Естественная инфекция парвовируса у диких рыболовных кошек (Prionailurus Viverrinus) выявила существующую локализацию вируса в почках

edmund.chen@wecistanche.com

Абстрактный

Протопарвовирус плотоядных-1 (CPPV-1), вид вируса, содержащий варианты вируса панлейкопении кошек (FPV) и парвовируса собак (CPV), широко распространен среди домашних и диких хищников, вызывая системные смертельные заболевания. Дикие кошки-рыболовы (Prionailurus viverrinus), глобально уязвимый вид, были найдены мертвыми. При патологоанатомическом исследовании туш обнаружены поражения кишечника, селезенки ипочечная. Идентификация антигена CPPV-1 в этих тканях с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуногистохимии (ИГХ) подтвердила инфицирование вирусом. ПЦР- и ИГХ-позитивность в ткани почеквыявили атипичную локализацию вируса, в то время как гибридизация in situ (ISH) и просвечивающая электронная микроскопия (TEM) с методом pop-off подтвердили первое описание локализации вируса впочки. Полная характеристика генома и анализ полученных аминокислот CPPV-1, полученных от рыболовных кошек, выявил FPV в качестве возбудителя. Обнаруженные последовательности FPV показали аминокислотные мутации I566M и M569R в капсидном белке. Филогенетический и эволюционный анализ полных последовательностей кодирующего генома показал, что геномы CPPV-1 кошек-рыболовов генетически сгруппированы с геномами FPV, выделенными от домашних кошек в Таиланде. С 1970-х годов также было показано, что эти геномы имеют общую генетическую эволюцию с китайскими штаммами FPV. Это исследование является первым свидетельством инфекции CPPV-1 у рыбацких кошек и первым показывает ее локализацию впочки. Эти результаты подтверждают многохозяин этого парвовируса и предполагают, что смертельные инфекции CPPV-1 могут привести к другим уязвимым диким хищникам.

Ключевые слова: ткань почки; заболевания почек, почки, почечный, почечный тубулярный

Введение

Род Prionailurus, семейство Felidae, классифицируется как группа пятнистых диких кошек небольшого размера, обитающих в Азии [1]. Род Prionailurus включает четыре официально признанных вида диких кошек, включая леопардовую кошку (P. bengalensis), плоскоголовую кошку (P. planiceps), ржаво-пятнистую кошку (P. rubiginosus) и кошку-рыболова (P. viverrinus). [2]. Кошка-рыболов обитает преимущественно в окрестностях болот и мангровых зарослей. Обитает исключительно в Южной и Юго-Восточной Азии и более распространен в Таиланде [3, 4]. В настоящее время популяции рыболовных кошек находятся под угрозой, поскольку водно-болотные угодья, на которых они живут, были уничтожены за последнее десятилетие. В результате этот вид в настоящее время считается уязвимым и занесен в Красный список Международного союза охраны природы (МСОП) [3]. Из-за потери среды обитания колонии кошек-рыболовов мигрируют и иногда живут в районах, где живут домашние животные и люди [5]. Это явление общей среды может привести к усилению распространения патогенов между восприимчивыми дикими и домашними животными и наоборот. Сообщения о вспышках со смертельным исходом у диких или домашних животных, которые могли быть результатом распространения патогенов, были задокументированы за последние несколько десятилетий [6–9]. Таким образом, динамика передачи патогенов от этих животных требует изучения и дальнейшего изучения.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК / ПОЧЕК

Протопарвовирус плотоядных-1 (CPPV-1), вирусный вид, включающий вирус энтерита норок (MEV), парвовирус енота (RPV), вирус панлейкопении кошек (FPV) и варианты собачьего парвовируса (CPV), был признан важным патогеном, связанным со смертельными заболеваниями как в диких, так и в домашних семействах Canidae и Felidae [10, 11]. Предполагается, что FPV, общий патоген видов Felidae, является общим предком CPV [12–14]. CPV часто заражает животных из семейства Canidae, и появляется все больше свидетельств инфекции в семействе Felidae [9, 15, 16]. Ранее предполагалось, что FPV и CPV являются вирусами, ограниченными хозяином. Однако несколько результатов впоследствии показали, что некоторые животные семейства Canidae могут играть роль резервуара для FPV или наоборот [11, 17, 18]. Кроме того, в нескольких отчетах указано, что варианты FPV и CPV (CPV -2a, -2b и -2c) имеют общие уязвимые хосты. Этими хозяевами являются не только домашние животные, но и различные плотоядные виды [15, 19, 20], что указывает на многохозяинный диапазон CPPV-1 [11].

С 1996 по 1997 годы варианты CPV были впервые обнаружены у леопардовых кошек и первоначально были обозначены как парвовирус леопардовых кошек (LCPV), предполагая первое описание CPPV-1 в роду Prionailurus [21, 22]. Было обнаружено, что некоторые из этих штаммов LCPV генетически отличаются от ранее описанных CPV -2a и -2b из-за мутации аминокислоты G300A в капсидном (VP) белке. Это привело к изменению его антигенных свойств, которые теперь используются в качестве уникальной точки мутации для дифференциации CPV-2c от других вариантов CPV [22]. Открытие нового варианта CPV (в настоящее время известного как CPV-2c) у леопардовых кошек подтвердило идею коэволюции CPPV-1 среди видов животных. Позже сообщалось об инфекциях вариантов FPV и CPV у леопардовых кошек [9]. Это позволяет предположить, что другие виды того же рода, что и леопардовые кошки (род Prionailurus), могут быть восприимчивы к инфекции CPPV-1. До сих пор восприимчивость к инфекции CPPV-1 у других видов рода Prionailurus в значительной степени неизвестна. Расшифровка того, как развиваются варианты-1 CPPV и как ведут себя вновь появляющиеся варианты, может помочь выяснить, как предотвратить возможную вспышку нового варианта. Даже если новый вирус распространяется на более широкий круг хозяев, фатальные вспышки или атипичные поражения, связанные с инфекцией, могут наблюдаться у нового восприимчивого хозяина. В этом исследовании описывается смертельная инфекция CPPV-1 у диких рыболовных кошек (Prionailurus viverrinus). Генетическая характеристика полученного CPPV-1 выявляет FPV в качестве возбудителя. Это открытие представляет собой первое свидетельство инфекции FPV у этого вида и раскрывает уникальный клеточный тропизм этого вируса. Дальнейшее выяснение инфекции FPV и ее вариантов у этого вида необходимо для ее объяснения глобальной инфекции у многих уязвимых видов.

материалы и методы

Животные и обычное патологоанатомическое исследованиеВ июне 2019 г. две дикие кошки-рыболовы (P. viverrinus) с номерами случаев. 1 и 2 были найдены мертвыми в пригороде провинции Накхонратчасима, Таиланд. Позже, в августе 2019 года, еще одна кошка-рыболов, обозначенная как №. 3, был спасен из района, где были найдены первые две кошки-рыболовы. Из-за тяжести обезвоживания случай №. 3 умерли во время госпитализации животных. Эти три рыбацкие кошки были отправлены на патологоанатомическое исследование в рамках обычного процесса. К сожалению, образцы свободно гуляющих домашних животных или диких видов, обитающих в том же районе, недоступны; таким образом, они не были включены в это исследование. Рутинное патологоанатомическое исследование было проведено для всех рыболовных кошек. Отдельные жизненно важные органы, включая легкие, печень, сердце, селезенку ипочкабыли отобраны у всех рыболовных кошек, а у рыболовной кошки № 3 дополнительно были собраны кишечник и брыжеечный лимфатический узел. Все отобранные ткани были отправлены на гистологическое исследование и отобраны по отдельности для дальнейших молекулярных анализов. Для гистологии ткани погружали в 10-процентный (об./об.) нейтральный забуференный формалин не менее чем на 24 часа и обрабатывали обычным образом. Затем их окрашивали гематоксилином и эозином.

(H&E) с использованием стандартных процедур перед исследованием сертифицированным ветеринарным патологоанатомом ACVP (TK). Свежие образцы тканей, полученные от трех кошек-рыболовов, хранились при температуре –80°C для проведения молекулярных исследований. Все процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами после одобрения Комитета по уходу и использованию животных Чулалонгкорнского университета (№ 1931036).

Общие вирусологические молекулярные анализыСвежие образцы тканей, включая сердце, легкие, печень, селезенку ипочкавсех кошек-рыболовов плюс дополнительные ткани кишечных и брыжеечных лимфатических узлов кошки-рыболова нет. 3, подвергали экстракции вирусных нуклеиновых кислот путем индивидуальной гомогенизации их 1-процентным (об./об.) фосфатно-солевым буфером (PBS). Затем всю вирусную нуклеиновую кислоту экстрагировали с использованием коммерческого набора для выделения вирусных нуклеиновых кислот II (Geneaid, Тайбэй, Тайвань) в соответствии с рекомендациями производителя. Экстрагированные нуклеиновые кислоты затем квалифицировали и количественно определяли по коэффициенту поглощения A260/A280 с использованием метода спектрофотометрии (NanoDrop, Thermo Scientific™, Уолтем, Массачусетс, США). Все выделенные нуклеиновые кислоты были дополнительно подвергнуты вирусному молекулярному исследованию с использованием анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) с несколькими тестовыми панелями панвирусологического семейства ПЦР, включая обнаружение вируса герпеса [23], парамиксовируса [24], пневмовируса [25], калицивируса. [26], вирус гриппа [27], бокавирус [26, 28], парвовирус [29] и вирус короны [30, 31]. Протоколы ПЦР, реагенты, условия циклирования и положительные/отрицательные контроли, использованные в реакциях, описаны в файле S1. ПЦР, специфичная для гена глицеральдегид- 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) кошек, использовалась в качестве внутреннего контроля, как описано ранее [32]. Впоследствии положительные ПЦР-ампликоны визуализировали с использованием платформы капиллярного электрофореза QIAxcel (Qiagen, Hilden, Germany), как описано ранее [33]. Положительные ампликоны каждого ПЦР-анализа очищали и подвергали двунаправленному секвенированию по Сэнгеру (Macrogen Inc, Сеул, Южная Корея). Из-за умеренного аутолиза тканей провести бактериологическое исследование этих рыболовных кошек не представлялось возможным.

Обнаружение in situ CPPV-1 с использованием иммуногистохимии (IHC), гибридизации in situ (ISH) и трансмиссионной электронной микроскопии (TEM)

Первоначальный вирусологический молекулярный скрининг выявил положительные ампликоны пан-парвовирусной ПЦР, а результаты секвенирования также показали потенциальные последовательности ДНК CPPV-1. Эти результаты побудили нас дополнительно подтвердить наличие CPPV-1 и локализовать распространение CPPV-1 в тканях рыболовных кошек. Ткани, фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE), включая легкие, печень, сердце, селезенку,почкаи кишечник подвергали детекции CPPV-1 IHC с использованием мышиного моноклонального антитела против собачьего парвовируса (ab59832, Abcam, Кембридж, Великобритания) с системой обнаружения пероксидазы хрена (HRP) (полимер EnVision, Dako, Glostrup, Дания). . Вкратце, срезы FFPE нарезали до толщины 4- мкм, а затем депарафинизировали и регидратировали. Затем предметные стекла предварительно обрабатывали, блокировали эндогенную пероксидазу и обрабатывали, как описано ранее [11]. Срезы кишечной ткани кошки, инфицированной FPV, и собаки, инфицированной CPV, использовали в качестве положительного контроля, в то время как идентичные срезы инкубировали с очищенными IgG коз, мышей и кроликов (универсальный реагент отрицательного контроля IHC, код ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Фармингдейл, Нью-Йорк, США) использовали в качестве отрицательного контроля. Взяв во вниманиепочечныйканальцевый некроз присутствует в областях, где наблюдались положительные сигналы CPPV-1 IHC,почкасрезы всех рыболовных кошек подвергали специальному окрашиванию Periodic AcidSchiff (PAS), чтобы продемонстрировать клеточную архитектурупочкаткани.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК

Кроме того, ФФППпочкасекции рыбной ловли № кат. 1 и 3 подвергали анализу ISH и TEM, чтобы подтвердить результат положительного окрашивания CPPV-1 IHC и ультраструктурно продемонстрировать вирусные частицы впочечные ткани, соответственно. Для ISH ДНК-зонд CPPV-1, покрывающий 393 п.н. [34] капсидного гена CPPV-1, был сконструирован с использованием набора PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Базель, Швейцария) в соответствии с предложения производителя. Реакцию и условия термоциклирования проводили, как описано ранее [34], за исключением использования олигонуклеотидов, меченных дигоксигенином (DIG). Сконструированный гибридизационный зонд визуализировали и подтверждали разрешением по размеру при электрофорезе в 1,5-процентном (масса/объем) агарозном геле. ИСХ с хромогенной ДНК проводили, как описано ранее [26], с небольшими изменениями. Вкратце, после депарафинизации, регидратации и последующей промывки в PBS предметные стекла FFPE толщиной 4- мкм подвергали протеолитическому расщеплению, постфиксации и предварительной гибридизации. Затем предметные стекла гибридизовали с зондом ISH 25 нг/мкл при 42°C в течение ночи. Сигналы гибридизации визуализировали путем связывания со 100 мкл фрагментов анти-DIG-AP Fab (Roche, Базель, Швейцария) (1:200 в блокирующем растворе 1X) в сочетании с жидким перманентным красным (LPR) (Dako, Glostrup, Дания). . Затем предметные стекла докрашивали гематоксилином. Красные преципитаты в корреляции клеточной морфологии считались положительными для ISH. Для отрицательного контроля вместо зонда CPPV-1 использовали зонды вируса озера тилапии (TiLV) [35]. Образцы для ПЭМ готовили по методикам pop-off с модификациями [36–38] и окрашивали тяжелыми металлами, как описано ранее [39, 40]. Ультраструктуру исследовали с помощью ПЭМ (HT7800; Hitachi, Токио, Япония), работающего при напряжении 80 кВ.

Полная генетическая характеристика кошки-рыболова CPPV-1Поскольку результаты вирусологической ПЦР и скрининга ИГХ совпадали, а результаты частичных последовательностей генома VP-2, полученные с помощью панпарвовирусной ПЦР, свидетельствовали о генетическом сходстве между случаями №№. 1 и 2, но не для случая № 3, мы дополнительно охарактеризовали полноразмерную последовательность CPPV-1 этих рыболовных кошек (случай № 1 и 3) и классифицировали происхождение CPPV-1 с использованием набор вырожденных пар праймеров, специфичных для FPV и CPV, полученный из предыдущей публикации [26]. Вкратце, экстрагированные нуклеиновые кислоты, полученные из селезенки ипочкидвух кошек-рыболовов плюс дополнительная кишечная ткань кошки-рыболова No. 3, были индивидуально амплифицированы с использованием GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) и специфических праймеров (файл S1). Условия ПЦР описаны ранее [26]. Ампликоны-мишени визуализировали с помощью электрофореза в 2-процентном (масса/объем) агарозном геле и дополнительно очищали с использованием набора для экстракции Monarch DNA Gel (New England Biolab, Франкфурт, Германия) перед коммерческим секвенированием по Сэнгеру. Полные геномные последовательности изолятов CPPV-1, полученных от двух рыболовных кошек, были депонированы в GenBank (инвентарные номера MW145540-MW145541).

Филогенетический, рекомбинационный и эволюционный анализ CPPV-1 кошки-рыболова Полноразмерные последовательности генома штаммов CPPV-1 кошки-рыболова были сопоставлены с опубликованными полными последовательностями CPPV-1, полученными от различных видов-хозяев. , доступный в GenBank с использованием MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) и программного обеспечения MEGA7 (http://www.megasoftware.net). Выравнивания последовательностей затем подвергали построению филогенетического дерева. Филогенетическое дерево было создано с использованием метода максимального правдоподобия (ML) с моделью Хасэгавы–Кишино–Яно с гамма-распределением (HKY plus G), которая была выбрана с использованием алгоритма модели поиска наилучшего соответствия в MEGA7 в соответствии с байесовским информационным критерием. . Дерево было загружено с 1,000 повторениями. Попарное сходство последовательностей среди геномов CPPV-1 было рассчитано с использованием модели максимального сложного правдоподобия, а их эволюционное расстояние было проанализировано в MEGA7. Выходные парные нуклеотидные идентичности были сгенерированы и визуализированы в формате Microsoft Excel (файл S2). Затем выходную последовательность выравнивания CPPV-1 использовали в качестве шаблона для анализа генетической рекомбинации с использованием двух статистически независимых пакетов программного обеспечения. Вкратце, выравнивание идентифицировало потенциальные рекомбинационные штаммы с использованием интегрированного программного обеспечения Recombination Detection Program 4 (RDP4) Package V. Beta 4.94, и это было перепроверено с помощью графика сходства и анализа начальной загрузки в программном пакете SimPlot V. 3.5.1. Настройку программ и интерпретацию результатов проводили, как описано ранее [26, 41].

FДля эволюционного анализа CPPV{{0}} кошки-рыболова был получен набор данных из 224 полных последовательностей генома, содержащих 26 последовательностей FPV-, 6 MEV- и 192 последовательностей CPV, все из 18 стран в период с 1979 по 2019 год. из базы данных GenBank. Эволюционный анализ был выполнен с двумя потенциальными последовательностями CPPV-1, полученными от рыболовных кошек, с использованием модели Монте-Карло байесовской цепи Маркова (BMCMC), реализованной в BEAST V. 2.4.8 [42]. Тест jModelTest [43] был проведен для определения наиболее подходящей модели нуклеотидных замен для множественных последовательностей выравнивания. Наилучшие модели замещения в рамках логнормальных релаксированных и строгих часовых моделей с постоянными размерами популяции в качестве априорных были реализованы для учета различных скоростей эволюции среди родословных. Предыдущие и эмпирические базовые частоты объединенного байесовского дерева горизонта были получены в рамках наиболее подходящей модели часов и прогонялись для 100 миллионов цепочек с выборкой в ​​каждом 10000-м поколении, при этом первые 10 процентов отбрасывались как выжившие. Сходимость параметров была подтверждена расчетом эффективного объема выборки с помощью программы TRACER V. 1.7.0 [44]. Деревья максимальной достоверности клады были аннотированы с помощью TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. Филогенетическое дерево с предполагаемой дивергенцией, переменной временной шкалой, апостериорной вероятностью и 95-процентной максимальной апостериорной плотностью (HPD) было создано и отображено с использованием FigTree V. 1.4.3 [45].

Ретроспективное исследование антигена CPPV-1 у плотоядных диких животныхЧтобы изучить роль CPPV-1, связанную с заболеваемостью и смертностью от неизвестных причин у диких плотоядных животных в далеком и недавнем прошлом, было включено 305 отборных свежих образцов для выделения генома и идентификации таргетной идентификации CPPV{{2}. } капсидный ген, как описано выше. Эти образцы были получены с 2013 года либо в виде фекальных мазков, либо в виде кишечного содержимого. Они были получены от 136 животных зоопарка 27 различных видов плотоядных (таблица S1). Результаты Посмертные находки и локализация в тканях CPPV кошки-рыболова-1 Все кошки-рыболовы, подвергшиеся вскрытию, были умеренно истощены с разной степенью обезвоживания, в то время как у 2 из 3-х кошек-рыболовов (случаи № 1 и 2) наблюдался умеренный аутолиз. В первую очередь селезенка ипочкибыли перегружены всеми рыбацкими кошками. Рыбацкая кошка № 3 имела макроскопические очаги катарального энтерита с водянистым коричнево-желтоватым содержимым в их просветах и ​​гиперемией брыжеечных лимфатических узлов. Гистологически в легком рыболовной кошки нет. 3 выявлен выраженный застой с инфильтрацией мононуклеарных клеток в альвеолах. В печени выявлен умеренный перипортальный гепатит, характеризующийся инфильтрацией мононуклеарными клетками портальных триад печени. Одинаковая степень гиперемии селезенки с небольшим количеством селезеночных лимфоидных фолликулов наблюдалась у всех рыболовных кошек. Лимфоидные фолликулы были истощены, а оставшиеся лимфоидные фолликулы на фоне спавшейся архитектуры селезенки с увеличенным количеством выступающих селезеночных трабекул (рис. 1А). Отмечались рассеянные кариоректированные обломки лимфоцитов с

Рис. 1. Инфекция CPPV-1 у рыболовных кошек. Демонстрационные изображения H&E (A, C) и CPPV-1 IHC (B, D) у кошек-рыболовов. (A) № кошки-рыболовца. 1. Диффузная гиперемия селезенки с редким количеством лимфоидных фолликулов. Центр одного из оставшихся лимфоидных фолликулов содержал эозинофильный фибриллярный материал (фибрин), смешанный с рассеянным кариоректическим остатком лимфоцитов (лимфоцитолиз) (вставка). Небольшое количество этих лимфоцитов содержало базофильные внутриядерные тельца включения размером 5–7 мкм, которые ограничивали ядерный хроматин (стрелка). (B) № кошки-рыболовца. 3. Укорочение ворсинок с редкими расширенными криптами, содержащими эозинофильные белковые вещества и выстланными заметно ослабленными или некротизированными эпителиальными клетками крипт (вставка). Многие эпителиальные клетки крипт были пикнотичными и кариорректическими, а редкие клетки содержали аналогичные базофильные внутриядерные тельца включения (стрелки). (C) № кошки-рыболовца. 1. В цитоплазме мононуклеаров в области селезеночного лимфоидного фолликула часто наблюдалась иммунореактивность к ДППГ-1. (D) № кошки-рыболовца. 3. Сигналы ИГХ -1 CPPV были обнаружены диффузно, а сигналы иммунореактивности были заметно локализованы в цитоплазме криптальных эпителиальных клеток (вставка). Столбцы указывают 25 мкм для (A) и 120 мкм для (B-D).

скопления эозинофильных фибриллярных материалов в центре такого фолликула. Небольшое количество этих лимфоцитов содержит базофильные внутриядерные тельца включения размером 5–7 мкм, которые окаймляют ядерный хроматин. Укорочение кишечных ворсинок с коллапсом архитектуры слизистой оболочки присутствовало в отделе кишечника рыбацкой кошки № 1. 3 (фиг. 1В). Некоторые крипты были расширены, содержали эозинофильный белковый материал и были выстланы заметно ослабленными или некротизированными эпителиальными клетками крипт. Многие криптальные эпителиальные клетки были пикнотичными и кариорректическими, а редкие клетки содержали аналогичные базофильные внутриядерные тельца включения. ИГХ CPPV-1 использовали для демонстрации присутствия вируса в тканях и для описания патологической роли CPPV-1 в поражениях, наблюдаемых при обычном патологоанатомическом исследовании. Резидентные мононуклеарные клетки в селезенке показали положительную интенсивную иммунореактивность CPPV -1 у всех рыболовных кошек (рис. 1C). Иммунореактивность также наблюдалась в большей части цитоплазмы эпителиальных клеток крипт и была совместима с поражением кишечника рыбной кошки № 1. 3 (фиг. 1D). Примечательно, что различные степенипочечный трубчатыйвакуолизация и мультифокальностьпочечныйкровоизлияния были очевидны у всех рыбацких кошек (рис. 2А). Немногопочечныйтубулярные эпителиальные клетки были гиперэозинофильными с ядерным пикнозом, в то время как редкие вакуолизированные тубулярные эпителиальные клетки обнаруживали везикулярные ядра с краевым ядерным хроматином (рис. 2В). Взяв во вниманиепочкапоражений, мы дополнительно выполнили окрашивание PAS, чтобы продемонстрировать клеточную архитектурупочечная тканьи исключить системную гипоксию как возможную причину этого поражения. Окрашивание PAS продемонстрировалопочечный трубчатыйбазальные мембраны были интактными (рис. 2В, вставка). В рамкахпочкасрезов, иммуномечение CPPV-1 было сильным и часто наблюдалось в цитоплазмепочечный трубчатыйэпителиальные клетки (рис. 2C) и уротелиальные клетки впочечная лоханкаво всех случаях. Никаких признаков иммуногенной реакции не наблюдалось в отрицательном контроле (S1 на фиг.1). Нетипичная локализация CPPV-1 впочечные тканивыявленные IHC, предложили нам провести дополнительные исследования, чтобы подтвердить наличие и локализацию CPPV-1 впочкас использованием ISH и TEM с техникой pop-off. Иммунореактивность CPPV-1 ISH была положительной у всех рыболовных кошек и диффузно локализовалась в ядрепочечныйтубулярные эпителиальные клетки, где наблюдались тубулярные поражения (рис. 2D). В отрицательном контроле реакции не наблюдалось (рис. S1). В соответствии с результатами положительных иммунологических сигналов ИСГ, локализованных в ядрепочечныйэпителиальных клеток наблюдались многочисленные мелкие электронно-плотные вирусные частицы, диаметр которых оценивается примерно в 19–22 нм. Они были сгруппированы в ядрах этихпочечный трубчатыйи уротелиальные клетки (рис. 3).

Обнаружение CPPV-1 кошек-рыболовов и геномный анализПрежде всего, на образцах выделенных вирусных нуклеиновых кислот были протестированы пансемейные ПЦР-панели, специфичные для различных вирусов, включая вирусы герпеса, парамиксовирусы, пневмовирусы, калицивирусы, вирусы гриппа, бокавирусы, коронавирусы и парвовирусы. Это выявило положительные результаты только при пан-парвовирусной ПЦР в кишечнике, лимфатических узлах ипочкаобразцы трех рыбацких кошек. И наоборот, другие пан-ПЦР для обнаружения других вирусов были отрицательными во всех протестированных образцах тканей. Из ранее полученных результатов положительности пан-парвовирусной ПЦР у всех рыбацких кошек мы дополнительно охарактеризовали кодирующие последовательности генома у двух рыбацких кошек, используя несколько пар праймеров в извлеченные образцы нуклеиновых кислот, полученные из кишечника (случай №1) ипочка(дело №3). Были обнаружены 4462 и 4430 пар оснований полных кодирующих геномов двух штаммов CPPV-1 кошек-рыболовов, которые были обозначены как штамм 19ZP004-TH/2019 (случай № 1, номер доступа MW145540) и 19ZP{ {12}}TH/2019 (дело № 3, регистрационный номер MW145541) соответственно. После генетического анализа полные кодирующие геномы выявили генетически сходные результаты среди штаммов CPPV-1, полученных от кошек-рыболовов, показав, что эти CPPV-1 кошек-рыболовов были FPV. Выведенное сравнение аминокислот между вариантами CPPV-1 и FPV кошек-рыболовов описано в таблице 1. Следует отметить, что FPV кошек-рыболовов выявил уникальные аминокислотные мутации I566M и M569R в структурном (VP1 и 2) белке. , которые не были обнаружены в предыдущих вариантах CPPV-1.

Рис. 2. Инфекция CPPV-1 у рыболовных кошек. Демонстрационные микрофотографии H&E (A), окрашивание PAS (B), CPPV-1 IHC (C) и гибридизация in situ (ISH) (D)почкаот рыбацких кошек. (A, B) Кошка-рыболов №3. (А) Мультифокальныйпочечныйкровотечение спочечный трубчатыйвакуолизация. Немногие эпителиальные клетки канальцев были гиперэозинофильными с пикнотическими ядрами (вставка, стрелки). (Б)Почечная трубчатаяэпителиальные клетки имеют цитоплазматическую вакуоль, а ядра редких эпителиальных клеток имеют пузырьковую форму с краевым ядерным хроматином. Окрашивание PAS выявило неповрежденную базальную мембрану (вставка). (C) № кошки-рыболовца. 2. Иммунореактивность CPPV-1 ИГХ (темно-коричневый цвет) диффузно наблюдалась впочечные канальцыи часто обнаруживается в цитоплазмепочечный трубчатыйэпителий (вставка). (D) Кошка-рыболов №1. CPPV-1 ISH-иммунореактивность (красновато-розовый цвет) в изобилии наблюдалась упочечные канальцы(звездочки), и локализуется в ядрахпочечный трубчатыйэпителии (вставка, стрелки). Столбцы указывают 50 мкм для (A, C) и 120 мкм для (B, D).

Филогенетический и эволюционный анализДля сравнения генетической связи между обнаруженным геномом CPPV-1 кошки-рыболова и другими ранее опубликованными геномами CPPV-1 был проведен филогенетический анализ, основанный на полной последовательности кодирующего генома. Филогенетическое дерево ML показало, что большинство FPV, MEV и CPV образуют очень четкую кладу среди групп (рис. 4). Два генома CPPV-1 исследованных кошек-рыболовов (обозначены красными треугольниками) были сгруппированы вместе с одной и той же линией ранее опубликованных последовательностей FPV, полученных от разных хозяев, что подтверждает, что полученные

Рис. 3. Вирусные частицы CPPV-1 в ядрепочечный трубчатыйэпителиальные клетки. Трансмиссионная электронная микроскопия (ПЭМ) с использованием метода pop-off. Ультраструктурная демонстрация кластеризации электронно-плотных частиц (стрелки). Размер икосаэдрических частиц составлял 19–22 нм в диаметре, они располагались в ядрепочечный трубчатыйэпителиальные клетки (вставка). Масштабные линейки, как показано на рисунке.

CPPV-1 для кошек-рыболовов были FPV. Обнаруженные геномы были сгруппированы вместе и наиболее тесно связаны с геномом FPV, обнаруженным у домашних кошек в Таиланде (инвентарный номер MN127780). Для дальнейшего выяснения эволюционного процесса обнаруженного CPPV-1 кошки-рыболова было проведено несколько рекомбинационных обнаружений и эволюционных анализов набора данных из 224 полных последовательностей генома CPPV-1. Анализ рекомбинации показал, что в последовательностях CPPV-1 кошек-рыболовов не было обнаружено событий рекомбинации. Эволюционное дерево этих данных показало две основные отдельные отдельные клады (рис. 5). Одна клада включала FPV и MEV, а другая клада включала все последовательности CPV. Общая скорость эволюции была оценена в 1,08 × 10–4 замен/участок/год (95 % HPD: 1,95–2,87 × 10–4). Эволюционное древо показало, что последовательности FPV кошек-рыболовов были сгруппированы в той же линии FPV, что и выделенные из Таиланда. Они имеют общую генетическую эволюцию с геномами FPV, обнаруженными у домашних кошек в Китае, и могут иметь одно и то же происхождение примерно с 1970 года.

Обсуждение

Циркуляция вариантов CPPV-1, включающих CPV и FPV, была выявлена ​​как у домашних, так и у диких хищников. В то время как смертельная инфекция CPPV-1 у домашних собак и кошек является обычным явлением, эта инфекция спорадически наблюдается у диких плотоядных животных [46]. Несколько исследований показали, что многие дикие плотоядные животные восприимчивы к инфекции CPPV-1, включая диких кошек, норок, выдр, скунсов, енотов, лисиц, волков, койотов, циветт и куниц [11, 19]. В частности, для рода Prionailurus сообщается, что только леопардовые кошки инфицированы вариантами CPPV-1 [9]. В этом исследовании мы описываем естественную инфекцию FPV, члена CPPV-1, у диких рыболовных кошек (Prionailurus viverrinus). Это первый отчет с описанием четкого распределения вируса и тропизма вткани почекчто подтверждается антигенным обнаружением с использованием ПЦР, IHC, ISH и TEM-анализа ультраструктуры.

Наблюдалась межвидовая передача вариантов -1 CPPV между домашними и дикими плотоядными животными, и предполагалось, что некоторые фатальные вспышки CPPV-1 связаны с распространением патогенов между местами обитания [9, 11]. Из-за текущей потери среды обитания диких животных дикие колонии мигрируют и делят среду обитания с домашними животными, что привело к увеличению распространения патогенов между восприимчивыми животными. В этом исследовании мы обнаружили, что геномы CPPV-1 кошек-рыболовов имеют общий эволюционный паттерн со штаммами FPV, обнаруженными в

Рис. 4. Филогенетическая топология, показывающая генетическое родство полноразмерных кодирующих последовательностей между кошкой-рыболовом CPPV-1 и другими вариантами CPPV-1. Филогенетическое дерево показало, что последовательности CPPV-1 кошек-рыболовов (обозначенные красными треугольниками) были сгруппированы вместе с геномами FPV с геномом, наиболее связанным с геномом FPV, обнаруженным у тайской кошки (MN127780). Были указаны номера доступа в GenBank ранее описанных последовательностей CPPV-1, использованных в этом анализе.

домашние кошки в Тайланде. Эти результаты показывают аналогичную эволюционную картину штаммов FPV от общих предков, выделенных от домашних кошек в Китае с 1970-х годов. Этот результат может указывать либо на возможное свидетельство межвидовой передачи между домашними кошками и кошками-рыболовами, либо на совместную эволюцию вариантов CPPV-1. Однако из-за ограниченного количества образцов, полученных от свободно бродящих животных в одних и тех же местах обитания, и небольшого количества исследованных рыболовных кошек, первичный резервуар CPPV-1 в этом исследовании не может быть идентифицирован, и необходимы дальнейшие исследования. . Хотя несколько исследований показали, что различные аминокислотные остатки в капсидном гене связаны как со способностью заражать новых хозяев, так и с антигенностью CPPV-1 [18, 47], единственная аминокислотная мутация в положении 300 капсидный белок (VP2) считается ключевой детерминантой для множественных диапазонов хозяев [48]. В этом исследовании вариант CPPV-1, полученный от кошек-рыболовов, показал те же аминокислотные паттерны, что и в последовательностях FPV, с присутствием аланина (A) в качестве ключевой аминокислотной детерминанты в положении 300 капсида. Капсидный белок CPPV-1 кошки-рыболова выявил аминокислоты аспарагина (N) и аланина (A), расположенные в положениях 564 и 568 соответственно (которые считаются критическими для репликации FPV в кошачьем хозяине). 2 уникальные аминокислотные мутации в положениях I566M и M569R. Эти мутации могут отличать этот вирус от ранее описанных вариантов CPPV-1. Предыдущий анализ наследственной реконструкции показал, что FPV может заражать различных плотоядных животных с небольшими изменениями в гене VP2 [49]. Таким образом, FPV-подобный парвовирус был предварительно назван потенциально новым вирусом, обнаруженным у рыболовных кошек, и это может служить подтверждением первой идентификации этого вируса у этого вида. Однако небольшое количество исследованных кошек-рыболовов по сравнению с небольшим количеством других последовательностей не может дать окончательной интерпретации. Это требует дальнейшего изучения, чтобы сделать более определенные выводы.

Локализации CPPV-1 у рыболовных кошек наблюдались в различных тканях, включая эпителиальные клетки кишечника и лимфоидные клетки, при этом наиболее частая тканевая локализация инфекции CPPV-1 обнаружена у других видов [20, 26, 50, 51]. ]. Интересно, что первоначальное исследование обнаружения генома вируса с помощью ПЦР и локализации вируса с помощью ИГХ выявило различную локализацию вируса вткани почек, мы выполнили окрашивание PAS, чтобы продемонстрировать клеточную архитектурупочечная тканьи исключить системную гипоксию как возможную причину канальцевого некроза. Окрашивание PAS показало, что большинство базальных мембран канальцев были интактными, что позволяет предположить, что это поражение не может быть результатом системной гипоксии [52]. Однако это поражение может быть вызвано и другими причинами, такими как индуцированный токсинами тубулярный некроз. Таким образом, роль FPV-подобной парвовирусной инфекции, связанной спочкапоражений все еще нуждается в дальнейшем исследовании. Кроме того, мы попытались дополнительно выяснить существующую локализацию вируса впочечная тканьс помощью ИСГ и ТЭМ по методу pop-off [37] на участках, где была выявлена ​​ИГХ-иммунореактивность к CPPV-1. Электронно-плотные частицы наблюдались в ядрепочечный трубчатыйэпителиальные клетки и уротелиальные клетки, поддерживая положительную иммунореактивность in situ в отношении CPPV-1 впочечная ткань. Кошки, инфицированные FPV, выделяют вирус преимущественно с фекалиями, но было описано присутствие активного вируса в моче [53, 54]. Недавние исследования показали, что парвовирусная инфекция играет роль впочечная недостаточность[55]. Однако локализация FPV и аналога CPV впочечная тканьранее не исследовался. Кроме того, мышьпочкабыло доказано, что парвовирус (MKPV) является нефротропным вирусом, проявляя сродство к инфекции и локализации впочечный трубчатыйэпителиальных клеток, что приводит кзаболевания почек [56, 57].

Насколько нам известно, локализация CPPV-1 впочкиранее не описывалось. Это предполагает новое описание уникальной локализации вируса у этого вида или даже возможность его обнаружения у кошек, инфицированных FPV. Этот вывод может подтвердить предыдущие исследования, в которых FPV был обнаружен в моче. Уникальные патологические данные могут быть субъективными и могут наблюдаться как инфекция у отдельных лиц. Таким образом, крупномасштабное исследование CPPV-1 кошек-рыболовов облегчит окончательную интерпретацию. Кроме того, образцы, которые были представлены в основном от мертвых животных и уже подверглись посмертному аутолизу, не подходят для дальнейшего забора органов от этих животных. Таким образом, нам не удалось определить локализацию вируса в других органах. Выяснение атипичной локализации вируса CPPV-1 кошек-рыболовов было бы полезным исследованием.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК

CPPV-1 был обнаружен у различных диких плотоядных и связан со вспышками со смертельным исходом. Отрицательное свидетельство ретроспективного обнаружения CPPV-1 в образцах диких животных в этом исследовании может быть связано либо с отсутствием тесных контактов между восприимчивыми животными, либо, с другой стороны, с длительным хранением образцов, что влияет на стабильность геномных материалов. Новая идентификация CPPV-1, связанного со смертельной инфекцией рыболовных кошек в этом исследовании, вызывает опасения по поводу нового, потенциально вирулентного заболевания у этого уязвимого животного. Таким образом, дальнейшее изучение передачи CPPV-1 у рыболовных кошек необходимо для предотвращения потери других восприимчивых видов животных. Соответственно, следует уделить особое внимание стратегиям профилактики, чтобы управлять инфекциями CPPV-1 не только у этого вида, но и у свободно гуляющих домашних животных, которые могут служить потенциальными хозяевами для этого вируса.