Нефротоксический потенциал предполагаемых метаболитов 3,5-дихлоранилина (3,5-DCA) и биотрансформация 3,5-DCA в изолированных клетках почек крыс Fischer 344

Чтобы узнать больше, обращайтесь:tina.xiang@wecistanche.com

Абстрактный:Настоящее исследование было разработано для изучения in vitro нефротоксического потенциала четырех метаболитов 3,5-дихлоранилина(3,5-DCA)(3,5-дихлорацетанилида,3,5- DCAA;3,5-дихлорфенилгидроксиламин,3,5-DCPHA;2-амино-4,6-дихлорфенол,2-A-4 ,6-DCP;3,5-дихлорнитробензол,3,5-DCNB) и для определения почечного метаболизма 3,5-DCA in vitro. В тестах на цитотоксичностьизолированные почечные клетки(IKC) от самцов крыс Fischer 344 (~ 4 миллиона / мл, 3 мл) подвергали воздействию метаболита (0-1,5 мМ; до 90 минут) или носителя. Из этих метаболитов 35-DCPHA был наиболее сильным нефротоксичным, а 35-DCNB имел промежуточный нефротоксический потенциал.2-A-4,6-DCP и 3,{ {12}}DCAA не были цитотоксичными. В отдельных экспериментах цитотоксичность 35-DCNB снижалась за счет предварительной обработки IKC антиоксидантами и ингибиторами цитохрома P450, флавинмонооксигеназы и пероксидазы, в то время как цитотоксичность 3,5-DCPHA снижалась двумя нуклеофильнымиантиоксиданты(глутатион и N-ацетил-L-цистеин). Инкубация IKC с 3,5-DCA (0.5-1.0 мм, 90 мин) давала только 3,5-DCAA и 3,{{12 }}DCNB в качестве обнаруживаемых метаболитов. Эти данные свидетельствуют о том, что 3,5-DCNB и 3,5-DCPHA являются потенциальными нефротоксичными метаболитами и могут способствовать индуцированной 3,5-DCA нефротоксичности in vivo. Кроме того, почки могут биоактивировать3,5-DCNB в токсичные метаболиты, а 3,5-DCPHA, по-видимому, вырабатывает реактивные метаболиты, способствующие нефротоксичности3,5-DCA. In vitro N-окисление 3,5-DCA, по-видимому, является основным механизмом биоактивации 3,5-DCA до нефротоксичных метаболитов.

Ключевые слова:нефротоксичность; в пробирке; крыса;3,5-дихлоранилин;35-дихлорфенилгидроксиламин;3,5-дихлорацетанилид;2-амино-4,6-дихлорфенол;3,{{ 9}}дихлорнитробензол

нажмите, чтобы узнать больше информации.

1. Введение

Хлоранилины являются химическими промежуточными продуктами, обычно используемыми в процессе производства многих красителей, сельскохозяйственных химикатов, лекарств и промышленных химикатов. Воздействие хлоранилинов происходит на рабочем месте в результате их высвобождения или образования во время метаболизма многочисленных соединений млекопитающими [1-3] или в результате разложения пестицидов в окружающей среде[1,4-6]. Обнаружение хлоранилинов в моче или крови человека использовалось в качестве биомаркера воздействия пестицидов на основе хлоранилина [7-10]. Токсичность, связанная с воздействием хлоранилинов, включает гематотоксичность (например, анемию или метгемоглобинемию) [11-13], спленотоксичность [11,14], гепатотоксичность [14-17], нарушение эндокринной системы [18] и нефротоксичность [16,19]. ,20]. Хлоранилины также считаются приоритетными загрязнителями в исследованиях по оценке экологических рисков из-за их потенциального неблагоприятного воздействия на здоровье и выброса пестицидов в окружающую среду в сельскохозяйственных районах [21,22].

Среди трех монохлорированных и шести дехлорированных анилинов 3,5-дихлоранилин (3,5-DCA) является наиболее сильнодействующим нефротоксичным веществом in vivo ив пробирке[16,19,23]. In vivo воздействие 3,5-DCA в тестах Sprague-Dawley или Fischer, 344 крысы, приводило к повышению концентрации азота мочевины в крови (BUN), снижению транспорта органических ионов в клетках проксимальных канальцев, снижению массы почек, протеинурии и гематурии. [23,24]. Наиболее серьезные морфологические изменения происходят в клетках проксимальных канальцев почек, но клетки дистальных канальцев и собирательные трубочки также подвергаются воздействию 3,5-DCA [23]. Дальнейшие исследования с использованиемизолированные почечные клетки(IKC) у самцов крыс Fischer 344 продемонстрировали, что концентрации 1,0 мм или более 3,5-DCA в течение 90 минут приводят к увеличению высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ), меры цитотоксичности [25]. ].

Токсичность анилиновых соединений in vivo в основном обусловлена ​​образованием токсичных метаболитов. На основании исследований с анилином и некоторыми его хлорпроизводными четко установлены пути биотрансформации этих анилиновых соединений, включающие N-окисление, N-ацетилирование и окисление фенильного кольца [13,26-28]. Хотя метаболизм 35-DCA in vivo подробно не изучался, эти пути биотрансформации могут продуцировать ряд потенциально токсичных метаболитов (рис. 1), как это происходит с другими хлоранилинами, исследования биотрансформации которых проводились [26, 29,30]. Недавние исследования Racine et al. [25] продемонстрировали, что 35-DCA метаболизируется до токсичных метаболитов с помощью ряда почечных ферментных систем. Однако неясно, какие метаболиты продуцируютсяпочки.

Один потенциальный метаболит 3,5-DCA,4-амино-2,6-дихлорфенол (4-A-2,6-DCP) , был оценен на нефротоксический потенциал и является мощным нефротоксичным in vivo и in vitro у самцов крыс Fischer 344 [31-33]. Сравнительное исследование in vitro нефротоксического потенциала часто моно-, ди- и трихлорнитробензолов в срезах коры почек показало, что 3,5-дихлорнитробензол (35-DCNB) является наименее сильным нефротоксичным среди дихлорнитробензолов [34]. . На сегодняшний день нет исследований, в которых изучался бы нефротоксический потенциал других предполагаемых метаболитов 3,5-DCA.

Настоящее исследование было разработано для определения нефротоксического потенциала трех дополнительных предполагаемых метаболитов 3,5-DCA, образующихся в результате N-ацетилирования, (3,5-дихлорацетанилида;

3. 5-DCAA), N-окисление (3,5-дихлорфенилгидроксиламин; 35-DCPHA) или окисление фенильного кольца (2-амино-4,{{ 8}}дихлорфенол;2-A-4,6-DCP) (рис. 1) после внепочечной биотрансформации 35-DCA. Были изучены нефротоксический потенциал 3,5-DCNB в модели IKC и его потенциальные механизмы биоактивации. Кроме того, была определена способность свободных радикалов/реактивных метаболитов способствовать цитотоксичности 3,5-DCPHA. Наконец, было проведено исследование биотрансформации, чтобы установить, в какой степени 3,5-DCA биотрансформируется в IKC у самцов крыс Fischer 344, и определить, какие метаболиты образуются.

2. Результаты

2.1. Зависимость цитотоксичности от времени и концентрации для метаболитов 3,5-DCA

Чтобы определить нефротоксический потенциал каждого предполагаемого метаболита 3,5-DCA, в IKC были проведены исследования концентрации и динамики. Воздействие 3,5-DCAA не приводило к значительному увеличению высвобождения ЛДГ, маркера цитотоксичности, в любое время (60 или 90 минут) или в любой концентрации (0-1). 5 мМ) проверено (рис. 2А). Кроме того, воздействие 2-A-4,6-DCP не приводило к значительному увеличению высвобождения ЛДГ ни при каких протестированных концентрациях (до 1,5 мМ) после 60- или 90-минутного воздействия ( Рисунок 2Б). Инкубация IKC с 3,5-DCNB или 3,5-DCPHA приводила к зависящему от времени и концентрации увеличению высвобождения ЛДГ для обоих соединений, хотя 3,5-DCPHA индуцировала наибольшее увеличение выпуск ЛДГ. Значительное высвобождение ЛДГ наблюдалось при концентрациях 3,5-DCNB 1,0 или 1,5 мМ или выше через 90 минут, но только при 1,5 мМ через 60 минут (рис. 2C). Напротив, 35-DCPHA индуцировала значительное увеличение при высвобождении ЛДГ на уровне 0,25 мМ или выше через 60 и 90 минут, при этом увеличение высвобождения ЛДГ, наблюдаемое через 90 минут, значительно увеличивается по сравнению с соответствующим увеличением высвобождения ЛДГ через 60 минут (рис. 2D). Следовательно, из протестированных метаболитов 3,5-DCPHA оказался наиболее нефротоксичным.

2.2. Почечная биотрансформация и цитотоксичность 3,5-DCNB

Поскольку анилины и нитробензолы могут метаболизироваться друг в друга, дальнейшие исследования были направлены на изучение ролипочечная биотрансформацияи свободные радикалы в цитотоксичности после воздействия 1,0 мМ 3,5- DCNB в течение 60 мин. Чтобы определить потенциальную роль свободных радикалов в цитотоксичности 3,5-DCNB, IKC предварительно обрабатывали антиоксидантом. Предварительная обработка всеми антиоксидантами (-токоферолом, глутатионом, аскорбатом и N-ацетил-L-цистеином; рис. 3) значительно снижала цитотоксичность, индуцированную 3,5-DCNB.

Для изучения роли почечной биотрансформации в токсичности 3,5-DCNB при IKC использовали предварительную обработку ингибиторами цитохромов P450 (CYP), флавинсодержащих монооксигеназ (FMO) и пероксидаз. Использование ингибиторов CYP (рис. 4) показало, что два основных ингибитора CYP (пиперонилбутоксид [PiBx]; метирапон) значительно ослабляют цитотоксичность 3,5-DCNB. Предварительная обработка ингибиторами FMO (н-октиламин; метимазол) и ингибитором пероксидазы меркаптосукцинатом значительно ослабляла цитотоксичность 3,{9}}DCBN (рис. 5). Индометацин, который ингибирует пероксидазную активность циклооксигеназы, имеет тенденцию к снижению 3,5-DCNB-индуцированного высвобождения ЛДГ, но не достигает существенной разницы (рис. 5).

2.3. Антиоксиданты и цитотоксичность 3,5-DCPHA

Чтобы начать изучение роли свободных радикалов в 3,5-DCPHA-индуцированной цитотоксичности, IKC предварительно обрабатывалиантиоксиданты(глутатион, аскорбат или N-ацетил-L-цистеин) перед воздействием 3,5-DCPHA(0,5 мМ). Результаты показывают, что, в отличие от 3,5-DCNB, цитотоксичность, индуцированная 3,{{10}}DCPHA, частично ослабляется N-ацетил-L-цистеином и полностью защищается глутатионом (рис. 6). ). Аскорбат (1,0 или 2,0 мМ) не был эффективен в снижении цитотоксичности 3,5-DCPHA.

2.4.3, 5- Метаболизм DCA по IKC

Предыдущие сравнительные исследования цитотоксичности были разработаны для изучения нефротоксического потенциала предполагаемых метаболитов 3,5-DCA, продуцируемых извне. Мы также изучили, как IKC метаболизирует 3,5-DCA, чтобы увидеть, какие метаболиты непосредственно продуцируются клетками почек. В этих экспериментах IKC инкубировали либо с нетоксичной концентрацией 3,5-DCA (0,5 мМ), либо с цитотоксической концентрацией (1,0 мМ) в течение 90 мин, а образцы среды и клетки, проанализированные с помощью ВЭЖХ на наличие 3,5-DCA и его метаболитов. Время удерживания для 3,5-ДХА и его метаболитов, пределы обнаружения и коэффициенты извлечения показаны в таблице 1 для аутентичных стандартов 3,5-ДХА и каждого метаболита (4-А{{ 19}},6-DCP,2-A-4,6-DCP, 3,5-DCPHA, 3,5-DCAA и 3 ,5-DCNB).

При обеих концентрациях основным соединением в среде и клетках в конце периода инкубации было исходное соединение 3,5-DCA. Менее 5 процентов 3,5-DCA метаболизируется в 3,5-DCAA и 3,5-DCNB (таблица 2). Не было никаких доказательств образования неконъюгированных метаболитов аминохлорфенола 2-A-46-DCP или 4-A-2,6-DCP.35-DCPHA. не был обнаружен, что неудивительно, учитывая высокую реакционную способность этого метаболита, но обнаружение присутствия 3,5-DCNB в среде и клетках подтверждает вывод о том, что 3,5-DCPHA образовывался и затем дополнительно окисляется до 3,5-DCNB.

Существовала возможность, что аминохлорфенолы были образованы, но метаболизированы в сульфатные или глюкуронидные конъюгаты. Чтобы определить, образовались ли конъюгаты, 3,5-DCA (1,0 мМ) инкубировали с IKC в течение 45 или 90 мин. Однако обработка сред или клеточных лизатов арилсульфатазой или -глюкуронидазой не выявила свободного 2-A-4,6-DCP или 4-A-2,{ {12}}DCP(данные не показаны). Эти результаты свидетельствуют о том, что эти два метаболита не образовывались в обнаруживаемых количествах или в дальнейшем окислялись до реактивных метаболитов (рис. 1). Однако, поскольку произошло практически полное восстановление эквивалентов 35-DCA, маловероятно, что очень много этих метаболитов, если таковые имеются, были образованы приклетки почек.

2.5. Влияние диэтилдитиокарбаминовой кислоты (DEDTCA) на метаболизм 3,5-DCA

Предыдущие исследования показали, что предварительная обработка IKC ингибиторами CYP2C заметно снижает цитотоксичность 3,5-DCA [25]. Одним из наиболее эффективных ингибиторов токсичности 35-DCA был ингибитор CYP2C DEDTCA. Чтобы изучить, как DEDTCA влияет на метаболизм 3,5-DCA, IKC предварительно обрабатывали DEDTCA (0,1 мМ), а затем {{10}}DCA (1,0 мМ) в течение 90 мин инкубации. Определение уровней 35-DCA и метаболитов 3,5-DCA показало, что общий уровень 3,5-DCA в средах и клетках был лишь незначительно повышен, а образование 3,{{ 20}}DCAA и 3,5-DCNB были снижены (таблица 3). Не было обнаружено 2-A-4.6-DCP 4-A-2,6-DCP или 3,5-DCPHA, что согласуется с более ранними исследованиями (табл. 2).

3. Обсуждение

Важным аспектом этого исследования было определение нефротоксического потенциала предполагаемых внешне продуцируемых метаболитов 3,5-DCA в отношении почечных клеток-мишеней. Предполагается, что эти метаболиты образуются в результате метаболизма анилина и хлоранилинов (рис. 1) [13,26,28,29]. Ранее мы подсчитали, что нефротоксическая доза 3,5-DCA у крысы Fischer 344 будет давать максимальный уровень в крови ~1,25 мМ [25]. Таким образом, концентрации метаболитов ниже этой концентрации могут быть физиологически значимыми. Результаты текущего исследования показывают, что метаболит, образующийся в результате N-ацетилирования 3,5-DCA, 3,5-DCAA, обладал значительно сниженным нефротоксическим потенциалом по сравнению с 3,5-DCA. Этот результат не удивителен и согласуется с более ранними исследованиями монохлоранилинов и их метаболитов, которые показывают, что N-ацетилирование приводит к метаболитам хлорацетанилида со сниженным нефротоксическим потенциалом по сравнению с исходным соединением [35,36]. Таким образом, N-ацетилирование, по-видимому, является путем детоксикации нефротоксичности, вызванной хлоранилином, включая 3,5-DCA. Кроме того, IKC способен метаболизировать 3,5-DCA в 3,{{30} }DCAA (табл. 2). Но, учитывая слабый нефротоксический потенциал 3,5-ДХА, маловероятно, что этот метаболит способствует индуцированной 3,5-ДХА нефротоксичности in vitro.

В отличие от 3,5-ДХА, по крайней мере один метаболит, образующийся в результате окисления фенильного кольца 3,5-ДХА, вызывает нефротоксичность. Окисление 3,5-DCA в положении 4- приводит к образованию 4-A-2,6-DCP (рис. 1), который является мощным нефротоксичным веществом in vivo и in vitro [31-33]. In vivo 4-A-2,6-DCP (0,38 ммоль/кг, внутрибрюшинно) вызывает выраженную нефротоксичность у самцов крыс Fischer 344, характеризующуюся протеинурией, глюкозурией, повышенным концентрация азота мочевины крови (АМК) ипочкавес и некроз проксимальных канальцев в сегменте S3 [3132]. In vitro, 4-A-2,6-DCP снижал поглощение п-аминогиппурата (ПАУ) и тетраэтиламмония (ТЭА). в крысесрезы кортикального слоя почкипри концентрациях 5 мкМ и 50 мкМ соответственно [31] и увеличение высвобождения ЛДГ при 50 мкМ или выше после 2-часового воздействия [33]. В IKC для увеличения высвобождения ЛДГ требуются концентрации 250 мкМ или выше и 90-минутная экспозиция для 4-A-2,6-DCP. Более высокие концентрации, необходимые для индукции цитотоксичности в этой модели, скорее всего, связаны с присутствием альбумина в инкубационной среде для IKC, но не в растворе Кребса-Рингера, используемом в исследованиях инкубации срезов коры почек. В этом исследовании 2-A-4,6-DCP, образующийся в результате окисления в 2-положении 35-DCA, не увеличивал высвобождение ЛДГ при концентрациях до 1,5 мМ и воздействие до 90, что указывает на то, что 4-A-2,6-DCP был более сильным нефротоксичным, чем 2-A-4, 6-ПОД. Этот вывод согласуется со сравнением нефротоксического потенциала других 4-амино- и 2-аминофенолов[37,38]. Таким образом, 4-A-2.6-DCP с большей вероятностью, чем 2-A-4,6-DCP вносит вклад в 3,{{38 }}DCA-индуцированная нефротоксичность in vivo.

В исследованиях метаболизма IKC3,5-DCA, ни 2-A-4,6-DCA, ни 4-A-2,6- DCA были обнаружены в виде свободных метаболитов или в виде глюкуронидных или сульфатных конъюгатов (таблица 2). Хотя возможно образование небольших количеств этих аминодихлорфенолов, полное извлечение 3,5-DCA, добавленного к инкубации IKC, было обнаружен как исходное соединение плюс другие метаболиты (таблица 2). Эти результаты свидетельствуют о том, чтопочкане образует достаточного количества метаболитов аминодихлорфенола, чтобы способствовать нефротоксичности 3,5-DCA in vitro.

Было показано, что N-окисление является важным путем биотрансформации метаболизма анилина и хлоранилина, который может способствовать гепатотоксичности и, возможно, другим видам токсичности, вызываемым этими соединениями [11, 39-41]. N-окисление анилина приводит к образованию метаболита фенилгидроксиламина, который далее окисляется до метаболита нитрозобензола [39] (рис. 1). Метаболиты фенилгидроксиламина и нитрозобензола могут подвергаться окислительно-восстановительному циклу с образованием свободных радикалов и окислять двухвалентное железо в гемоглобине и других двухвалентных железосодержащих белках до трехвалентного железа. Этот цикл превращает гемоглобин в метгемоглобин в эритроцитах, но также может влиять на биологическую активность других белков и ферментов, которым для биологической активности требуется молекула двухвалентного железа. Метаболиты нитрозобензола также реакционноспособны и могут ковалентно связываться с нуклеофилами на макромолекулах внутри клетки [42,43]. Нитрозогруппа может далее окисляться с образованием метаболитов нитробензола (рис. 1). Предыдущие исследования показали, что 3,5-DCA может вызывать метгемоглобинемию in vivo и что 3,5-DCPHA (рис. 1) в первую очередь ответственен за эту токсичность [40,44,45]. Эти данные свидетельствуют о том, что 3,5-DCPHA продуцируется извне, скорее всего, в печени, и попадает в кровь, вызывая метгемоглобинемию, как это происходит с анилином [44,45]. Эти результаты также свидетельствуют о том, что почки подвергаются воздействию 3,5-DCPHA, продуцируемого вне почек.

Образование 3,5-DCNB с помощью IKC (таблица 2) демонстрирует, что почка может образовывать 3,5-DCPHA из 3,5-DCA. Таким образом, почки могут подвергаться воздействию 3,5-DCPHA как из внутрипочечного, так и внепочечного образования.3,5-DCPHA оказался наиболее токсичным испытанным метаболитом, и вполне вероятно, что 3,{ {13}}DCPHA вносит основной вклад в нефротоксичность 3,5-DCA, непосредственно в отношении клеток почек и/или косвенно через гематотоксичность. Также вероятно, что множественные ферментные системы способны образовывать 35-DCPHA из 3,5-DCA, и эти ферментные системы могут также образовывать другие нефротоксические метаболиты 3,5-DCA [46, 47]. Было показано, что N-окисление анилиновых соединений катализируется CYP, флавинмонооксигеназами (FMO),

пероксидазы и простагландинсинтетазы [48-51]. Предыдущие исследования в нашей лаборатории показали, что нефротоксичность 3,5-DCA при IKC может быть ослаблена ингибиторами этих различных семейств ферментов в разной степени [25], предполагая, что ингибирование одного семейства ферментов позволит 35- DCA продолжает биоактивироваться другими метаболизирующими ферментными системами. Чтобы определить, являются ли ингибиторы, использованные Racine et al. [25] изменяли N-окисление 3,5-DCA, исследовали способность диэтилдитиокарбамата (DEDTCA), ингибитора CYP2C и, в меньшей степени, CYP2E1, снижать образование DCNB. DEDTCA был выбран для исследования, потому что он заметно снижал цитотоксичность 3,5-DCA при IKC [25]. Тот факт, что DEDTCA снижает образование 3,5-DCNB в IKC, подтверждает вывод о том, что DEDTCA ослабляет нефротоксичность 3,5-DCA, по крайней мере частично, путем ингибирования N-окисления 3,{{21} } ДКА. Поскольку ингибитор CYP2E1 изониазид не оказывал влияния на цитотоксичность 3,5-DCA, оказалось, что ферменты CYP2C биоактивируют 3,5-DCA в токсичные метаболиты посредством образования 3,5-DCPHA.

Цитотоксичность может быть вызвана in vitro в IKC 3,5-DCPHA посредством двух потенциальных механизмов; окислительно-восстановительный цикл с образованием свободных радикалов (например, супероксидного анион-радикала) и окислительного стресса или продукции алкилирующих метаболитов. Расин и др. [25] обнаружили, что 3,5-DCA-индуцированная цитотоксичность при IKC не была связана с окислительным стрессом. Сниженный и общий уровни глутатиона были снижены при воздействии 3,5-DCA, что свидетельствует об образовании реактивного метаболита. В текущем исследовании цитотоксичность 35-DCPHA снижалась за счет нуклеофильных антиоксидантов (глутатиона и N-ацетил-L-цистеина), но не за счет ненуклеофильного антиоксиданта аскорбата (рис. 6). Эти результаты подтверждают наличие одного или нескольких реактивных алкилирующих метаболитов 3,5-DCPHA в качестве цитотоксических соединений.

Хлорированные нитробензолы являются нефротоксикантами in vivo и in vitro [34,52,53]. Rickert и Held [3] обнаружили, что печеночные микросомы самцов крыс Fischer 344 метаболизируют 3-хлорнитробензол путем восстановления нитрогруппы с образованием 3-хлоранилина, что указывает на то, что метаболизм между 3,5-DCA и 3,5-DCNB является обратимым. Таким образом, при восстановлении 3,5-ДХНБ образуются 3,5-дихлорнитрозобензол и 3,5-ДХФГА, так же как при окислении 3,5-ДХА образуются эти два метаболита. Однако потенциальный вклад 3,5-DCNB в нефротоксичность 3,5-DCA остается неясным. Если 35-DCNB является нефротоксичным метаболитом, также неясно, требуется ли биотрансформация для образования токсичных химических соединений. Текущие результаты подтверждают, что 3,5-DCNB является токсичным метаболитом3,5-DCA, потенциально способствующим нефротоксичности 3,5-DCA после биотрансформации.

Текущее исследование демонстрирует, что 3,5-DCNB является более сильным нефротоксичным, чем 3,5-DCA при IKC [25]. Кроме того, способность антиоксидантов и ингибиторов окислительной биотрансформации ослаблять цитотоксичность 3,5-DCNB отражает эффекты этих предварительных обработок в снижении цитотоксичности 3,5-DCA при IKC [25]. Эти результаты позволяют предположить, что любой 3,5-DCNB, образующийся во время биотрансформации 3,5-DCA, может способствовать нефротоксичности 3,5-DCA посредством метаболизма 3,5- DCNB снова превращается в 3,5-дихлорнитробензол и 3,5-DCPHA. Однако слабая активность ингибиторов CYP в отношении цитотоксичности 3,5-DCNB предполагает, что другие ферментные системы (например, не-CYP-нитроредуктаза) могут быть ответственны или способствовать восстановлению нитрогруппы в этой модельной системе. . Кроме того, способность антиоксидантов заметно ослаблять цитотоксичность 3.5-DCNB подтверждает роль свободных радикалов, образованных нитрогруппой, и/или активных форм кислорода/азота в механизме нефротоксичности этого соединения. Учитывая заметное ослабление нефротоксичности 3,5-DCNB некоторыми ингибиторами окислительного метаболизма (например, н-октиламином и меркаптосукцинатом), маловероятно, что 35-DCNB непосредственно токсичен для клеток почек, но производит его цитотоксичность через метаболиты. Кроме того, исследования метаболизма 3,5-DCA in vitro показывают, что почечные клетки могут не вырабатывать достаточное количество 3,5-DCNB, чтобы быть ответственным за цитотоксичность 3,5-DCA in vitro. Возможно, внепочечный метаболизм 3,5-DCA продуцирует достаточное количество 3,5-DCNB, чтобы способствовать 3,5-DCA-индуцированной нефротоксичности in vivo, но общий вклад 3,{{ 46}}DCNB–3,5-нефротоксичность DCA требует дальнейшего изучения.

Таким образом, результаты этих исследований показывают, что образующиеся извне метаболиты аминодихлорфенола и метаболиты, возникающие в результате N-окисления, могут способствовать нефротоксичности 3.5-DCA in vivo, в то время как N-ацетилирование {{5} } DCA представляет собой механизм детоксикации. In vitro N-окисление 3,5-DCA является основным механизмом биоактивации 3,5-DCA до цитотоксических метаболитов, а токсичность, скорее всего, опосредована 3,5-дихлорнитрзобензолом и /или 3,5-DCPHA. Кроме того,3,5-DCNB-индуцированная нефротоксичность обусловлена ​​образованием метаболитов, а нефротоксичность 3,5-DCNB также, скорее всего, опосредована 3,5-дихлорнитрзобензолом и/или 35-DCPHA.

4. Материалы и методы

4.1.Животные

Самцов крыс Fischer 344 (200-250 г) получали от Hilltop Lab Animals, Inc. (Скоттс-дейл, Пенсильвания, США). Животных содержали по две крысы в ​​клетке с пищей и водой, доступными вволю, с контролируемой температурой (21-23 градусов), влажностью (40-55 процентов) и светом (12 ч включено/12 ч выключено). Перед использованием всем животным давали по крайней мере одну неделю для акклиматизации в помещениях для животных, аккредитованных Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC). Все виды использования животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Маршалла (Протоколы 447 (5 августа 2010 г.) и 531 (1 февраля 2013 г.)), а эксперименты с использованием животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных. , принятый Национальным институтом здравоохранения.

4.2. Химикаты

Все химические вещества были приобретены в самой высокой чистоте, доступной либо у Fischer Scientific (Питтсбург, Пенсильвания, США), либо у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США), за исключением 3,5-дихлорфенилгидроксиламина (3,{{3}). }DCPHA), 35-дихлорацетанилид (3.5-DCAA) и 2-амино-4,6-дихлорфенол(2-A{{11 }},6-DCP), которые были синтезированы в нашей лаборатории. 3,5-DCPHA был синтезирован путем восстановления 3,5-DCNB с использованием гидразина-палладия на угле по ранее описанному методу Рондестведта и Джонсона [54] и очищен, как описано Valentovic et al. [55]. Синтез и очистку 3,5-DCAA проводили по методу Newell et al. [56] взаимодействием равных количеств 3,5-дихлоранилина и уксусного ангидрида в присутствии ацетата натрия. Для получения 2-A-4,6-DCP, 2,4-дихлорфенола нитровали по методу McMillan et al. [29,57] с последующим восстановлением нитро группу в аминогруппу гидросульфитом натрия в 10-процентном водном растворе гидроксида натрия в соответствии с Newell et al. [56].

4.3. Подготовка и обработка изолированных клеток почек

Изолированные клетки почек(IKC) получали от нелеченых самцов крыс Fischer 344. Самцы крыс Fischer 344 были выбраны в качестве модели для получения изолированных клеток почек, поскольку большинство наших предыдущих данных о токсичности 3,5-DCA было получено на этой модели. Крыс анестезировали пентобарбиталом (75 мг/кг, внутрибрюшинно) и готовили IKC по методу Джонса и др. [58]. с использованием перфузии коллагеназой, как описано Racine et al. [25]. Клетки почек, выделенные с помощью этого метода, обогащены клетками коры почек на основе биохимических характеристик и часто используются в оценках почечной токсикологии [59-63]. Начальная жизнеспособность клеток была определена как ~85-90 процентов по высвобождению лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и исключению трипанового синего (2 процента в/м). Перед инкубацией IKC подсчитывали и ресуспендировали в буфере Krebs-Henseleit (pH 7,37; 25 мМ Hepes; 2% без бычьего сывороточного альбумина) в концентрации ~4,2 миллиона клеток/мл. IKC (3 мл) предварительно инкубировали в поликарбонатных колбах Эрленмейера на 25 мл в течение 5 мин при 37°С в атмосфере 95% кислорода/5% диоксида углерода. После предварительной инкубации клетки подвергались воздействию различных концентраций 3,5-DCNB (0.5-1,5 мМ), 3.5-DCAA({{32} }.5-1.5 мМ),3.5-дихлорфенилгидроксиламин (3,5-DCPHA;0.{{40}}.{{45 }} мМ, 2-A-4, 6-DCP (0.5-1,5 мМ) или носитель (30 мкл ДМСО) до 90 мин. По завершении отведенного инкубационного периода образцы (0,5 мл) были взяты для анализа высвобождения ЛДГ, как описано ранее [20,25].

Для определения ролипочечная биотрансформацияв 3, 5-цитотоксичность DCNB и свободные радикалы в 35-нефротоксичности DCPHA, IKC предварительно обрабатывали либо антиоксидантом, либо ингибитором ферментных систем биотрансформации (таблица 4), либо носителем (30мкл ДМСО) перед воздействием 1,0мМ35-DCNB (60 мин) или 0,5 мМ3,5-DCPHA (60 мин). Все концентрации и время предварительной обработкиантиоксидантыа такжеингибиторы почечных ферментовбыли основаны на ранее опубликованных исследованиях [20,25].

4.4. IKC Метаболизм 3,5-DCA

4.4.1. Инкубация IKC и выделение метаболита

IKC (~4,2 миллиона клеток/мл; 3 мл) инкубировали с 3,5-DCA (0,5 или 1,0 мМ) в буфере Кребса-Хензелейта (KH) ( рН 7,4) в течение 90 мин на водяной бане со встряхиванием в атмосфере 95% кислорода/5% диоксида углерода, как описано выше. Концентрация 0,5 мМ 3,5-DCA является нецитотоксичной концентрацией через 90 мин, в то время как концентрация 1,0 мМ индуцирует цитотоксичность, о чем свидетельствует повышенный выброс ЛДГ. В конце периода инкубации собирали образцы объемом 1,0 мл, а среду и клетки разделяли центрифугированием. Осажденные клетки промывали буфером KH (без бычьего сывороточного альбумина) и добавляли промывочную жидкость в среду. Клетки лизировали с помощью обработки ультразвуком, и белок осаждали добавлением метанола (1,0 мл) ко всем образцам. Образцы центрифугировали (3000 g; 10 мин при 4 градусах), а супернатант фильтровали через шприцевой фильтр 0,45 мкм и хранили при -20 градусах до анализа с помощью ВЭЖХ, как описано ниже.

4.4.2. Определение сульфатных и глюкуронидных конъюгатов

Чтобы определить, образуются ли сульфатные или глюкуронидные конъюгаты, в некоторых экспериментах фракции среды и клеточного супернатанта, полученные, как описано выше, обрабатывали ß-глюкуронидазой (6500 единиц/мл, конечная концентрация) или арилсульфатазой. (200 единиц/мл, конечная концентрация) плюс сахаролактон (20 мМ, конечная концентрация) в течение 18 ч (37 градусов) в 0,1 М ацетатном буфере (рН 5,0) для гидролиза любых образовавшихся глюкуронидных или сульфатных конъюгатов соответственно 26] . Гидролиз останавливали добавлением холодного метанола (2,4 мл). Затем фракции фильтровали и хранили до анализа, как описано выше.

4.4.3. Ингибирование метаболизма CYP2C с помощью DEDCTA

В отдельном эксперименте клетки предварительно обрабатывали диэтилдитиокарбаминовой кислотой (DEDTCA, 0.1 мМ, предварительная обработка в течение 30 минут), ингибитором CYP2C, перед добавлением 3,5-DCA, чтобы определить, какие метаболиты были снижены с помощью DEDTCA. предварительная обработка. После 90-минутного периода инкубации клетки и среды обрабатывали и хранили, как описано выше, для определения концентраций 3,5-DCA и концентраций образовавшихся метаболитов 3,5-DCA.

4.4.4. ВЭЖХ определение метаболитов

Образцы (75 мкл) среды и лизированного IKC анализировали на системе ВЭЖХ Waters Alliance e2695 (Waters Co., Милфорд, Массачусетс, США) с использованием детектора Waters 2489 с переменным УФ/видимым излучением при 254 нМ. Хроматограммы собирали и интегрировали с использованием программного обеспечения Empower 3 (Waters Co., Милфорд, Массачусетс, США). Колонка Waters X Select HSS T3 C18 (3,5 мкм; 4,6×150 мм²), оснащенная Waters XSelect HSS T3. Для разделения соединений использовали картридж VanGuard (3,5 мкм; 3,9×5 мм2).Подвижная фаза состояла из метанола 50:50, воды со скоростью потока 0,75 мл/мин. Стандартные кривые , пределы обнаружения и коэффициенты экстракции были определены для 3,5-DCA и предполагаемых метаболитов. Коэффициенты экстракции были определены путем сравнения интеграции 1,0 мМ3,5-DCA или образца метаболита, подвергшегося обработка (т.е. добавление метанола и центрифугирование) к необработанному 1,0 мМ 35-DCA или образцу метаболита.

4.5. Статистика

Данные представлены как среднее ± SEM с N из {{0}} отдельных экспериментов на животных, за исключением N=3 в эксперименте по метаболизму нетоксичного 0,5 мМ 3,5-DCA. Данные между обработками анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом Тьюки. Значимость определяли на p<0.05. a="" power="" analysis="" was="" performed="" with="" g*="" power="" software="" version="" 3.1.9.7="" for="" f="" tests,="" anova="" (repeated="" measures,="" within="" factors)="" with="" effect="" size="" f="0.85," α="" error="" probability="0.05," power(1-β="" error="" probability)="0.8" and="" actual="" power="0.832," which="" determined="" a="" sample="" size="" of="" n="4" was="" sufficient="" with="" a="" 95%="" confidence="">

Вклад автора: CRR: обзор литературы, проведение работы, анализ и интерпретация данных, участие в написании статьи; МАВ: план эксперимента и интерпретация данных, ДКА: помощь в проведении работы и подготовке статьи; GOR: обзор литературы, план эксперимента, интерпретация данных, написал и отредактировал статью. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование: Это исследование было частично поддержано Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером P20GM103434 GOR. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. .

Заявление Институционального контрольного совета: Все виды использования животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Маршалла (протоколы 447 (5 августа 2010 г.) и 531 (1 февраля 2013 г.)), а эксперименты с использованием животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию животных. Лабораторные животные, принятые Национальным институтом здравоохранения.

Заявление о доступности данных: Данные, представленные в этом исследовании, доступны по запросу у соответствующего автора.

Конфликт интересов: Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

использованная литература

1. Айзава Х. Метаболические карты пестицидов; Academic Press, Inc.: Лондон, Великобритания, 1989 г.; Том 2.

2. Элхардт, В. Дж. Метаболизм и утилизация противоракового агента серы у мышей, крыс, обезьян и человека. Препарат Метаб. Утилизация 1991, 19, 370–375. [В паблике]

3. Риккерт, Д. Д.; Хелд, С.Д. Метаболизм хлорнитробензолов изолированными гепатоцитами крысы. Препарат Метаб. Утилизация 1990, 18, 5–9. [В паблике]

4. Ли, Дж. Б.; Зон, HY; Шин, Канзас; Ким, Дж. С.; Джо, MS; Чон, CP; Чан, Джо; Ким, JE; Квон, Г.С. Микробная биодеградация и токсичность винклозолина и его токсического метаболита 3,5-дихлоранилина. Дж. Микробиол. Биотехнолог. 2008, 18, 343–349. [В паблике]

5. Сантос, ТКР; Роша, Дж. К.; Алонса, RM; Мартинес, Э.; Ибанез, К.; Барсело, Д. Быстрое разложение пропанила в посевах рисовых полей. Окружающая среда. науч. Технол. 1998, 32, 3479–3484. [Перекрестная ссылка]

6. Марлетт, В.Л.; Мартынюк, С.Дж. Биологические реакции на гербициды на основе фенилмочевины у рыб и амфибий; новые направления для характеристики механизмов токсичности. Комп. Биохим. Физиол. С Токсикол. Фармакол. 2017, 194, 9–21. [Перекрестная ссылка]

7. Линд, CH; Литторин, М.; Амилон, А .; Jonsson, BA Анализ 3,5-дихлоранилина в качестве биомаркера винклозолина и ипродиона в моче человека с использованием жидкостной хроматографии/тройной квадрупольной масс-спектрометрии. Быстрое общение. Масс-спектр. 2007, 21, 536–542. [Перекрестная ссылка]

8. Каттинг Б.; Гоэн, Т .; Швеглер, У .; Фромме, Х .; Утер, В .; Ангерер, Дж.; Дрекслер, Х. Моноариламины в общей популяции — перекрестное популяционное исследование, включающее 1004 баварца. Междунар. Дж. Хиг. Окружающая среда. Здоровье 2009 г., 212, 298–309. [Перекрестная ссылка]

9. Турчи Р.; Барисано, А .; Бальдуччи, К.; Колозио, К.; Minoia, C. Определение дихлоранилинов в моче человека с помощью газовой хроматографии/масс-спектрометрии: протокол валидации и установление контрольных значений в группе населения, проживающей в центральной Италии. Быстрое общение. Масс-спектр. 2006, 20, 2621–2625. [Перекрестная ссылка]

10. Вителли, Н.; Чиодини, А .; Колозио, К.; Де Паскаль, Г.; Сомаруга, К.; Турчи, Р.; Минойя, К.; Брамбилла, Г.; Коломби, А. Профессиональное и экологическое воздействие анилидных и дикарбоксимидных пестицидов. Г. итал. Мед. Лав. Эргон. 2007, 29 (Приложение 3), 276–277.

11. Чабра, Р.С.; Томпсон, М.; Элвелл, Миссисипи; Геркен, Д.К. Токсичность п-хлоранилина у крыс и мышей. Пищевая хим. Токсикол. 1990, 28, 717–722. [Перекрестная ссылка]

12. Гильермино, Л.; Соареш, А.М.; Карвалью, А. П.; Лопес М.С. Острые эффекты 3,4-дихлоранилина на кровь самцов крыс Wistar. Хемосфера 1998, 37, 619–632. [Перекрестная ссылка]

13. Пизон А.Ф.; Шварц, АР; Шум, Л.М.; Риттенбергер, Дж. К.; Нижний, ДР; Джаннуцос, С .; Вирджи, Массачусетс; Krasowski, MD Лабораторный токсикологический анализ и воздействие п-хлоранилина на человека. клин. Токсикол. 2009, 47, 132–136. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

14. Кениг, CM; Биверс, К.; Пант, К.; Янг Р.Р. Оценка мутагенного потенциала пара-хлоранилина и анилина в печени, селезенке и костном мозге крыс Big Blue® с анализом микроядер в периферической крови. Окружающая среда. Мол. Мутаген. 2018, 59, 785–797. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

15. Валентович, Массачусетс; Болл, JG; Анестис, ДК; пива, кВт; Мадан, Э .; Хаббард, Дж. Л.; Рэнкин, Г.О. Острая почечная и печеночная токсичность 2-галоанилинов у крыс Fischer 344. Токсикология 1992, 75, 121–131. [Перекрестная ссылка]

16. Валентович, Массачусетс; Болл, JG; Анестис, ДК; Рэнкин, Г.О. Сравнение токсичности структурных изомеров дихлоранилина in vitro. Токсикол. In Vitro 1995, 9, 75–81. [Перекрестная ссылка]

17. Валентович, Массачусетс; Ло, ХХ; Браун, частный детектив; Rankin, GO 3,5-Токсичность дихлоранилина у крыс Fischer 344, предварительно обработанных ингибиторами и индукторами цитохрома P450. Токсикол. лат. 1995, 78, 207–214. [Перекрестная ссылка]

18. Бхуян, Миннесота; Канг, Х .; Ким, Дж. Х.; Ким, С .; Хо, Ю .; Чой, К. Нарушение эндокринной системы несколькими производными анилина и родственными механизмами в клеточной линии надпочечников человека H295R и взрослых самца рыбок данио. Экотоксикол. Окружающая среда. Саф. 2019, 180, 326–332. [Перекрестная ссылка]

19. Хонг, СК; Анестис, ДК; Хендерсон, ТТ; Рэнкин, Г.О. Нефротоксичность in vitro, вызванная галоанилинами: эффекты 4-галоанилинов и 3,5-дигалоанилинов. Токсикол. лат. 2000, 14, 125–133. [Перекрестная ссылка]

20. Расин, К.; Уорд, Д.; Анестис, ДК; Фергюсон, Т .; Престон, Д.; Рэнкин, Г.О. 3,4,5- Нефротоксичность трихлоранилина in vitro: потенциальная роль свободных радикалов и почечная биотрансформация. Междунар. Дж. Мол. науч. 2014, 15, 20900–20912. [Перекрестная ссылка]

21. Бенке, А.; Килхорн, Дж.; Коннекер, Г.; Поленц-Мишель, К.; Мангельсдорфер, I. Краткий международный документ по химической оценке 48 — 4- хлоранилин; Всемирная организация здравоохранения: Женева, Швейцария, 2003 г.

22. Вангнай, А.С.; Катаока, Н.; Сунглердсонгфа, С.; Кслсмбахети, К.; Тадзима, Т .; Като, Дж. Создание и применение биорепортера Escherichia coli для обнаружения анилина и хлоранилина. J. Ind. Microbiol. Биотехнолог. 2012, 39, 1801–1810. [Перекрестная ссылка]

23. Ло, Х. Х.; Браун, частный детектив; Рэнкин Г.О. Острая нефротоксичность, индуцированная изомерными дихлоранилинами у крыс Fischer 344. Токсикология 1990, 63, 215–231. [Перекрестная ссылка]

24. Рэнкин, Г.О.; Ян, ди-джей; Титс, виджей; Ло, ХХ; Brown, PI 3,5-Нефротоксичность, вызванная дихлоранилином, у крыс Sprague-Dawley. Токсикол. лат. 1986, 30, 173–179. [Перекрестная ссылка]

25. Расин, ЧР; Фергюсон, Т .; Престон, Д.; Уорд, Д.; Болл, Дж.; Анестис, Д.; Валентович, М.; Рэнкин, Г.О. Роль биотрансформации и окислительного стресса в 3,5-дихлоранилин (3,5-DCA), индуцированном нефротоксичностью в изолированных клетках коры почек самцов крыс Fischer 344. Токсикология 2016, 341–343, 47–55. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

26. Хонг, СК; Рэнкин, Г.О. Биотрансформация 2-хлоранилина у крыс Fischer 344: идентификация метаболитов в моче. Xenobiotica 1998, 28, 985–994. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

27. Рэнкин, Г.О.; Расин, К.; Суини, А .; Крайни, А .; Анестис, ДК; Барнетт, Дж. Б. Нефротоксичность in vitro, вызванная пропанилом. Окружающая среда. Токсикол. 2008, 23, 435–442. [Перекрестная ссылка]