Многопараметрическая МРТ прогрессирования заболевания почек при аутосомно-рецессивном поликистозе почек (ARPKD): модель на мышах и первоначальные результаты для пациентов

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ВВЕДЕНИЕ

Аутосомно-рецессивный поликистоз Болезнь почек(АРПКБП) — редкое, но потенциально летальное и быстро прогрессирующее генетическое заболевание, которым страдает примерно 1/20 000 детей (1,2).АРПКДобычно характеризуется диффузными почечными микрокистами, вызванными расширением собирательных трубочек (2). АРПКДпрогрессирование заболевания почекприводит к снижению функции почек в раннем возрасте. Из 70 процентов больных сАРПКДкоторые доживают до неонатального периода (3), 40 процентов прогрессируют до терминальной стадиипочечныйзаболевание (ХПН) к 15 годам (1,3). Важно отметить, что в настоящее время не существует специфической терапии для пациентов сАРПКДкроме трансплантации почки и диализа (1,2,4). В результате клиническое лечение хроническихБолезнь почек(ХБП) и ее осложнения остаются основным методом лечения пациентов сАРПКД (1,2,4).

Недавно было показано, что несколько новых методов лечения улучшаютБолезнь почекна животных моделяхАРПКДи другие родственные цилиопатии (1,5–9). Однако основным препятствием для проведения клинических испытаний у пациентов с АРПКБП является отсутствие чувствительных показателей АРПКБП.прогрессирование заболевания почеки/или терапевтическая эффективность (1,4). К сожалению, сывороточный креатинин естественным образом увеличивается с возрастом у детей (10,11). Кроме того, рСКФ относительно нечувствительна, особенно для ранней стадии заболевания, и может неточно отражать тяжесть поражения почек (10,11). Кроме того, при многих редких заболеваниях, таких какАРПКД, существует значительная вариабельность темпов снижения СКФ с течением времени. Предварительное исследование, изучающеепрогрессирование заболевания почеку пациентов с АРПКБП обнаружили, что темпы снижения СКФ были относительно умеренными, а также сильно различались в популяции пациентов (в среднем 6 процентов в год, диапазон 1–10 процентов в год) (12). Таким образом, существует клиническая потребность в разработке безопасных и чувствительных мер дляпрогрессирование заболевания почеки, в конечном итоге, терапевтическую эффективность у пациентов сАРПКД.

снизить чувствительность полового членаспродукты растительного экстракта цистанхе

Магнитно-резонансная томография (МРТ) может использоваться для получения изображений почек с высоким разрешением как у пациентов, так и у животных. Важно отметить, что МРТ способна давать изображения с различными контрастами мягких тканей, которые не требуют ионизирующего излучения или инъекционного контрастного вещества (13). МРТ оценки общего объема почек (TKV) уже зарекомендовали себя как маркерпрогрессирование заболевания почеку пациентов с аутосомно-доминантной поликистозной болезнью почек (АДПБП). К сожалению, в отличие от ADPKD, TKV у пациентов сАРПКДне является надежным маркером заболевания, так как размер почек со временем стабилизируется, как и в норме.почечныйпаренхима замещена микрокистами (1,14). За последнее десятилетие для неинвазивной оценки изменений микроструктуры почек, оксигенации, перфузии и тканевого состава использовались количественные методы МРТ, такие как диффузионная МРТ, мечение артериальных спинов (ASL) и релаксометрия МРТ (т. е. картирование T1 и T2). при различных острых и хроническихзаболевания почек.Тем не менее, большинство этих количественных методов МРТ не были тщательно оценены ни на животных моделях, ни на пациентах сАРПКД(1,15–19). В нашей первоначальной работе на модели АРПКБП у крыс PCK мы продемонстрировали, что Т2-взвешенная МРТ надежно измеряетпочечныйкистозное бремя с прогрессирующим кистознымБолезнь почек(1). Тем не менее, кистозныйпрогрессирование заболевания почеку крыс PCK преимущественнопочечныймакроцисты. Эти макрокисты резко контрастируют с диффузными почечными микрокистами, типичными для людей с АРПКБП.Болезнь почек. Поэтому в текущем исследовании мы стремились оценить способность МРТ Т1 и Т2 оценивать почечную прогрессию в почках ex vivo на модели мышей bpk, которая демонстрирует диффузноепочечныйкисты соответствуют человеческимАРПКД Болезнь почек,(9, 20–22) с общей гипотезой о том, что МРТ-карты почек T1 и T2 обеспечат точную оценку кистозных изменений, связанных с прогрессирующей АРПКБП.Болезнь почек. На втором этапе этого исследования мы получили исходные оценки T1 и T2 почек in vivo у пациента сАРПКДи здоровый доброволец для сравнения с доклиническими данными с использованием новой технологии магнитно-резонансной дактилоскопии (MRF).

Ключевые слова:Болезнь почек,почечный, Аутосомно-рецессивная поликистозная болезнь почек, АРПКБП, функция почек, прогрессирование заболевания почек

МЕТОДЫ

Доклинические МРТ-оценки

Модели животных—Все исследования проводились в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по уходу за животными и использованию в Кливлендской клинике и Университете Кейс Вестерн Резерв. Детенышей мыши Bpk подвергали эвтаназии в возрасте 8 (n=5), 14 (n=5) и 18 (n=3) дней путем обескровливания, а почки вырезали и фиксировали в метанол. Почки от гетерозиготных совпадающих по возрасту однопометников также были получены в качестве контроля (в возрасте 8 (n=3), 14 (n=4) и 18 (n=5) дней).

Приобретения МРТ—Доклинические МРТ-эксперименты проводились на МРТ-сканере для мелких животных 7.0 T Bruker Biospec (Bruker, Inc., Billerica, MA). Левую и правую иссеченные почки каждого животного сканировали в центрифужных пробирках, заполненных метанолом. Каждый образец почки помещали с почкой в ​​изоцентр в цилиндрическую передающую/принимающую объемную катушку 35- мм для обеспечения равномерного радиочастотного возбуждения. Аксиальные T2- взвешенные изображения были получены с помощью мультиэхо-спин-эхо, чтобы расположить срезы для количественного сканирования МРТ. Затем для каждой почки мыши получали коронарные карты T1 и T2 с высоким разрешением. Данные T1 были получены с использованием обычного спин-эхо с многократным повторением (TR=10, 000 мс, 5, 000 мс, 2, 000 мс, 1, 000 мс, 500 мс и 3{{60}}0 мс) (23). Дополнительные параметры визуализации T1: время эха (TE)=10,4 мс, толщина среза (TH)=1,0 мм, 12 срезов, поле зрения (FOV)=35 × 35 мм, разрешение в плоскости=0,273 × 0,273 мм/пиксель, количество усреднений сигнала (NSA)=1. Общее время сбора данных для измерения T1 составило 39 минут 54 секунды. Данные T2 были получены с помощью мульти-эхо спин-эхо (12 эхо, TE=52 мс, 63 мс, 73 мс, 83 мс, 94 мс, 104 мс, 115 мс, 125 мс, 136 мс, 146 мс, 157 мс и 167 мс) (24). Подробные параметры изображения T2: TR=2, 000 мс, TH=1,0 мм, 12 срезов, FOV=35 × 35 мм, разрешение в плоскости {{65 }}.273 × 0,273 мм/пиксель. Общее время сбора данных для оценки T2 составило 17 минут и 4 секунды.

После завершения доклинических МРТ репрезентативные почки 8-суточных и 18-однодневных однопометников bpk и WT соответствующего возраста заливали в парафин. Пятимикронные срезы с центром впочечныйhilum были получены и окрашены гематоксилином и эозином (H&E). Срезы визуализировали с помощью световой микроскопии (2-кратное увеличение) и изображений, снятых с помощью подключенной цифровой камеры и импортированных в Adobe Photoshop®.

Изображение и статистический анализ—Данные МРТ ex vivo были экспортированы для автономного анализа в Matlab (The Mathworks, Natick, MA). Количественные карты T1 и T2 были получены путем воксельной линейной подгонки данных изображения методом наименьших квадратов к установленным моноэкспоненциальным моделям магнитной релаксации (23,25,26). Полученные подгонки были визуально проверены, чтобы убедиться в линейности данных. Ручной анализ области интереса (ROI) был выполнен для каждого среза изображения, чтобы рассчитать среднее значение и стандартное отклонение для данных T1 и T2 для каждого среза почки. Количество вокселей почек в каждом срезе изображения использовали для получения средневзвешенных значений по набору срезов изображения. Определяли среднее значение левой и правой почек от каждого животного. Общий объем каждой почки также был рассчитан на основе анализа области интереса T2-взвешенных изображений.

Средние значения T1 и T2 в почках для мышей bpk и контрольных мышей сравнивали по линиям и возрасту мышей с использованием непарных t-тестов Стьюдента. Корреляции Пирсона использовались для определения связи между средними значениями T1 и T2 с объемом почки. Двусторонняя вероятность 0,05 ( ) использовалась для проверки значимости.

Оценка МРТ почек человекаВсе визуализирующие исследования человека проводились в соответствии с утвержденными протоколами Institutional Review Board (IRB) в Кливлендской клинике и университетских больницах – Медицинском центре Кливленда. Для этого первоначального исследования мы набрали одного пациента-подростка с АРПКБП и одного молодого взрослого добровольца (возраст {{0}}). МРТ-исследования человека проводились с использованием МРТ-сканера Siemens Skyra 3.0 tesla (Siemens Healthineers, Эрланген, Германия).

Эксперименты с МРТ почек человека. Каждый субъект сканировался в положении лежа на спине с использованием приемных катушек массива тела и массива позвоночника, чтобы обеспечить однородное качество изображения почек субъекта. Первоначальные локализационные изображения HASTE (половина Фурье, однократное турбо-спиновое эхо) были получены во время инструктированных задержек дыхания во всех трех плоскостях изображения, чтобы получить анатомические изображения как левой, так и правой почки для точного позиционирования среза в последующих изображениях. Затем данные МРТ T1 и T2 для каждой почки были получены для каждой почки с использованием быстрого получения магнитно-резонансной дактилоскопии (MRF). Способ, продемонстрированный Chen, Y. et al. был адаптирован для использования в брюшной полости со следующими параметрами: TR=5,74 мс, TE=1,00 мс, диапазон углов переворота=5–12 градусов, TH { {11}}.0 мм, поле зрения (FOV)=400 × 400 мм, разрешение в плоскости=1.3 × 1,3 мм/пиксель, 1728 изображений MRF, время сбора данных=15 секунд (27). Каждое приобретение MRF приводило к совместной регистрации T1 и

Карты T2 для одного среза изображения (27). Каждый срез MRF располагался параллельно длинной оси каждой почки. Было получено три косых коронарных MRF-изображения левой и правой почек.

Изображение человека и статистический анализ —Изображение человека и статистический анализ. Данные МРТ человека были экспортированы для автономного анализа в Matlab (The Mathworks, Natick, MA). Количественные карты T1 и T2 для приобретений MRF были получены путем повоксельного сопоставления полученных профилей изображений MRF со словарем MRF, как описано ранее (27,28). Никаких других статистических расчетов для этих экспериментальных исследований на людях не производилось.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Репрезентативные картыпочечныйВремя релаксации T1 и T2, а также окрашенные H&E срезы для 18-суточных мышей bpk (A, B, C), 8-суточных мышей bpk (D, E, F ) и 18-дневная мышь дикого типа (G, H, I) показаны на рисунке 1 соответственно. Обратите внимание на диффузную кистозную архитектуру, а также увеличенную кистозную нагрузку и объем почки для почек с бпк. В почках мышей bpk также наблюдается заметное увеличениепочечныйЗначения МРТ T1 и T2 между 8-днями возраста и 18-днями возраста, как и ожидалось, из-за кистозногопрогрессирование заболевания почек.

Средние значения T1 и T2 в почках для каждой возрастной группы как для мышей bpk, так и для мышей дикого типа, построенные в зависимости от возраста, показаны на рисунке 2. Средние значения T1 и T2 для почек bpk были значительно увеличены по сравнению с почками WT в все моменты времени по отношению к возрасту (p < 2="" ×="" 10-10).="" для="" мышей="" bpk="" значительное="" увеличение="" средних="" значений="" t1="" и="" t2="" почек="" также="" наблюдалось="" для="" более="" старых="" почек="" (t1:="" 8="" дней="" по="" сравнению="" с="" 18="" днями,="" p="0,018;" t2:="" 8="" дней="" по="" сравнению="" с="" 14="" днями,="" p="" {{="" 18}}.0002="" и="" 8="" против="" 18="" дней,="" p="0.0009)." напротив,="" соответствующие="" средние="" значения="" почек="" для="" мышей="" wt="" либо="" уменьшались="" с="" возрастом="" (t1:="" 8="" дней="" против="" 18="" дней,="" p="0,03)," либо="" существенно="" не="" менялись="" (t2:="" все="" мыши="" wt,="" p=""> 0,13). . Гистограммы, показывающие компиляцию значений T1 и T2 в почках для контрольных мышей bpk и WT в зависимости от возраста, показаны на дополнительном рисунке 1.

Средние значения T1 и T2 почек для мышей bpk и контрольных мышей WT также нанесены на график как функция общего объема почек (рис. 3 A, B). Как и ожидалось, значения T1 и T2 для почек bpk увеличивались с увеличением объема почки. Средние значения T1 почек для мышей bpk (n=13) привели к значительной линейной корреляции с общим объемом почек (R=0,60, p=0,030). Средние значения T2 в почках имели тенденцию к значительной корреляции с общим объемом почек (T2: R=0,55, p=0,054). Никаких существенных корреляций не наблюдалось между показателями МРТ и общим объемом почек для почек WT.

Исходные карты T1 и T2 для здорового молодого взрослого добровольца и пациента-подростка с АРПКБП показаны на рисунке 4. Обратите внимание на очевидную диффузную кистозную архитектуру, а также очевидное увеличение размера почек пациента с АРПКБП. В почках пациента с АРПКБП наблюдается видимое увеличение Т1 и Т2 по сравнению с почками здорового добровольца. В целом, эти первоначальные оценки МРТ человека для ARPKDБолезнь почексогласуются с результатами доклинической визуализации на рисунках 1–3.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы оценили возможности количественных методов МРТ для оценки кистозной нагрузки при АРПКБП.Болезнь почек. В частности, мы оценили способность средних Т1 и Т2 МРТ почек количественно определять кистозные образования.прогрессирование заболевания почекв хорошо зарекомендовавшей себя животной модели ARPKD, которая демонстрирует прогрессивно увеличивающуюся диффузнуюпочечныймикроцисты. Мы также провели первоначальные исследования для подтверждения концепции пациента с АРПКБП и здорового добровольца. Средние почечные T1 и T2 для почек bpk значительно увеличивались с возрастом в соответствии с гистологией и были значительно выше, чем для почек дикого типа (рис. 1 и 2). Кроме того, оба этих показателя МРТ демонстрировали значимую (Т1) или почти значимую (Т2) корреляцию с общим объемом почек (рис. 3). Что наиболее важно, первоначальные результаты МРТ человека соответствовали этим доклиническим оценкам МРТ (рис. 4). Поэтому, несмотря на необходимость проведения дополнительных продольных исследований изображений у пациентов с АРПКБП для более полной оценки чувствительности и специфичности этих методов МРТ по сравнению с обычными клиническими показателями функции почек (например, сывороточный креатинин), эти доклинические и начальные клинические МРТ Результаты показывают, что МРТ T1 и T2 можно использовать для оценки прогрессирования кистозной почки у пациентов сАРПКД.

Методы МРТ, используемые в этом исследовании, имеют ряд преимуществ для возможных исследований у пациентов сАРПКД. Во-первых, эти методы МРТ являются неинвазивными и не требуют введения контрастного вещества для МРТ, что делает эти методы безопасными для лонгитюдных исследований детей и взрослых пациентов с далеко зашедшими стадиями.Болезнь почек(13). Во-вторых, эти методы МРТ являются количественными и, следовательно, обеспечивают объективную оценку результатов, которые можно использовать в будущих клинических испытаниях. В-третьих, клинические методы MRF, используемые здесь, требуют очень короткого времени сбора данных (~ 15 секунд), что приводит к уменьшению артефактов дыхательных движений, что потенциально устраняет необходимость глубокой седации или общей анестезии для педиатрических пациентов. В-четвертых, методы МРТ Т1 и Т2 доступны практически на всех современных МРТ-сканерах человека. Например, МРТ-оценка T1 использовалась в многочисленных МРТ-исследованиях сердца, легких, печени и других органов (29–35). Таким образом, эти методы могут быть быстро внедрены в многоцентровые клинические испытания для оценки новых методов лечения АРПКБП.

Получение MRF, использованное для получения первоначальных карт T1 и T2 почек человека, показанных на рисунке 4, также обеспечивает многочисленные преимущества для будущих исследований человека.АРПКДисследования. Эта методология была первоначально описана в 2013 году и использует быстрое априорное изменение параметров получения МРТ (например, угол поворота возбуждения) для создания тканеспецифических профилей эволюции сигнала MRF. Затем эти профили сопоставляются с наиболее подходящим теоретическим профилем эволюции сигнала в словаре MRF для получения одновременных оценок времен релаксации T1 и T2 для каждого вокселя изображения. Многочисленные исследования ранее показали, что MRF по своей природе устойчив к артефактам движения и приводит к точной и воспроизводимой оценке времени релаксации T1 и T2 для приложений визуализации мозга, почек, печени и простаты (27,36-39). Для реализации MRF, используемой здесь, мы использовали регистрацию MRF с малым углом наклона, которая обеспечивает точные оценки T1 и T2 без необходимости дополнительных сканирований для компенсации неоднородностей B1 (27,38). Нижние углы наконечника также ограничивают воздействие радиочастотной энергии на объект. Поскольку это получение MRF было выполнено за одну 15-секундную задержку дыхания для каждого среза изображения, карты времени релаксации T1 и T2 не содержали артефактов дыхательных движений. Эти Т1 и Т2 МРТ-оценки также можно комбинировать спочечныйоценка перфузии или другие методы визуализации для более тщательной характеристики АРПКБПпрогрессирование заболевания почек (34).

В то время как эти доклинические и начальные клинические исследования МРТ показывают перспективность использования количественных методов МРТ для оценки АРПКБПпрогрессирование заболевания почек, это исследование также имеет несколько важных ограничений. Основным ограничением доклинической части этого исследования является то, что почки bpk и WT сканировались ex vivo. Хорошо известно, что кровоток может значительно изменить значения T1 и T2 в почках in vivo (40). Таким образом, добавлениепочечныйСигнал МРТ крови, вероятно, изменит средние значения T1 и T2 почек как для мышей bpk, так и для мышей WT. Однако, хотя абсолютные значения времени Т1 и Т2 в почках ex vivo могут несколько отличаться от значений in vivo, различия в значениях Т1 и Т2 между мышами bpk и WT, а также изменения значений Т1 и Т2 в почках при возраст остается значительным. Кроме того, поскольку долгосрочной целью этого исследования является разработка МРТ-маркеров кистозногопрогрессирование заболевания почеку пациентов сАРПКД, этот подход к визуализации ex vivo позволяет первоначально оценить эти методы МРТ T1 и T2 в строго контролируемой среде с ограниченным влиянием на известные переменные, такие как состояние гидратации, сердечный выброс и дыхательные движения, которые могут создавать путаницу с информацией о кистозной болезни в данные МРТ. Сканирование этих почек ex vivo также позволяет получить несколько параметров МРТ (T1 и T2) с очень высоким разрешением и точностью. Таким образом, обычные методы спин-эхо, использованные в этом исследовании для создания карт ex vivo T1 и T2 для почек bpk и WT, требуют значительного времени сбора данных (общее время сканирования=~ 1 час), что нецелесообразно для исследования in vivo на мышах bpk с прогрессирующимБолезнь почек.

В конечном счете, эти доклинические результаты МРТ ex vivo согласуются как с гистологией (Рисунок 1), так и с первоначальными оценками МРТ человека in vivo (Рисунок 4). Таким образом, эти результаты МРТ ex vivo помогают поддержать идею о том, что МРТ-оценки Т1 и Т2 могут быть полезны для оценки АРПКБП.прогрессирование заболевания почеку пациентов.

Основным ограничением клинических МРТ-исследований является небольшой размер выборки. Хотя дополнительные сканирования пациентов, безусловно, необходимы, эти экспериментальные исследования изображений на людях показывают, что получение количественных карт МРТ почек в режимах T1 и T2 с высоким разрешением в практические сроки без седации у педиатрических пациентов возможно. Самое главное, эти и любые другие показатели МРТ необходимо будет сравнить с обычными показателямифункция почек(например, сывороточный креатинин и альбумин) как в поперечных, так и в продольных исследованиях визуализации, чтобы оценить полезность этих методов МРТ для оценки АРПКБП.прогрессирование заболевания почекв многоцентровых клинических исследованиях.

В заключение, это доклиническое и первоначальное клиническое исследование предполагает, что картирование T1 и T2 почек на основе МРТ может использоваться в качестве неинвазивной визуализации для оценки АРПКБП.Болезнь почекпрогресс. Будущие продольные исследования МРТ/МРФ у пациентов с АРПКБП позволят дополнительно оценить чувствительность, специфичность и воспроизводимость этих методов МРТ для выявления и определения стадии АРПКБП.Болезнь почек.В случае успеха эти неинвазивные количественные методы МРТ могут в конечном итоге использоваться в качестве критерия исхода для клинических испытаний, оценивающих новые терапевтические средства, направленные на ограничение или предотвращениеПрогрессирование заболевания почек при АРПКБП.

снизить чувствительность полового члена с помощью цистанхе