, начиная за 2 дня до адипогенной индукции и на протяжении всего процесса дифференцировки. Красители Bodipy и Oil Red Otain использовались для визуализации капель масла на 14-й день после индукции дифференцировки. Результаты окрашивания Oil Red O (рис. 1C) и окрашивания Bodipy (рис. 1D) показывают, что лечение метформином значительно ингибирует адипогенную дифференцировку дозозависимым образом по сравнению с контрольными клетками. Ингибирование адипогенной дифференцировки было дополнительно подтверждено с помощью вестерн-блоттинга маркерного белка дифференцировки адипоцитов перилипина. Для этого из дифференцированных клеток на 14-й день адипогенной дифференцировки собирали клеточные лизаты и анализировали экспрессию перилипина. Наши результаты вестерн-блоттинга показывают значительное снижение экспрессии перилипина при лечении метформином во время адипогенной дифференцировки (рис. 1E), что коррелирует с уменьшением окрашивания Bodipy и Oil Red O. Мы пришли к выводу, что лечение метформином ингибирует адипогенную дифференцировку ASC человека, при этом величина ингибирования положительно коррелирует с дозой лечения метформином.

Более высокие скорости дифференцировки и пролиферации приводят к потере стебля. Поскольку мы наблюдали, что метформин снижает адипогенную дифференцировку, нам было интересно изучить влияние лечения метформином на пролиферацию ASC in vitro. ASC обрабатывали метформином, и клетки подсчитывали на 4-й день после культивирования в присутствии или в отсутствие метформина. Исходя из наших результатов, мы заметили, что метформин значительно снижает скорость пролиферации клеток по сравнению с контрольными ASC (рис. 2А). Стволовые клетки играют важную роль в регенерации и поддержании тканей.сколько цистанхе приниматьЧтобы эффективно выполнять свою регенеративную роль, стволовые клетки должны сохранять свои характеристики стволовости. Мы проанализировали влияние лечения метформином на экспрессию генов стволовости в ИСК. С этой целью мы использовали количественную ПЦР в реальном времени для анализа генов, связанных с поддержанием стволовости в ASC. Мы наблюдали, что метформин значительно повышал экспрессию маркеров жировых стволовых клеток, таких как BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 и DLK1, по сравнению с контрольными ASC (рис. 2B). Наши результаты показывают, что лечение метформином эффективно замедляет пролиферацию ASCs, тем самым предотвращая истощение пролиферации клеток за счет усиления экспрессии генов-сигнатур стволовости.

Рисунок 1. Лечение метформином ингибирует адипогенную дифференцировку АСК дозозависимым образом. (A) ASC были протестированы на экспрессию CD29, CD90, CD24, CD31 и CD45 с помощью проточной цитометрии. Представлены как процент положительных результатов, показанный на гистограммах, так и средняя интенсивность флуоресценции (MFI), показанная в таблице для контроля (неокрашенные ASC) и окрашенного (ASC, обработанные соответствующими антителами). (B) ASCs подвергали адипогенной или остеогенной дифференцировке с использованием коктейлей дифференцировки, специфичной для линии. Дифференциация в линию адипоцитов была подтверждена окрашиванием Bodipy, а остеогенез подтвержден окрашиванием ализариновым красным. Процент площади, окрашенной ализариновым красным, был рассчитан с использованием изображения J. (C) ASC обрабатывали коктейлем для дифференцировки адипоцитов в присутствии или в отсутствие различных доз метформина в течение 14 дней. Развитие адипоцитов на 14-й день после индукции оценивали путем окрашивания капель липидов с использованием красителя Oil Red O. Абсорбированное пятно Oil Red O экстрагировали и измеряли оптическую плотность. Оптическую плотность контрольных ASC принимали за 100 процентов, и наносили на график относительное изменение при лечении метформином (n =3). (D) Содержание липидов на 14-й день определяли с помощью красителя Бодипи (зеленый). Hoechst (синий) использовали для окрашивания ядер.что такое цистанхе(E) Вестерн-блот анализ экспрессии белка перилипина. -Актин использовали в качестве контроля загрузки. Количественная оценка плотности полос белка перилипина, нормализованная по отношению к -актину, использовалась. Изображение J. Изображения и графики являются репрезентативными для трех независимых повторов (n=3). *п<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">

Чтобы исключить, что снижение дифференцировки и пролиферации не связано с каким-либо цитотоксическим действием метформина на ИСК, мы проанализировали жизнеспособность обработанных метформином клеток. Анализ окрашивания аннексина V/PI с помощью проточной цитометрии не показал значительного увеличения количества апоптотических или некротических клеток при обработке увеличивающимися концентрациями метформина до 5 по сравнению с контрольной средой для культивирования клеток (рис. 3А). Митохондриальная активность и образование активных форм кислорода (АФК) важны для дифференцировки клеток, и во время адипогенной дифференцировки наблюдались повышенные уровни митохондриального метаболизма и образования АФК [32]. Исходя из наших результатов, мы заметили, что лечение метформином снижает адипогенную дифференцировку АСК. Затем мы исследовали влияние на митохондриальную активность и продукцию АФК. ASC обрабатывали метформином и окрашивали TMRM для оценки активности митохондриальных мембран и DCF2DA для оценки концентрации АФК. Изображения с флуоресцентного микроскопа и количественная оценка флуоресцентного сигнала показали, что лечение метформином значительно снижает митохондриальную активность (рис. 3B, C) и продукцию АФК (рис. 3D, E). Мы пришли к выводу, что опосредованное метформином снижение митохондриальной активности и продукции АФК способствует увеличению стволовости АСК.

Чтобы понять возможный сигнальный каскад, ответственный за снижение дифференцировки, пролиферации и активацию генов стволовости в ASCs при лечении метформином, мы сосредоточились на сигнальных каскадах mTOR, аутофагии и внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ERK). Предыдущие исследования показали важную роль этих путей в поддержании стволовости в ASCs [19,33]. Передача сигналов ERK и mTOR играет важную роль в стимулировании клеточной пролиферации и дифференцировки. После обработки ASC различными дозами метформина собирали клеточные лизаты и проводили вестерн-блоттинг на LC3, фосфорилированную киназу p70S6, общую киназу p70S6, фосфорилированную ERK42/44 и общую ERKp42/44 антитела. Бета-актин использовали в качестве гена домашнего хозяйства. Вестерн-блоттинг показал, что по сравнению с контрольными ASC лечение метформином подавляло экспрессию фосфорилированной p70S6K и фосфорилированной киназы ERK42/44 (рис. 4A, B, D). Передача сигналов ERK и mTOR играет важную роль в регуляции пути аутофагии.биофлавоноидыРезультаты вестерн-блоттинга показали, что лечение метформином усиливает активность аутофагии в ASCs (рис. 4A, C). Далее мы проанализировали экспрессию генов пути аутофагии при лечении метформином на уровне мРНК с использованием количественной ПЦР в реальном времени. С помощью анализа qPCR мы наблюдали значительное увеличение генов пути аутофагии VMP1, P62, ATG5 и ATG7 при лечении метформином (рис. 4E), что согласуется с увеличением активности аутофагии, показанным в наших результатах вестерн-блоттинга. В наших анализах также наблюдалось незначительное увеличение экспрессии ATG 9. Мы пришли к выводу, что лечение метформином снижает активность ERK и mTOR и усиливает аутофагию в ASCs как возможный основной механизм снижения пролиферации и дифференцировки и повышения стволовости.

Чтобы подчеркнуть прямую роль передачи сигналов ERK и mTOR в опосредованном лечением метформином ингибировании дифференцировки и увеличении стволовости в ASC, мы раздельно ингибировали передачу сигналов ERK и путь mTOR, используя ингибитор ERK U0126 и рапамицин, соответственно, и проанализировали влияние на ASC. дифференцировка и стволовость [19,33]. Добавление ингибитора ERK U0126 во время дифференцировки ASC в адипоцитах привело к значительному снижению дифференцировки, о чем свидетельствуют изображения, окрашенные Bodipy, и количественная оценка флуоресценции (рис. 5A, B). Результаты количественной ПЦР в реальном времени показывают активацию генов стволовости при специфическом ингибировании, опосредованном ингибитором. передачи сигналов ERK (рис. 5C) еще раз подтвердили наши выводы о том, что подавление пути ERK при лечении метформином способствует увеличению стволовости.

Затем мы использовали рапамицин, хорошо известный ингибитор пути mTOR, который может активировать аутофагию, и оценили влияние на экспрессию генов адипогенеза и стволовости [19]. Клеточные лизаты ASC, обработанных рапамицином, собирали и исследовали с помощью фосфорилированной киназы p70S6, общей киназы p70S6 и антител к -актину. Мы наблюдали, что рапамицин подавлял экспрессию фосфорилированной киназы p70S6 (рис. 6А). Для определения функциональной роли в адипогенной дифференцировке АСК обрабатывали рапамицином и индуцировали адипогенной средой. Через 14 дней клетки окрашивали красителем Bodipy для оценки адипогенеза. Мы наблюдали, что лечение рапамицином значительно снижало адипогенную дифференцировку (рис. 6В, С). Затем мы проанализировали влияние блокировки передачи сигнала mTOR на стволовость ASC. С этой целью ASC обрабатывали рапамицином и использовали ПЦР в реальном времени для измерения экспрессии транскриптов, связанных со стволовостью. Мы наблюдали, что рапамицин значительно повышал экспрессию маркеров, связанных со стволовостью (рис. 6D). Мы пришли к выводу, что ингибирование путей как ERK, так и mTOR способствует снижению дифференцировки адипоцитов и увеличению стволовости в ASC человека.

Затем мы проверили, можем ли мы воспроизвести эффекты лечения метформином, повышающие стволовость, на 2D-культивируемых ASC в более сложной и транслируемой in vivo модели культуры цельной жировой ткани. Для этого мы модифицировали протокол культивирования жировой ткани, опубликованный Harms et al. 30], используя сетчатые фильтры для клеток вместо вставок Transwell, чтобы фрагменты жировой ткани были погружены в среду (рис. 7A). После культивирования 3-5 мм фрагментов жировой ткани человека с метформином или без него в течение 5 дней мы выделили стромально-васкулярную фракцию (СВФ) путем расщепления фрагментов жировой ткани коллагеназой и проанализировали экспрессию генов, связанных со стволовостью. Данные ПЦР в реальном времени показали, что SVF из жировой ткани, обработанной метформином, продемонстрировал значительное повышение экспрессии маркеров стволовости, таких как BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR и Wnt2 (рис. 7B). ).

4. Дискуссия

Жировые стволовые клетки (ASC) регенерируют жировую ткань посредством самообновления и дифференцировки, тем самым поддерживая пул стволовых клеток ткани. Однако старение и ожирение связаны с потерей свойств стволовости в ИСК. Метформин является противодиабетическим препаратом и показал многообещающие результаты в качестве средства против старения. Мы сосредоточились на анализе влияния метформина на стволовость САС и понимание лежащего в их основе механизма с целью установить, что метформин является потенциальным средством для поддержания стволовости САС с возрастом. Для облегчения переноса наших результатов на людей мы использовали двумерную модель клеточной культуры человеческих ASC и использовали метод культуры жировой ткани человека для моделирования более сложной тканевой среды. В качестве источника ткани для наших исследований мы использовали подкожную жировую ткань. Используя эти разнообразные методы культивирования клеток и тканей, мы изучили влияние лечения метформином на стволовость ИСК.

Ожирение вызывает изменение кинетики дифференцировки ASC, что снижает пул стволовых клеток. Наши результаты показали, что по сравнению с необработанными ASC лечение метформином снижает скорость адипогенеза дозозависимым образом. Это наблюдение согласуется с более ранними сообщениями, которые показали, что метформин ингибирует адипогенез в жировых стволовых клетках, стромальных клетках костного мозга, стволовых клетках периодонтальной связки и клеточных линиях 3T3 [34-37]. Скорость пролиферации стволовых клеток играет важную роль в поддержании пула стволовых клеток, стволовости и способности к самообновлению. Мы наблюдали, что метформин ингибирует пролиферацию ASC, не вызывая какого-либо цитотоксического действия на ASC, что согласуется с другими исследованиями, опубликованными на стволовых клетках, полученных из жировой ткани мышей [28], стромальных клетках и фибробластах [38,39].купить цистанхеНедавнее исследование с использованием стволовых клеток, полученных из жировой ткани лошадей, показало пролиферативный эффект метформина [27]. Наиболее вероятным объяснением этих противоречивых наблюдений является различие в донорских видах и анатомическом месте сбора клеток, поскольку ASC лошади собирали из хвоста. Агнешка Шмишек и др. наблюдали, что метформин ингибирует пролиферацию клеток и способствует гибели клеток при увеличении доз (5 и 10 мМ) в стромальных клетках, полученных из костного мозга мыши, и в линии эмбриональных фибробластов Balb/3T3 [40]. Кроме того, метформин ингибирует пролиферацию сателлитных клеток, выделенных из мышц мышей |41. Подтверждая наше наблюдение, Min-lung Park et al. сообщили, что метформин улучшает противовоспалительное свойство ИСК человека за счет снижения уровней экспрессии IL-1, IL-6 и TGF-; метформин также увеличивает выживаемость трансплантированных ASC и защищает от апоптотической гибели клеток [42]. Эти результаты указывают на различное влияние лечения метформином на жизнеспособность клеток, полученных от разных видов, и на то, что ASC человека устойчивы к потенциальным цитотоксическим эффектам лечения метформином.

Дифференцировка АСК в адипоциты связана с более высокими потребностями в энергии и скоростью метаболизма, что приводит к более высокой митохондриальной активности и продукции АФК. АФК играют критическую роль в поддержании покоя и стволовости взрослых стволовых клеток, поскольку более высокие уровни АФК подталкивают клетки к дифференцировке и, в конечном итоге, к старению стволовых клеток и гибели клеток [43]. Мы наблюдали, что метформин значительно снижает потенциал митохондриальной мембраны и образование активных форм кислорода. В соответствии с нашими данными, в более ранних исследованиях также сообщалось, что метформин снижает окислительный стресс и улучшает экспрессию антиоксидантов в эмбриональных фибробластах мыши [44], ASC мыши [38] и эндотелиальных клетках аорты человека [45]. Более того, в соответствии с нашим исследованием, Chien-Hung Lin et al. сообщили, что метформин действует как нейропротекторное средство, снижая окислительный стресс в нервных стволовых клетках человека [46]. Несколько других исследований подтверждают, что метформин действует как антиоксидант, уменьшая окислительный стресс и увеличивая экспрессию антиоксидантных ферментов, таких как супероксиддисмутаза, в мышиных ASC, мышиных миобластах C2C12 и циркулирующих эндотелиальных клетках-предшественниках человека [38,47,48]. Более того, исследование Alejandro Martin-Montalvo et al. подтверждает наше наблюдение, демонстрируя, что метформин значительно ингибирует митохондриальный комплекс, ингибируя митохондриальное дыхание у мышей [49]. Эффекты метформина на образование восстановленных активных форм кислорода, возможно, опосредованы увеличением восстановленного глутатиона [50] в механизме, включающем окислительно-восстановительный процесс. чувствительный фактор транскрипции Nrf2 [51].

Было показано, что метформин способствует состоянию покоя сателлитных клеток за счет снижения метаболизма, необходимого для пролиферации и дифференцировки. Различные исследования также подтверждают, что метформин сильно способствует стволовости и омоложению стволовых клеток [23,39,41,49,52,53]. Также известно, что он значительно улучшает и повышает уровни экспрессии маркеров стволовых клеток. Поскольку мы наблюдали, что метформин ингибирует пролиферацию и адипогенез путем ингибирования окислительного стресса и митохондриальной активности, мы стремились подтвердить, улучшает ли метформин стволовость в ASCs или в модели культуры жировой ткани in vitro. Соответственно, мы наблюдали, что метформин значительно улучшал экспрессию связанных со стволовостью маркеров DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1 и Annexin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 и Mycl в 2D-культуре ASC и моделях культуры жировой ткани. . Использование культуры цельной жировой ткани дает уникальную возможность моделировать in vivo микроокружение ткани человека, где клетки ориентированы в соответствии с их естественной архитектурой и имеют интерактивную поддержку из различных типов клеток, вплетенных в тканевый матрикс. Насколько нам известно, наше исследование впервые демонстрирует эффект усиления стебля при лечении метформином на человеческие ASC как в 2D, так и в целых культурах жировой ткани. Мы рассматриваем наши результаты, показывающие усиление сигнатуры генов стволовости в ASC, выделенных из фрагментов жировой ткани, обработанных метформином, как аргументы в пользу дальнейшего изучения использования метформина в качестве терапии для замедления процесса старения и омоложения состарившихся жировых тканей.

Механическая мишень рапамицина (mTOR) играет ключевую роль в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток. Снижение активности mTOR с помощью генетических манипуляций, терапевтического вмешательства или изменений, связанных с образом жизни, увеличивает стволовость и продолжительность жизни [19,20]. Поскольку мы обнаружили, что метформин ингибирует адипогенез, мы проверили влияние метформина на передачу сигналов mTOR. Интересно, что результаты показали, что метформин значительно снижает уровень фосфорилирования киназы PS70S6, которая является ключевой сигнальной молекулой после mTOR и репортером активности пути mTOR. Более ранние исследования также предполагают, что метформин подавляет адипогенез, ингибируя сигнальный путь mTOR в эмбриональных фибробластах мыши (MEF), мезенхимальных стволовых клетках мыши C3H10T1/2 и преадипоцитах 3T{11}}L1 [34]. Механическая мишень рапамицина состоит из двух комплексов, mTORCl и mTORC2, и передача сигналов играет важную роль в адипогенезе. Показано, что ингибирование передачи сигналов mTORC1 рапамицином нарушает адипогенез за счет снижения фосфорилирования киназы PS6 в преадипоцитах 3T3-L1. Эти исследования также продемонстрировали, что ингибирование передачи сигналов mTOR ингибирует адипогенез путем снижения уровня экспрессии маркеров линии адипоцитов, таких как PPARgamma, CEBPI, CEBP1 и адипонектин [54-56]. Более того, передача сигналов mTOR опосредуется фосфорилированием киназы S6. Было показано, что нокдаун киназы S6 устойчив к ожирению и увеличению веса в условиях диеты с высоким содержанием жиров из-за нарушения адипогенеза [57]. Мы подтвердили наше наблюдение опосредованного метформином подавления активности mTOR как возможного медиатора увеличения стволовости и снижения дифференцировки ASC с помощью рапамицина, который специфически блокирует активность пути mTOR.

Помимо mTOR, сигнальный путь ERK играет решающую роль в пролиферации и адипогенезе. Xiaomin Ning et al. В своей публикации утверждают, что адипогенез активируется передачей сигналов ERK [58]. Поскольку мы заметили, что метформин ингибирует адипогенез и пролиферацию, мы решили исследовать влияние метформина на передачу сигналов ERK. В соответствии с более ранними отчетами наши результаты также показали, что метформин может ингибировать адипогенез посредством подавления передачи сигналов ERK с увеличением экспрессии генов, связанных со стволовостью. Передача сигналов mTOR необходима для пролиферации и дифференцировки клеток и является негативным регулятором аутофагии [{{2]. }}]. Однако потеря аутофагии связана с потерей стволовости, хотя лечение метформином улучшало экспрессию генов, связанных со стволовостью, за счет активации экспрессии связанных с аутофагией маркеров, таких как LC3II. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что метформин нарушает адипогенез, улучшая стволовость в моделях ASC человека или культуре жировой ткани человека посредством активации аутофагии и ингибирования сигнальных путей mTOR. Будущие исследования in vivo на животных и людях, направленные на оценку влияния метформина на биологию ИСС, будут определять адаптацию использования метформина в качестве средства против старения стволовых клеток.

Эта статья взята из Biomedicines 2021, 9, 1782. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines