Метилжасмонат вызывает отчетливую реакцию на гидролизуемые танины, фавоноиды и фитооксилипины в листьях граната (Punica Granatum L.) Часть 2

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Липиды были преобразованы в свободные жирные кислоты и фитооксилипины в листьях граната, обработанных МеЖ.

Помимо флавоноидов и антоцианов, изменения в молекулах липидов также были очевидны в листьях граната через 72- ч после индукции МеЖ (рис. 5а). Из 102 дифференцированно накапливаемых метаболитов 23 представляли собой липиды, жирные кислоты или фитооксилипины (таблица S6). 1)изомер, МАГ (18:3)изомер4,галактозилмоноацилглицерин (DGMG) (18: 2) изомер, DGMG (18: 2) изомер 2, DGMG (18: 2) изомер 3,моногалактозилмоноацилглицерин(МГМГ)(18:2)изомеры и МГМГ(18:2)изомер2 уменьшались в 3-5 раз, когда на листья наносили МеЖ (рис. 5а; таблица S6). Фосфолипиды LysoPC 18: 0 и 18:1 продемонстрировали более чем двукратное увеличение листьев, обработанных МеЖ (таблица S6).

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Экзогенное применение MeJA повысило уровни JA и изолейцина (JA-Ile) в 4,3- раза и в 2,8- раза соответственно в листьях граната (таблица S6). Различные не-JAФито-оксилипины, включая гидропероксиды жирных кислот, эпоксидные жирные кислоты, гидроксижирные кислоты, кетожирные кислоты иацетиленовыйжирные кислоты, заметно повышенные в листьях, обработанных МеЖ (рис. 5а; таблица S6). Повышенное накопление гранатовой кислоты, ПНЖК (18:3), которой много в масле косточек граната, также наблюдалось в листьях, обработанных MeJA (таблица S6).

Рис.3 Уровни флавоноидов и антоцианов изменились приметилприложение жасмоната (MeJA). Метаболиты с повышенным, сниженным и незначительно измененным накоплением (двухкратный порог) в листьях граната, обработанных МеЖ, по сравнению с контрольными образцами, собранными через 72- ч после обработки, окрашены в зеленый, красный, и синий соответственно. Промежуточные пути, которые не были обнаружены в тандемном масс-спектрометрическом анализе жидкостной хроматографии-ионизации с электрораспылением, показаны черным цветом. Пунктирные стрелки указывают на несколько стадий реакции.

Биохимическая характеристика LOX-кандидата для модификации жирных кислот в листьях граната, обработанных МеЖ

Чтобы изучить метаболические гены, которые участвуют в изменении метаболизма жирных кислот на фитооксилипины, транскриптомы листьев граната, обработанных ложным и MeJA, были проанализированы на наличие DEG, которые аннотированы как липазы или LOX. Два гена липазы Pgr004895 и Pgr001125 показали повышенную экспрессию. в транскриптомах через 24- ч после лечения MeJA, и было подтверждено значительное увеличение экспрессии с помощью анализа количественной ПЦР в реальном времени (рис. 5b). С другой стороны, липаза Pgr024441 показала сниженную экспрессию при анализе транскриптома, что не подтверждается результатом количественной ПЦР в реальном времени (рис. 5b). Интересно, что повышенная экспрессия Pgr025417, предполагаемого LOX, наблюдалась в транскриптомах листьев, собранных через 2-ч, 6-ч, 24-ч и 72-ч после обработки МеЖ. (Рис. S1). Анализ количественной ПЦР в реальном времени также показал постоянное увеличение экспрессии Pgr025417 в пределах от 4- до 20- раз в листьях, собранных от 2 до 72- ч после обработки MeJA (рис. 5c).

Цистанхе может улучшить иммунитет

Чтобы определить, участвует ли предполагаемый LOX (Pgr025417) в увеличении продукции фитооксилипина в листьях, обработанных МеЖ, была исследована его последовательность и активность. При анализе аминокислотной последовательности Pgr025417 остатки His, Asn и Ile, соответствующие остаткам, координирующим атом железа в активном центре LOX L-1 сои (Minor et al.1996), были обнаружены в Pgr025417 (рис. 6а). Кроме того, предполагается, что PgrO25417 локализуется в хлоропласте (вероятностная вероятность 0,9096) с расщеплением сигнального пептида между 64 и 65 аминокислотными остатками (рис. 6а). Среди 11 предполагаемых LOX (от 786 до 970 аминокислот), идентифицированных в аннотированном геноме граната5, другие LOX: Pgr025413, Pgr025418, Pgr009839, Pgr016852 и Pgr013780, как предполагается, являются хлоропластами помимо Pgr025417 и группы с LOX типа II, характерными для других растений. (рис.6б). Интересно, что Pgr008562, Pgr025678, Pgr018982 и PgrO18980 сгруппированы с двудольными LOX I типа. Pgr020032 более отдаленно связан с ILOX другого типа (рис. 6b). Для определения ферментативной активности PgrO25417 был проанализирован рекомбинантный белок (906 а.о., ~102 кДа; рис. 6c) с использованием линолевой кислоты в качестве субстрата. Окисленные продукты линолевой кислоты продуцируются Pgr025417, о чем свидетельствует большее поглощение при 598 нм, когда в реакционной смеси присутствует повышенное количество рекомбинантного белка (фиг.6d).

Транскрипционный ответ на экзогенное применение МеЖ в листьях граната

To understand whether the changes in HTs,flavonoids, lipids, fatty acids, and phyto-oxylipins are regulated transcription-ally, transcriptomes of MeJA-and mock-treated pomegranate leaves collected at2-h,6-h,24-h,and72-h were compared and identified 34 transcription factors(TFs) that showed differen-tial expression (Log,FCl>1, скорректированный П<0.05)(table 1);31="" of="" these="" tfs="" also="" exhibited="" significantly="" changed="" expression="" by="" real-time="" qpcr="" analysis="" (fig.7).="" notably,="" a="" zinc-finger="" tf="" pgr009895="" showed="" increased="" expression="" at="" three="" out="" of="" the="" four="" time="" points(2-h,24-h,and="" 72-h)(fig.7a).the="" expression="" of="" pgr002863(pcf5-like),pgr002859(bzip1)and="" pgr006935(auxin="" response="" factor)was="" increased,="" and="" pgro11269="" (myb)="" decreased="" upon="" meja="" elicitation="" at="" two="" time="" points(fig.="" 7a,="" b).both="" pgro09366(anthocyanin="" regu-latory="" c1="" protein/myb)and="" pgro03015(myb)displayed="" increased="" expression="" at="" 6-h,="" but="" decreased="" expression="" at="" 72-h="" (fig.="" 7b).the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" enhanced="" at="" only="" one="" time="" point,including="" pgr009357(2-h),pgr027831="" (2-h),pgr023581(6-h),pgr009363(6-h),pgr000147="" (6-h),="" pgr021507(6-h),="" pgr021504(6-h),pgr020147(24-h),="" pgr025715(72-h),pgr023629(72-h),pgr015728(72-h),and="" pgr004388(72-h)(table="" 1;fig.7b,c).on="" the="" other="" hand,="" the="" expression="" of="" 12="" tfs="" was="" suppressed="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leaves="" at="" one="" time="" point,="" including="" pgr013499="" (2-h),pgr023409="" (2-h),pgr017106(6-h),pgr010911(24-h),pgr017568(72-h),pgr024750(72-h),pgr004878(72-h)pgr002084(72-h),pgr008889(72-h),pgr004532(72-h),="" pgr020131="" (72-h),and="">

Для оценки регуляции транскрипции генов-кандидатов, которые могут функционировать в модуляции путей флавоноидов и жирных кислот/фитооксилипинов при индукции MeJA, сайты связывания TF в промоторных областях генов-кандидатов были предсказаны с использованием PlantRegMap (Tian et al.2020) с TF, биоинформационно идентифицированные из Eucalyptus Grandis, который тесно связан с гранатом в Myrtales (таблица S7). Для PgrO25417 (предполагаемый LOX) было идентифицировано 80 сайтов связывания 65 ТФ, включая обильные сайты связывания для MYB (10 ТФ, 15 сайтов) и WRKY (11 ТФ, 18 сайтов), но без сайтов связывания для биполярных ТФ цинковых пальцев (таблица). С7). Поскольку CHS и CHI расположены в точке входа путей биосинтеза флавоноидов и антоцианов и показали сниженную экспрессию генов при анализе транскриптома и количественной ПЦР в реальном времени (рис. S1 и 4), промоторы предполагаемых CHS (Pgr005566) и CHI (Pgr025966) также были проанализированы на предполагаемые сайты связывания TF. Для CHS существует 104 сайта связывания 76 TF, причем MYB (20 TF, 23 сайта) и LH (13 TF, 23 сайта) являются наиболее распространенными TF (таблица S7). Для CHI существует 93 сайта связывания 78 TF, причем bHLH (16 TF, 23 сайта) и WRKY (13 TF, 13 сайтов) являются наиболее распространенными TF (таблица S7).

Обсуждение

Уникальные метаболические изменения, вызванные экзогенным применением MeJA, предполагают функции HTs, метилированных флавонов/флавонолов и фитооксилипинов в реакции граната на MeJA.

Продемонстрирована роль MeJA в возникновении реакции на стресс у растений (Cheong and Choi 2003). Накопление двух промежуточных продуктов пути ГТ - глюкогаллина и пента-галлоилглюкозы в листьях индуцировалось через 30- ч после применения МеЖ (рис. 2б), что позволяет предположить, что они действуют в ответ на абиотические и биотические стрессы в окружающей среде. Этот результат также подтверждает функцию ГТ в защите граната от абиотических стрессов в тканях кожуры фруктов (Schwartz et al.2009; Habashi et al.2019). В соответствии с увеличением накопления метаболитов HT, шикимата и генов пути биосинтеза HT также наблюдалась повышенная экспрессия (рис. 1). Предыдущая биохимическая характеристика четырех изоформ СДГ виноградной лозы (Vitis vinifera) показала, что только VvSDH3 и VySDH4 могут продуцировать галловую кислоту из 3-дегидрошикимата (Bontpart et al.2016). Согласно нашему анализу транскриптома и количественной ПЦР в реальном времени, PgSDH3_1 и PgSDH3_2, гомологи WvSDH3, но не PgSDH4, гомолог VSDH4, демонстрировали экспрессию, индуцированную MeJA (рис. S1 и 1). . Это наблюдение предполагает, что PgSDH3_1 и PgSDH3_2, вероятно, участвуют в синтезе HTs в ответ на обработку MeJA и стрессы окружающей среды. Кроме того, усиленная экспрессия PgUGT8423 и PgUGT84A24, которые кодируют ферменты, катализирующие обязательный этап биосинтеза HT, с помощью применения MeJA дополнительно подтверждает роль HT в реакции на стресс.

Через 72- ч после индукции МеЖ в листьях граната было обнаружено общее подавление флавоноидов и антоцианов (рис. 3; таблица S6), что противоречит повышенному накоплению этих соединений, наблюдаемому у многих других растений (Pandey et al. и др., 2016 г.; Де Гейтер и др., 2012 г.; Шафик и др., 2011 г.; Флорес и Руис дель Кастильо, 2014 г.; Порту и др., 2015 г.). Однако три метилированных флавона и флаванола: ди-О-метилкверцетин, продающий 5-О-гексозид и хризоэриол-О-гексозил-О-гексозид накапливались в большей степени, несмотря на снижение количества неметилированных биосинтетических предшественников. (Рис.3; Таблица S6). Моно- и ди-O-метилированный кверцетин секретируется трихомами пасленовых, и предполагается, что он защищает растения, возможно, видоспецифичным образом (Wollenweber and Dörr 1995; Рода и др., 2003). Также было показано, что гликозиды хризоберила, лютеолина и апигенина препятствуют питанию водных травоядных листьями Potamogeton lucens (рдест) в анализах in vitro (Erhard et al.2007). Индуцированное накопление метилированныхфлавоны/флавонолыв листьях граната предполагает, что они могут играть роль в стрессовой реакции, вызванной МеЖ, и иметь значение для защиты от ран, патогенов и травоядных у этого вида деревьев.

Помимо ГТ, флавоноидов и антоцианов, дополнительные заметные метаболические изменения включали мобилизацию свободных жирных кислот из липидов и биосинтез фитооксилипинов через 72- ч после применения МеЖ (рис. 5а). Трехкратное увеличение содержания гранатовой кислоты (18:3, цис-9, транс-11, цис{7}}) при индукции МеЖ предполагает потенциальную роль этой ПНЖК с системой трех сопряженных двойных связей в сигнализация стресса или прямая химическая защита растений граната (таблица S6). Одновременное снижение содержания MAG, MGMG и DGMG также позволяет предположить, что гранатовая кислота обычно может быть конъюгирована с этими глицеролипидов в листьях граната (рис. 5а; таблица S6). Что касается фитооксилипинов, то повышение JA и JA-Ile в листьях граната, обработанных MeJA, может быть связано с деметилированием экзогенно нанесенного MeJA с образованием JA, который впоследствии превращается в JA-Ile (таблица S6) (Stuhlfelder et al. .2004). Это также может свидетельствовать о том, что МеЖК может напрямую регулировать биосинтез ЖАК и ее производных в гранате. Сообщается, что летучие соединения, полученные из фитооксилипинов, участвуют в сигнальной реакции на ранение и атаки патогенов (Lim et al.2017). Недавние исследования также выявили прямую антимикробную роль не-JA фитооксилипинов, хотя механистическая основа таких функций до сих пор неясна (Deboever et al. 2020). Индуцибельное производство фитооксилипинов в гранате подтверждает предыдущие наблюдения на других растениях. Остается определить, являются ли эти фитооксилипины биоцидными или стимулируют врожденный иммунный ответ в гранате.

Метаболизм модифицированных флавоноидов и антоцианов, но не фитооксилипина, при индукции MeJA, по крайней мере, частично регулируется на уровне транскрипции.

В соответствии с общим снижением накопления флавоноидов и антоцианов, гены, кодирующие CHS и CHI, два фермента, расположенные в точке входа в биосинтез флавоноидов и антоцианов, показали сниженную экспрессию в листьях, обработанных МеЖ (рис. 4). Интересно, что гранатовый гомолог (PgrO09366) антоцианинового регуляторного белка C1 MYB TF кукурузы первоначально активировался в листьях, обработанных MeJA, через 6- ч, но затем подавлялся в листьях, обработанных MeJA, через 72- ч (таблица 1). ; рис. 7б). Гомолог граната (PgrO10911) MYB TF P кукурузы подавлялся в листьях, обработанных МеЖ, через 24- ч (таблица 1; рис. 7c). Как показали исследования на кукурузе, Cl активирует несколько генов биосинтеза флавоноидов и антоцианов, таких как CHS(C2), дигидрофлавонолредуктаза (A1), антоцианидин 3- O-глюкозилтрансфераза (BZ1) и лейкоантоцианидин-диоксигеназа ( A2) (Лесник и Чандлер, 1998; Сайнс и др., 1997; Кваттроччио и др., 1993). P, с другой стороны, контролирует экспрессию A1, но не BZ1 (Grotewold et al., 1994). У кукурузы C1 (MYB TF) работает совместно с R(bHLH TF), чтобы регулировать экспрессию генов биосинтеза антоцианов (Grotewold et al., 1994). Мол и др., 1998; Гофф и др., 1992). Pgr024750, bHLH TF, также подавлялся в листьях, обработанных MeJA, в 72-h и мог быть потенциальным партнером гомолога C1 граната (таблица 1; рис. 7c). Кроме того, сайты связывания для MYB и bHLH TF были идентифицированы в промоторных областях предполагаемых CHS и CHI граната с помощью биоинформатического анализа (таблица S7). Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что общее снижение содержания флавоноидов и антоцианов, по крайней мере, частично достигается за счет транскрипционного контроля генов раннего биосинтеза.

В листьях, обработанных МеЖ, наблюдалось снижение содержания нескольких глицеролипидов (рис. 5). Тем не менее, гомологи граната (номера доступа в GenBank: XP_031374952 и XP_031374953) арабидопсиса Wrinkled1 (ArWRI1), семейства TF APETALA2 (AP2), который считается «главным» регулятором биосинтеза липидов растений. (Cernac and Benning 2004), одинаково экспрессируется в листьях, обработанных имитацией и MeJA (данные не показаны). Функциональная характеристика ТФ, реагирующих на индукцию МеЖ (таблица 1; рис. 7), потенциально может выявить регулирующую роль метаболизма липидов в листьях граната.

Гранатовый LOX (Pgr025417) с постоянно повышенной экспрессией после экзогенного применения MeJA катализирует окисление жирных кислот и, как было предсказано, локализуется в хлоропласте (рис. 5c и 6). Следовательно, Pgr025417, вероятно, участвует в биосинтезе ЖАК, происходящем в этом субклеточном компартменте (Fig. 6). Из 11 предполагаемых LOX в гранате 5 являются цитозольными (тип I) и 6 являются хлоропластическими (тип II) (рис. 6b). Поскольку фитооксилипины, не относящиеся к JA, синтезируются в цитозоле (Ponce de Le6n et al., 2015), один или несколько типов ILOX могут быть ответственны за превращение PUFA в фитооксилипины, не относящиеся к JA, при индукции MeJA. Учитывая, что LOX(Pgr025417) с устойчивым увеличением экспрессии генов в листьях, обработанных МеЖ, расположен в субклеточном компартменте, отличном от не-ЖК фито-оксилипинов, ферменты, ответственные за продукцию МеЖ-индуцированных не-ЖК фито-оксилипинов, вероятно, не модулируется транскрипционно.

Экзогенное применение MeJA индуцировало транскрипционные ответы в листьях граната

Недавнее исследование арабидопсиса показало, что сложная регуляторная сеть, обогащенная MYC(bHLH), фактором отклика на этилен (ERF) и ТФ семейства MYB, участвует в раннем транскрипционном ответе, индуцированном MeJA (Hickman et al.2017). Гранатовые гомологи ТФ ERF, включая Pgr013499(2-h), PgrO00147(6-h) и PgrO21504 (6-h), и гомологи ТФ MYB, включая PgrO09357 (2-h ), Pgr009366(6-h), Pgr003015(6-h) и Pgr011269 (6-h), были среди ТФ с различной экспрессией в листьях, обработанных МеЖ, собранных в ранние сроки. (табл. 1; рис. 7). Как обсуждалось выше, гранатовые гомологи регуляторных белков флавоноидов и антоцианов кукурузы C1 и P (MYB TF) и TF bHLH показали снижение экспрессии и потенциально могут контролировать общее снижение флавоноидов и антоцианов. Кроме того, промоторная область LOX (PgrO25417) содержит сайты связывания ТФ WRKY, MYB и bZIP (таблица S7), что позволяет предположить, что они могут регулироваться дифференциально экспрессируемыми ТФ, принадлежащими к этим семействам ТФ, в ответ на применение MeJA. .

Сравнительная экспрессия генов и анализ метаболитов листьев, обработанных МеЖ, облегчает изучение различных фенольных путей в плодах.

Понимание метаболических и транскрипционных реакций листьев граната на применение MeJA явно имеет отношение к улучшению здоровья и продуктивности растений (т.е. к производству плодов). Кроме того, сравнительная экспрессия генов и анализ метаболитов листьев, обработанных МеЖ, также дают возможность выяснить регуляцию путей HT, флавоноидов и антоцианов, которые присутствуют как в тканях листьев, так и в тканях плодов (Bar-Ya'akov et al. 2019). ). Фенольные соединения ГТ, флавоноиды и антоцианы вносят большой вклад в благотворное для здоровья человека действие плодов граната, однако контроль их образования и накопления в гранате (для флавоноидов и антоцианов) или любых других видах растений (для ГТ) широко не изучался. ). Например, в предыдущих исследованиях плодов граната, обработанных МеЖ, определялись уровни антоцианов и флавоноидов в плодах после сбора урожая без изучения экспрессии структурных или регуляторных генов, связанных с этими метаболитами (Кушеш Саба и Зарей, 2019; Гарсия-Пастор и др., 2020). ). С другой стороны, текущее исследование выявило TF (например, MYB TF), которые демонстрировали дифференциальную экспрессию в листьях, обработанных MeJA и имитации, с паттернами экспрессии, сходными с таковыми генов биосинтеза HT, флавоноидов и антоцианов (рис. 7; таблица 1). . Эти ТФ потенциально участвуют в регуляции HT, флавоноидных и антоцианиновых путей, что требует дальнейшего изучения в будущем.

Стоит отметить, что наше исследование выявило специфическое увеличение содержания метилированных флавоноидов и общее снижение содержания других флавоноидов в листьях граната, обработанных МеЖ, что свидетельствует о потенциальной роли метилированных флавоноидов в защите листьев граната от патогенов (рис. 3; таблица S6). Предыдущий отчет о плодах граната, обработанных MeJA, показал повышенное накопление флавоноидов, хотя определялось только общее содержание флавоноидов без количественного определения отдельных молекул флавоноидов (Kousesh Saba and Zarei 2019). Таким образом, необходим более глубокий анализ плодов граната, обработанных МеЖ, чтобы можно было провести параллельное сравнение изменений флавоноидов в тканях листьев и плодов. В отличие от повышенного содержания антоцианов в плодах граната после применения МеЖ (Garcia-Pastor et al.2020), уровень антоцианов в листьях, обработанных МеЖ, снизился (рис. 3; таблица S6). Это несоответствие может быть связано с различными ролями, которые антоцианы играют в тканях листьев и плодов при атаках патогенов. Фактически, дифференциальное накопление антоцианов в листьях и плодах подчеркивает необходимость изучения реакции МеЖ в различных тканях граната.

Заключительные замечания

Наше исследование выявило уникальные метаболические изменения ГТ, флавоноидов, антоцианов и фитооксилипинов в листьях граната, вызванные экзогенным применением МеЖ. Транскриптомный и биохимический анализы показали, что, хотя подавление множества флавоноидов и антоцианов происходит, по крайней мере, частично на уровне транскрипции, повышенный биосинтез фитооксилипинов, отличных от JA, вероятно, не контролируется транскрипцией. Эта работа побуждает к дальнейшим исследованиям регуляторной архитектуры метаболизма ГТ, флавоноидов и антоцианов, организации метаболических ответов в листьях граната на применение МеЖ, а также роли, которую метаболиты с индуцированным накоплением играют в передаче сигналов и/или прямой химической защите.

Заявление автора о вкладе LC и LT задумали исследование. LC и WS провели эксперименты. LC, WS и LT проанализировали данные. LC, WS и LT написали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Дополнительная информация Онлайн-версия содержит дополнительные материалы, доступные по адресу https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9.

Благодарности Мы благодарим коллег из Академии сельскохозяйственных и лесных наук Паньчжихуа за предоставленные нам семена граната, использованные в этом исследовании. Мы также благодарим доктора Биньцзе Гэ из Шанхайского ботанического сада Ченшань за помощь в идентификации и регистрации экземпляра ваучера.

Финансирование Эта работа была поддержана Комиссией по науке и технологиям муниципалитета Шанхая в рамках гранта 14DZ2260400 и Специальным фондом научных исследований Шанхайского административного бюро ландшафтного дизайна и внешнего вида в рамках грантов G172403 и G182403.

Доступность данных и материалов Наборы данных транскриптома, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны в архиве чтения последовательностей (SRA) в NCBI под инвентарным номером PRJNA600139. Наборы данных профилирования метаболитов, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, включены в эту опубликованную статья и дополнительные файлы к ней.

Эта статья взята из Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9