Морфологический анализ экспрессии нефрина при прогрессирующей гломерулонефропатии

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Абстрактный:

В этом исследовании мы сосредоточились на нефрине, одной из ключевых молекул внутри щелевой диафрагмы подоцитов, поскольку, хотя были сообщения о его экспрессии у людей и крыс, их присутствие у обыкновенных мартышек не сообщалось. Мы исследовали экспрессию нефрина и изменения в клубочках в зависимости от развития спонтанной прогрессирующей гломерулонефропатии у обыкновенных мартышек. Были оценены девятнадцать обыкновенных мартышек в возрасте от двух до десяти лет. Почку исследовали с помощью микроскопии с гематоксилином и эозином и иммуногистохимического окрашивания на нефрин. Повреждения были классифицированы по трем классам в соответствии с системой классификации поражений почек, о которой сообщалось ранее. Нефрин-положительную область измеряли с помощью морфометрического анализа и рассчитывали нефрин-положительный коэффициент. Экспрессия нефрина наблюдалась вдоль гломерулярной капиллярной петли в виде непрерывного линейного рисунка при степени поражения почек от 0 до 2 и либо прерывистой линейной, либо грубозернистой картины при степени 3. Экспрессия нефрина имела тенденцию к значительному снижению в зависимости от степени поражения почек. . Предполагается, что изменение экспрессии нефрина играет важную роль в прогрессировании почечных поражений.

Ключевые слова:нефринмартышка,гломерулонефропатия, почка, патология

Польза цистанхе пустыниа такжеЦистанхе растениехорошо дляпочка

Введение

Известно, что спонтанная прогрессирующая гломерулонефропатия у обыкновенных мартышек (Callithrix jacchus) часто возникает, начиная с двухлетнего возраста, с прогрессированием тяжести поражения с возрастом. Ранее мы сообщали о первичных и прогрессирующих поражениях нефропатией у обыкновенных мартышек1. Первичные гломерулярные изменения на ранней стадии нефропатии характеризуются сглаживанием ножек подоцитов и частичным утолщением базальной мембраны клубочков, что, как предполагается, вызывает утечку белка из клубочков, и могут наблюдаться при ультрамикроскопии, но не при световой микроскопии1-3. Кроме того, иммуноглобулин играет важную роль в прогрессировании нефропатии1, 2. IgM откладываются в мезангии на ранней стадии гломерулонефропатии, и после первого отложения IgM область отложения распространяется на весь клубочек, а IgA и IgG депонируется с прогрессией 2. Гиалиновые цилиндры, свидетельствующие об утечке белка из клубочков, можно наблюдать с помощью световой микроскопии при прогрессировании гломерулонефропатии4. Протеинурия усугубляет прогрессирование тубулоинтерстициальных поражений у обыкновенных мартышек 4, как и у людей 5, 6, и, в недавнем исследовании клубочков, протеинурия может быть вызвана нарушениями щелевой диафрагмы, тем самым связывая соседние отростки ножки (ножки) подоцита. Щелевая диафрагма представляет собой межклеточный соединительный комплекс, присутствующий между соседними отростками стопы, и были идентифицированы некоторые молекулы, связанные с его образованием3. Считалось, что снижение экспрессии этих молекул или дисфункция щелевой диафрагмы связаны с прогрессированием протеинурии3. Нефрин, одна из ключевых молекул, экспрессируемых в щелевой диафрагме подоцитов, представляет собой гликопротеин, состоящий из 1241 аминокислоты, и является хорошо известным биомаркером, используемым для мониторинга нарушений щелевой диафрагмы7-10. Молекулы, родственные щелевидным диафрагмам, не изучались при нефропатии обыкновенных мартышек, хотя известно, что у них происходит изменение отростков ножек подоцитов и прогрессирование протеинурии. Более того, были сообщения об экспрессии нефрина у людей и крыс7-12, но не у мартышек. Поэтому мы исследовали экспрессию нефрина в клубочках и изменения экспрессии нефрина в зависимости от прогрессирования поражения с помощью иммуногистохимического анализа.

Цистанхе ТСМ

Материалы и методы

Животные

Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Центрального института экспериментальных животных (CIEA; Кавасаки, Япония) и проводилось в строгом соответствии с Правилами экспериментов на животных CIEA на основе Руководства по надлежащему проведению Эксперименты на животных (Научный совет Японии, 2006 г.). Были оценены девятнадцать обыкновенных мартышек (11 самцов и 8 самок) от CLEA Japan Inc. (Токио, Япония). Их возраст на момент вскрытия колебался от 2 до 10 лет. Животные содержались в клетках в помещении для животных с температурой 26 ± 3 градуса и влажностью 55 ± 20 процентов. Их кормили LCMS-1M (CLEA Japan Inc., Токио, Япония) и водопроводной водой. Животных гуманно умерщвляли под анестезией пентобарбиталом натрия из-за различных причин умирания (таких как синтексис, искривление поясничных позвонков, вывих нижнечелюстного сустава и т. д.). Анализ мочи не проводился, так как не было возможности взять мочу.

гистопатология

почкиперфузировали физиологическим раствором, затем 4-процентным параформальдегидом, а затем фиксировали в 10-процентном нейтральном забуференном формалине для микроскопического исследования. Образцы заливали в парафин, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ). Поражения были классифицированы как гломерулярные, тубулярные и интерстициальные на основании опубликованных критериев1. Степени нефропатии были разделены на четыре группы: 1-я степень (3 мужчины и 1 женщина), 2-я степень (3 мужчины и 5 женщин), 3-я степень (1 мужчина и 3 женщины) и 4-я степень (3 мужчины) (табл. 1).

Для иммуногистохимии моноклональное антитело против внеклеточного домена человеческого происхождениянефрин(1:1,000, нефринg{{0}}, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Даллас, Техас, США) использовали в качестве первичного антитела. Срезы 5- мкм депарафинизировали, регидратировали, обрабатывали 3% перекисью водорода при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем нагревали в автоклаве при 121° в течение 20 мин в целевом растворе для извлечения (pH 6,0, Dako, Glostrup, Дания). После охлаждения срезы инкубировали с первичным антителом при 4 градусах в течение ночи. Конъюгированный с пероксидазой полимер антимышиного и антикроличьего IgG (Histofine Simple Stain Rat MAX-PO(MULTI), Nichirei Bioscience Inc., Токио, Япония) использовали в качестве вторичного антитела для метода на основе полимера13. Срезы инкубировали со вторичным полимерным антителом при комнатной температуре в течение 30 мин и визуализировали продукты реакции, используя 3,3'-диаминобензидин в качестве хромогена. Контрастное окрашивание проводили гематоксилином. Для отрицательного контроля первичное антитело было исключено.

Морфологический анализ

Для морфологического анализа клубочки с воротами клубочков были отправлены на исследование, и на каждом предметном стекле было захвачено от 16 до 28 клубочков (таблица 1) с использованием сканера всего предметного стекла (Aperio AT2, Leica Microsystems Inc., Баффало-Гроув, Иллинойс, США). и соответствующее программное обеспечение для просмотра слайдов патологии (Aperio ImageScope, Leica Microsystems Inc.) с тем же разрешением и размером изображения.нефрин- положительные и целые области клубочков были рассчитаны с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Image-Pro V10, Mediacybenetics Inc., Роквилл, штат Мэриленд, США) путем рисования интересующей области вокруг клубочка, согласно предыдущему отчету14. Всю гломерулярную область определяли как область, которую можно отличить от белого фона. Цветовые пороги для расчетанефрин- положительные области определяли в соответствии с каждым условием окрашивания. Пороговые значения для красного, зеленого и синего цветов составляли 37–67, 31–77 и 32–88 соответственно. Нефрин-положительный коэффициент рассчитывали путем деления измеренийнефрин- положительная область над клубочковой областью. Статистический анализ проводили с использованием теста Джонкхера (уровень значимости: 5 процентов, односторонний тест) для оценки тенденции между степенью нефропатии и выраженностью нефропатии.нефрин.

Костанш

Полученные результаты

Патологические баллы и степени отдельных поражений почек показаны в таблице 1. Как и в нашем первом отчете1, степень поражения имела тенденцию к увеличению с возрастом, и не было явных различий по полу. Результаты иммуногистохимического окрашиваниянефринпоказаны на рис. 1, анефрин- положительное соотношение показано на рис. 2 и в таблице 1. Среди баллов и степеней в таблице 1 степень поражения почек, полученная из общей оценки каждого поражения почек, и оценка гиалиновой повязки использовались для сравнения снефрин- положительное соотношение (рис. 2 и 3). Отдельные случаи в таблице 1 показаны в порядке возрастания степени поражения почек. Экспрессия нефрина наблюдалась вместе с гломерулярной капиллярной петлей в виде непрерывного линейного паттерна на стадиях от 0 до 2 (рис. 1A-C) и прерывистой линейной или грубозернистой паттерна на 3-й степени (рис. 1D). В образце отрицательного контроля положительной реакции нанефриннаблюдалось на любом сайте.

Сравнениенефрин- положительное отношение к степени поражения почек показано на рис. 2. В случаях степени поражения почек 0 среднее значение ± стандартное отклонение (SD)нефрин-положительный коэффициент составил 5,66 ± 1,18 процента, а максимальное, минимальное и медианное значения составили 6,84 процента, 4,27 процента и 5,76 процента соответственно. В случаях 1 степени среднее значение ± стандартное отклонение составило 3,99 ± 1,61%, а максимальное, минимальное и медианное значения составили 5,69%, 1,19% и 4,35% соответственно. В случаях 2 степени среднее значение ± стандартное отклонение составило 3,82 ± 2,25 процента, а максимальное, минимальное и медианное значения составили 6,71 процента, 1,58 процента и 3,49 процента соответственно. В случаях 3 степени среднее значение ± стандартное отклонение составило 2,52 ± 1,02 процента, а максимальное, минимальное и медианное значения составили 3,67 процента, 2,17 процента и 2,17 процента соответственно. В совокупности индивидуальные различия в экспрессии нефрина были небольшими в случаях степени 0, но большими в случаях степени 1 и выше, и спорадически выявлялась низкая положительная экспрессия.нефринэкспрессия имеет тенденцию к снижению в зависимости от степени поражения почек (рис. 2). Отмечалась значительно более низкая тенденция между степенью поражения почек инефрин- положительный коэффициент по тесту Джонкхера (p=0.0166). Оценка гиалиновой повязки в сравнении со степенью поражения почки показана на рис. 3. В случаях с оценкой 0 по гиалиновой повязке среднее значение ± стандартное отклонение положительного отношения нефрина составило 5,40 ± 1,32%, в случаях с оценкой 1 - 4,10. ± 1,70%, а в 2 случаях - 3,37 ± 1,98%. Согласно тесту Jonckheere, наблюдалась значительно более низкая тенденция между показателем гиалиновой повязки и нефрино-положительным отношением (p =0,0654).

Обсуждение

Снижение нефрина коррелировало с прогрессированием поражения почек при развитии гломерулонефропатии игрунок. Антитело против нефрина, используемое в этом исследовании, распознавало внеклеточный домен на N-концевой стороне. Этот внеклеточный домен взаимодействует с молекулами NEPH1 и образует подобную молнии структуру внутри щелевой диафрагмы15. Локализация нефрина в нормальных клубочках происходит вдоль гломерулярной капиллярной петли, а картина окрашивания представляет собой линейный рисунок непрерывных мелких гранул как у крыс, так и у людей 11, 12, 16–18. Окрашивание, выполненное в этом исследовании, является подходящим; что подтверждается наблюдением, что стенки капилляров, контактирующие с мезангиальной областью, не окрашивались, а стенки, контактирующие с подоцитами, окрашивались. При аномальных состояниях, таких как нефротический синдром у людей или пуромициновый аминонуклеозидный нефроз у крыс, картина окрашивания нефрина в клубочках прерывистая и крупнозернистая, а интенсивность иммуногистохимического окрашивания слабее, чем в нормальных клубочках11, 16, 17. В настоящем исследовании паттерн экспрессии нефрина в классах от 0 до 2 был нормальным; однако картина окрашивания при 3-й степени была сопоставима с таковой при аномальных состояниях. В предыдущем исследовании экспрессии гломерулярного нефрина у крыс Crl:CD(SD) с болезнью минимальных изменений экспрессия нефрина была интактной, хотя отростки ножек подоцитов демонстрировали сглаживание при электронной микроскопии без видимых морфологических изменений, наблюдаемых при световой микроскопии18. При распространенном заболевании почек у крыс, хронической прогрессирующей нефропатии (ХПН), было продемонстрировано, что альбуминурия, сопровождаемая ранней стадией ХПН, может приводить к меньшим изменениям гломерулярной проницаемости из-за неспособности реабсорбировать альбумин из проксимальных канальцев19. У людей были проведены некоторые исследования снижения экспрессии нефрина при незначительных изменениях10 или при других заболеваниях почек14,16. С другой стороны, были сообщения об интактной экспрессии нефрина при нефрозе с минимальными изменениями20. Наличие или отсутствие изменения экспрессии нефрина при нефротическом заболевании с минимальными изменениями все еще обсуждается. В действительности было трудно подтвердить увеличение или уменьшение реакции антител нефрина путем визуального наблюдения при нефропатии мартышек, но можно было обнаружить изменение во всей почке с помощью анализа изображений. Наше исследование предполагает, что аномалии щелевидных диафрагм клубочков могут быть связаны с прогрессированием нефропатии у обыкновенных мартышек из-за снижения уровня нефрина. Преобразование положительного окрашивания нефрина из линейного в зернистое наблюдалось у крыс, моделирующих нефротическое заболевание, во время развития поражения11, 16, 21. Выявлена ​​связь между аномалиями щелевой мембраны и протеинурией. часто сообщается22, 23; поэтому было высказано предположение, что протеинурия может быть вызвана дисфункцией щелевой диафрагмы. В нашем исследовании нефропатии мартышек прогрессирование белковой проницаемости клубочков вследствие дисфункции щелевой диафрагмы могло иметь место, поскольку морфологические особенности гиалиновых цилиндров наблюдались только в случаях без тубулоинтерстициальных изменений. В данном исследовании не наблюдалось статистически значимой разницы между оценкой морфологических изменений гиалиновых цилиндров и снижением экспрессии нефрина. Однако экспрессия нефрина имеет тенденцию к снижению в зависимости от оценки гиалиновых слепков, что является индикатором утечки белка из клубочка.

В нашем предыдущем исследовании наблюдалось сглаживание отростков стопы на ранней стадии нефропатии мартышек, а площадь поражения отростков стопы увеличивалась в зависимости от степени поражения почек1. В таблице 2 показана взаимосвязь между скоростью снижения нефрина в этом исследовании и результатами электронной микроскопии для каждой степени поражения почек из предыдущего исследования. Сглаживание, как полагают, происходит из-за разрушения актинового цитоскелета отростков стопы 24 . Нефрин дефосфорилируется при построении щелевой мембраны и связывается с актином через CD2AP и подоцин25, 26. При повреждении щелевой диафрагмы молекулы нефрина группируются, вызывая фосфорилирование нефрина, полимеризацию актина и сглаживание отростков стопы26. Фосфорилирование нефрина также происходит быстро после индукции сглаживания отростка стопы в модели протаминсульфата у мышей 27 . Нефрин представляет собой белок клубочковой адгезии, связанный с созреванием подоцитов, дифференцировкой, формированием отростков и передачей сигналов 24 . Наше исследование показало, что существует корреляция между снижением экспрессии нефрина, определяемой с помощью иммуногистохимии, и прогрессированием степени поражения почек, что свидетельствует о расширении стирания ножки подоцитов. Однако неясно, вызывают ли аномалии в белковом комплексе щелевой диафрагмы повреждение отростков ножек подоцитов или же повреждение подоцитов вызывает изменения в щелевых диафрагмах и снижение нефрина. Поскольку нефрин также участвует в дифференцировке подоцитов, считается, что эта взаимосвязь будет дополнительно прояснена данными о регенерации и дифференцировке подоцитов.

В заключение, наши результаты дают информацию онефринэкспрессия при прогрессирующей гломерулонефропатии у обыкновенных мартышек. Морфологический анализ выявил более низкую тенденциюнефринэкспрессия в подоцитах при прогрессирующей гломерулонефропатии обыкновенных мартышек и изменениенефринпредполагалось, что экспрессия играет важную роль в прогрессировании почечных поражений.

Раскрытие потенциальных конфликтов интересов:

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение:

Авторы хотели бы поблагодарить г-на Такаёси Ито за отличную техническую помощь, которую они оказали. Авторы также благодарят г-жу Канаэ Тамацукури и г-на Джеймса Хараду за языковое редактирование рукописи.

систанч

использованная литература
1. Ямада Н., Сато Дж., Канно Т., Вако Ю. и Цучитани М. Морфологическое исследование прогрессирующей гломерулонефропатии у обыкновенных мартышек (Callithrix jacchus). Токсикол патол. 41: 1106–1115. 2013.
2. Yamada N, Hashimoto N, Kamiie J, Doi T, Sato J, Inoue T, Shirota K, and Tsuchitani M. Взаимосвязь между отложением иммуноглобулина и ранними поражениями прогрессирующей гломерулонефропатии у молодых обыкновенных мартышек. Вет Патол. 55: 173–176. 2018.
3. Кара-Фуэнтес Г., Клапп В.Л., Джонсон Р.Дж. и Гарин Э.Х. Патогенез протеинурии при идиопатической болезни с минимальными изменениями: молекулярные механизмы. Педиатр Нефрол. 31: 2179–2189. 2016.
4. Исобе К., Адачи К., Хаяши С., Ито Т., Миёси А., Като А. и Судзуки М. Спонтанные гломерулярные и тубулоинтерстициальные поражения у обыкновенных мартышек (Callithrix jacchus). Вет Патол. 49: 839–845. 2012.
5. Эдди А.А. Протеинурия и интерстициальное повреждение. Трансплантация нефролового циферблата. 19: 277–281. 2004.
6. Хингорани С., Гули Т., Пао Э., Сандмайер Б. и Макдональд Г. Цитокины в моче после ТГСК: доказательства почечного воспаления в патогенезе протеинурии ипочкаболезнь. Пересадка костного мозга. 49: 403–409. 2014.
7. Кестила М., Ленккери У., Мэнниккё М., Ламердин Дж., Маккриди П., Путаала Х., Руотсалайнен В., Морита Т., Ниссинен М., Херва Р., Каштан К.Э., Пелтонен Л., Холмберг С., Олсен
A и Tryggvason K. Позиционно клонированный ген нового гломерулярного белка --нефрина-- мутирует при врожденном нефротическом синдроме. Мол Ячейка. 1: 575–582. 1998.
8. Лэнгэм Р.Г., Келли Д.Дж., Кокс А.Дж., Томсон Н.М., Холтхофер Х., Зауи П., Пинель Н., Кордонье Д.Дж. и Гилберт Р.Е. Протеинурия и экспрессия белка щелевой диафрагмы подоцитов, нефрина, при диабетической нефропатии: эффекты ингибирования ангиотензинпревращающего фермента. Диабетология. 45: 572–1576. 2002.
9. Валлийский Г.И. и Салим М.А. Нефрин-сигнатурная молекула гломерулярного подоцита? Джей Патол. 220: 328–337. 2010.
10. van de Lest NA, Zandbergen M, IJpelaar DHT, Wolterbeek R, Bruijn JA, Bajema IM и Scharpfenecker M. Потеря нефрина может быть использована для прогнозирования ремиссии и долгосрочного почечного исхода у пациентов с болезнью с минимальными изменениями.ПочкаМеждунар. отчет 3: 168–177. 2017.
11. Kawachi H, Koike H, Kurihara H, Yaoita E, Orikasa M, Shia MA, Sakai T, Yamamoto T, Salant DJ и Shimizu F. Клонирование нефрина крысы: экспрессия в развивающихся клубочках и в протеинурических состояниях.ПочкаМеждунар. 57: 1949–1961. 2000.
12. Luimula P, Ahola H, Wang SX, Solin ML, Aaltonen P, Tikkanen I, Kerjaschki D и Holthöfer H. Нефрин при экспериментальном гломерулярном заболевании.ПочкаМеждунар. 58: 1461–1468. 2000.
13. Джанардан К.С., Дженсен Х., Клейтон Н.П. и Герберт Р.А. Иммуногистохимия в следственной и токсикологической патологии. Токсикол патол. 46: 488–510. 2018.
14. Куп К., Эйкманс М., Баелде Х.Дж., Кавачи Х., Де Хеер Э., Пол Л.С. и Брюйн Дж.А. Экспрессия молекул, связанных с подоцитами, у человекапочкаболезни. J Am Soc Нефрол. 14: 2063–2071. 2003.
15. Gerke P, Huber TB, Sellin L, Benzing T и Walz G. Гомодимеризация и гетеродимеризация белков клубочковых подоцитов нефрина и NEPH1. J Am Soc Нефрол. 14: 918–926. 2003.
16. Doublier S, Ruotsalainen V, Salvidio G, Lupia E, Biancone L, Conaldi PG, Reponen P, Tryggvason K, and Camussi G. Перераспределение нефрина на подоцитах является потенциальным механизмом протеинурии у пациентов с первично приобретенным нефротическим синдромом. Эм Дж. Патол. 158: 1723–1731. 2001.
17. Kawakami H, Kamiie J, Yasuno K, Kobayashi R, Aihara N, and Shirota K. Динамика абсолютного количества нефрина в одном подоците у крыс с пуромицин-аминонуклеозидным нефрозом, рассчитанная с помощью количественного подхода к клубочковой протеомике с выбранным режимом мониторинга реакции. Трансплантация нефролового циферблата. 27: 1324–1330. 2012.
18. Ясуно К., Хонда К., Хакамата С., Кай К. и Мори К. Болезнь минимальных измененийпочкау молодой крысы Sprague Dawley. J Токсикол Патол. 31: 55–59. 2018.
19. Оберт Л.А. и Фрейзер К.С. Участие внутрипочечной ренин-ангиотензиновой системы в патогенезе хронической прогрессирующей нефропатии - преодоление информационного разрыва между дисциплинами. Токсикол патол. 47: 799–816. 2019.
20. Патракка Дж., Руотсалайнен В., Кетола И., Холмберг С., Хейкинхеймо М., Трюггвасон К. и Яланко Х. Экспрессия нефрина у детей.почкаболезни. J Am Soc Нефрол. 12: 289–296. 2001.
21. Саран А.М., Юань Х., Такеучи Э., Маклафлин М. и Салант Д.Дж. Комплемент опосредует перераспределение нефрина и диссоциацию актина при экспериментальной мембранозной нефропатии.ПочкаМеждунар. 64: 2072–2078. 2003.
22. Гальярдини Э., Бениньи А., Томасони С., Аббате М., Каллури Р. и Ремуцци Г. Целенаправленное подавление внеклеточного нефрина при IgA-нефропатии человека. Am J Нефрол. 23: 277–286. 2003.
23. Вакамацу А., Фукусуми Ю., Хасэгава Э., Томита М., Ватанабэ Т., Нарита И. и Кавати Х. Роль кальциневрина (CN) впочкагломерулярный подоцит: ингибитор CN уменьшал протеинурию за счет ингибирования перераспределения CN в щелевой диафрагме. Physiol Rep. 4: e12679. 2016.
24. Гарг П. Обзор биологии подоцитов. Am J Нефрол. 47 (Приложение 1): 3–13. 2018.
25. Ичимура К., Курихара Х. и Сакаи Т. Организация актиновых филаментов отростков стопы в подоцитах крысы. J Гистохим Цитохим. 51: 1589–1600. 2003.
26. Ронко П. Протеинурия: все дело в стопе? Джей Клин Инвест. 117: 2079–2082. 2007.
27. Верма Р., Ковари И., Суфи А., Нихалани Д., Патри К. и Хольцман Л.Б. Вовлечение эктодомена нефрина приводит к активации киназы Src, фосфорилированию нефрина, рекрутированию Nck и полимеризации актина. Джей Клин Инвест. 116: 1346–1359. 2006.