Нейропротекторные эффекты экстракта листьев Glochidion Zeylanicum против H2O2/глутамат-индуцированной токсичности в культивируемых нейронных клетках и A-индуцированной токсичности в Caenorhabditis Elegans 2

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

3.3. Нейропротекторные эффекты экстракта GZM против индуцированного глутаматом окислительного стресса в культивируемых нейрональных (HT22 и нейро-2a) клетках

Чтобы выяснить, действует ли GZM против окислительного повреждения, был исследован внутриклеточный уровень АФК. Доказательства индуцированной глутаматом токсичности в клетках HT22 и Neuro-2a проявлялись увеличением внутриклеточной продукции АФК (в 1,7-1,9- раз) (рис. 4a,b). Индуцированное глутаматом производство внутриклеточных АФК было явно снижено при совместной обработке экстрактом GZM (рис. 4а, б). Мы дополнительно исследовали эндогенные антиоксидантные ферменты, чтобы поддержать защитные эффекты экстракта GZM при воздействии глутамата. Измеряли экспрессию антиоксидантных ферментов, включая глутатион-S-трансферазу (GST), глутатионпероксидазу (GPx), каталазу (CAT) и супероксиддисмутазу (SOD). В нашем предыдущем исследовании сообщалось, что самая высокая концентрация экстракта GZM (10 мкг/мл) проявляет мощную антиоксидантную активность in vitro и in vivo [11]. В соответствии с отчетом самая высокая концентрация экстракта GZM (10 мкг/мл) проявляла мощную нейропротекцию в клетках HT22 и Neuro-2a (рисунки 2-4). Кроме того, экстракт GZM (10 мкг/мл) увеличивал экспрессию генов антиоксидантных ферментов, включая SOD1, SOD2, GPx, GST и GSTa2, как в клетках HT22, так и в клетках Neuro-2a, за исключением CAT (рис. 4c, d). ). Результаты показывают, что экстракт GZM защищает от цитотоксичности, вызванной глутаматом/H2O2-, путем подавления внутриклеточной продукции АФК и индукции экспрессии антиоксидантных ферментов.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

3.4. Влияние экстракта GZM на экспрессию путей SIRT1/Nrf2

Чтобы определить основной механизм нейропротекторного действия экстракта GZM, мы исследовали уровни экспрессии SIRT1 и Nrf2. Мы обнаружили, что нейроны, обработанные GZM, значительно увеличили уровни белков SIRT1 и Nrf2 (рис. 5а, б). Кроме того, лечение GZM потенциально модулировало сигнальный путь SIRT1/Nrf2, регулируемый антиоксидантными генами NQO1, GCLM, EAAT3 и SIRT1 (рис. 5c, d). Полученные данные показали, что экстракт GZM усиливает сигнальный путь SIRT1/Nrf2, способствуя клеточной защите от токсического воздействия.

3.5.Влияние экстракта GZM на активность роста нейритов в нейро-2а-клетках

Для изучения дифференцировки нейронов в качестве представителей использовали клетки Neuro-2a[18]. В соответствии с предыдущими исследованиями депривация сыворотки (DMEM с добавлением 1% FBS) индуцировала рост нейритов в Neuro-2a [18]. Клетки Neuro-2a, обработанные экстрактом GZM, приводили к усилению нейритогенеза. Клетки Neuro-2a, обработанные экстрактом GZM, увеличили длину нейритов (30,92 мкм) и количество клеток, несущих нейриты (52,35%), по сравнению с контролем (1% FBS) (длина нейритов, 16,30 мкм; несущие нейриты клеток, 22,26% (рис. 6а,б).

цистанхе может омолаживать

Чтобы дополнительно гарантировать возникновение активности роста нейритов, экспрессию маркеров роста нейритов, ассоциированного с ростом белка 43 (GAP-43) [19] и тенурина-4 (Ten-4) [20]. Экстракт GZM значительно повышал экспрессию GAP-43 и Ten{8}} a как на уровне мРНК, так и на уровне белка в клетках Neuro-2a по сравнению с контролем ДМСО (1 процент FBS). ) (рис. 6c-f), что свидетельствует о влиянии экстракта GZM на нейритогенез.

3.6. Нейропротекторные эффекты экстракта GZM против А-индуцированного паралича у C.elegans

Для дальнейшего изучения нейропротекторных эффектов экстракта GZM in vivo использовали трансгенные штаммы C. elegans, экспрессирующие A. Сначала мы исследовали действие экстракта GZM против А-индуцированного паралича на трансгенных червях CL4176 и CL2006. В нашем предыдущем исследовании экстракт GZM показал устойчивость к окислительному стрессу и свойства увеличения продолжительности жизни у C. elegans при нетоксичной концентрации (1-5 мкг/мл)【11】. Контрольный штамм CL802 (не экспрессирующий А) не проявлял паралича, несмотря на обработку (данные не показаны) в тестируемой концентрации (1-5 мкг/мл).cistanche wirkungМы обнаружили, что черви CL4176, обработанные экстрактом GZM, показали заметную задержку PT50 (время, необходимое для паралича 50 процентов нематод) по сравнению с контролем ДМСО (рис. 7а) (таблица S1, дополнительные материалы). Точно так же экстракт GZM также продемонстрировал задержку A-индуцированного паралича трансгенных червей CL2006 во взрослом возрасте (рис. 7b). Результаты показывают, что экстракт GZM защищает C.elegans от A-индуцированного повреждения.

3.7. Нейропротекторные эффекты экстракта GZM против А-индуцированных дефектов хемотаксиса у C.elegans

Чтобы подтвердить нейропротекторное действие экстракта GZM на C.elegans, был проведен анализ хемотаксиса с трансгенными червями CL2122 и CL2355. Было обнаружено, что трансгенные черви CL235 экспрессируют A 1-42 в нейронных клетках, что приводит к дефектам чувствительности к хемотаксису [21]. Поскольку экстракт GZM в концентрации 1-5 мкг/мл задерживает паралич у трансгенных червей CL4176, для всех последующих экспериментов был выбран экстракт 5 мкг/мл GZM. Чтобы определить потенциальное влияние экстракта GZM на поведение хемотаксиса, мы использовали диацетил в качестве аттрактанта. Результаты выражены как индекс хемотаксиса по сравнению с необработанным контролем. Во-первых, мы обнаружили, что обработка экстрактом GZM не влияла на поведение хемотаксиса мутанта CL2122 (трансгенный контрольный штамм) (рис. 7d). Черви CL2355, обработанные экстрактом GZM, продемонстрировали значительно улучшенную хемосенсорную реакцию на аттрактант (диацетил) по сравнению с необработанным контролем (рис. 7c), что указывает на то, что экстракт GZM может улучшить поведение хемотаксиса у C.elegans против A.цитрусовые биофлавоноидыВзятые вместе, влияние экстракта GZM на А-зависимое поведение C. elegans может дать возможность расшифровать опосредованную экстрактом GZM нейропротекцию против AD.

4. Дискуссия

Болезнь Альцгеймера (БА) является нейродегенеративным заболеванием, которое чаще встречается у пожилых людей во всем мире [1]. В настоящее время не существует удовлетворительного лечения широкого спектра патологических состояний, связанных с БА. Окислительный стресс тесно связан с нейродегенеративными заболеваниями, в частности с БА [3].Преимущества киноморияНатуральные продукты, содержащие мощные антиоксиданты, могут использоваться в качестве альтернативного лечения или для профилактики нейродегенеративных заболеваний. В текущем исследовании мы изучали влияние экстракта GZM на нейродегенерацию. Это первый отчет, описывающий нейропротекторное действие экстракта листьев GZ in vitro (культивируемые нейрональные клетки HT22 и Neuro-2a) и in vivo (C.elegans).

Нейронотоксичность, вызванная окислительным стрессом, рассматривается как один из основных факторов, способствующих развитию нейродегенеративных заболеваний, в том числе БА [3]. Высокий уровень глутамата активирует выработку АФК, что приводит к нейротоксичности, повреждению нейронов и, в конечном итоге, к гибели нейронов [4,6]. Кроме того, перекись водорода (H2O2) является распространенным незаменимым медиатором окислительного стресса в нейрональных клетках [22]. Поэтому в этом исследовании в качестве нейротоксических агентов, вызывающих гибель нейронов, использовались глутамат и Н2О2. Для изучения нейропротекторного действия при токсичности глутамата использовали нейрональные клетки НТ22 гиппокампа мыши, лишенные ионотропных рецепторов глутамата [6]. Кроме того, клетки нейробластомы мыши Neuro-2a широко используются в качестве представителей при изучении отростка нейритов и дифференцировки нейронов [23]. Во-первых, нейропротекторные эффекты экстракта GZM против токсичности, вызванной H-Oz/глутаматом, были определены с использованием клеток HT22 и Neuro-2a. Мы обнаружили, что экстракт GZM оказывает сильное нейропротекторное действие против цитотоксичности, вызванной глутаматом/H2O2-как в клетках HT22, так и в клетках Neuro-2a.

Окислительный стресс при воздействии глутамата может быть причиной структурной деградации, повреждения ДНК и дисфункции митохондрий, играющих важную роль в гибели нейронов [6]. В нашем исследовании жизнеспособность клеток, обработанных одним глутаматом, была удивительно низкой (примерно на 50 процентов ниже) по сравнению с необработанными контрольными клетками. Кроме того, заметное повышение внутриклеточного уровня АФК было обнаружено в клетках HT22 (в 1,7-раз) и Neuro-2а (в 1,9 раза) при обработке глутаматом по сравнению с необработанным контролем. Следовательно, цитотоксичность, вызванная глутаматом, в нейрональных (HT22 и Neuro-2a) клетках действительно связана с увеличением внутриклеточных АФК, что подтверждается предыдущими сообщениями [24]. Эндогенные антиоксидантные ферменты, CAT, SOD, GST и GPx играют важную роль в нейропротекции, предотвращая опосредованное АФК повреждение клеток [25-27]. Мы обнаружили, что экстракт GZM может противодействовать цитотоксичности, вызванной H-Oz/глутаматом, путем подавления внутриклеточной Производство АФК и увеличение экспрессии генов антиоксидантов, соответствующих предыдущему отчету, в котором экстракты GZ стимулировали экспрессию Sod-3 и Gst-4 у C.elegans [11].

Фактор транскрипции NRF2 (нуклеарный фактор, эритроидный 2-родственный фактор 2) является основным клеточным механизмом ответа на окислительный стресс и повреждение клеток [28-31]. Сигнальный путь SIRT1/Nrf2 является важным сигнальным путем для балансировки окислительного стресса, который активно участвует в различных нейродегенеративных заболеваниях [25,26]. SIRT1 управляет факторами транскрипции, включая Nrf2, который действует как основной регулятор системы антиоксидантной защиты. Nrf2 связывается с элементом антиоксидантной реакции (ARE), что приводит к усилению экспрессии ферментов детоксикации (фаза II) (GPx, GSTol и GSTa2) и генов антиоксидантов (SOD, CAT, NQO1, GCLM и EAAT3) [25,26] .Согласно сообщениям, экспрессия белков SIRT1 и Nrf2, а также генов антиоксидантов, включая NQO1, GCLM, EAAT3 и SIRT1, повышалась при лечении GZM. Кроме того, экспрессия эндогенного антиоксидантного фермента также значительно увеличила SOD, GPx, GSTol и GSTa2, что может быть связано с активацией Nrf2/ARE. Результаты согласуются с нашим предыдущим исследованием, в котором было продемонстрировано, что экстракты GZleaf обеспечивают свойства устойчивости к окислительному стрессу у C. elegans посредством механизмов, зависимых от SKN-1/Nrf-2 [11]. В совокупности наши результаты показывают, что антиоксидантные защитные свойства экстракта GZM в культивируемых нейрональных (HT22 и Neuro-2a) клетках связаны с сигнальным путем SIRT1/Nrf2. Было показано, что NRF2 влияет на направление метаболизма глутамата, полученного из глутамина, включая образование антиоксиданта глутатиона (GSH) для поддержания окислительно-восстановительного гомеостаза [13]. В этом исследовании мы сначала сосредоточимся на антиоксидантных свойствах экстракта GZM через сигнальный путь SIRT1/Nrf2, который является хорошо известной антиоксидантной защитой. Мы обнаружили, что экстракт GZM усиливает сигнальный путь SIRT1/Nrf2, способствуя клеточной защите от токсического воздействия. Тем не менее, исследование влияния экстракта GZM на сигнальный путь SIRT1/Nrf2 в условиях индуцированной глутаматом токсичности является интересной темой для подтверждения антиоксидантных свойств экстракта GZM через сигнальный путь SIRT1/Nrf2.

Дисбаланс между свободными радикалами и антиоксидантами (оксидативный стресс) связан с прогрессированием нейродегенеративных заболеваний [1,3]. В течение последнего десятилетия полифенольные соединения широко изучались с точки зрения нейропротекторного действия из-за их антиоксидантных свойств [13, 32-35].метод экстракции флавоноидовpdfБолее того, непрямые антиоксидантные соединения [36] (умеренные антиоксидантные системы и родственные пути, но не прямое взаимодействие с активными частицами), такие как докозагексаеновая кислота (ДГК) [37], витамин К [38] и синапиновая кислота [39], появились в альтернативное лечение нейродегенеративных заболеваний. Принимая во внимание вышеизложенное, наши выводы подтверждаются тем, что благотворное влияние GZM на нейропротекторное действие, возможно, зависит от его антиоксидантной активности.

Нейритогенез или рост нейритов играет важную роль в развитии нейронов [32].пустынный гиацинтСвойства роста нейритов экстракта GZM определяли с использованием клеток Neuro-2a. Было показано, что экстракт GZM проявляет активность роста нейритов, поскольку он увеличивает длину нейритов и количество клеток, несущих нейриты. Кроме того, эти явления были дополнительно подтверждены повышенной экспрессией маркеров роста нейритов GAP-43 и Ten-4. В нескольких исследованиях сообщалось, что полифенолы, включая галловую кислоту [32,34], катехин 13,40,41] и кверцетин [33,42,43], способствуют активности роста нейритов. Присутствие фенольных соединений, а также галловой кислоты, катехина и кверцетина в экстракте GZM может быть причиной наблюдаемого поведения (дополнительный рисунок S1) [1,12].

Бляшки А и тау-белки являются хорошо известными признаками БА [4,45]. Аномальная продукция и отложение А играют важную роль в патогенезе БА [44]. C.elegans является полезным модельным организмом для понимания возрастной нейродегенерации [47]. У этого червя основная нервная система содержит всего 302 нейрона, которые полностью картируют связность нейронов [47]. Более того, у трансгенного червя наблюдается накопление белковых карбонилов и АФК, сходное с патологией БА [48]. Таким образом, мы использовали установленную корреляцию между экспрессией A и очевидными симптомами, включая поведение паралича и хемотаксиса, в модели трансгенных C.elegans. Сначала был исследован фенотип паралича у А, экспрессирующих (в мышцах) штаммы CL4176 и CL2006. Экстракт GZM отсрочил индуцированное A начало и возрастной паралич у трансгенных червей CL4176 и CL2006 соответственно. Чтобы связать токсичность А с неврологическими функциями, исследовали поведение хемотаксиса экспрессирующего А штамма (в нейронах) CL2355. Было обнаружено, что экстракт GZM демонстрирует улучшение поведенческих дефектов хемотаксиса у трансгенных червей CL2355 против A. В совокупности эти результаты показывают, что экстракт GZM защищает мышечные и неврологические функции у C. elegans от индуцированной A токсичности. Различные исследования показали, что факторы транскрипции DAF-16 и SKN-1 играют решающую роль в отложении А у нематод [47,48]. В наших предыдущих исследованиях мы доказали, что экстракт листьев GZM может стимулировать устойчивость к окислительному стрессу через сигнальные пути DAF-16/FoxO и SKN-1/Nrf-2, что приводит к улучшению продолжительность жизни и здоровье C. elegans [11]. Мы предполагаем, что DAF-16/FoxO и SKN-1/Nrf-2 могут играть роль в опосредованной экстрактом GZM защите от токсичности A.

В нескольких исследованиях сообщалось, что фенольные антиоксиданты могут защищать от нейротоксичности, вызванной глутаматом, пептидами А и окислительного стресса, который в основном зависит от сигнальных путей Nrf2/ARE [13,17,49-52]. Экстракт GZM содержит фенольные соединения, включая галловую кислоту, катехин и кверцетин (дополнительный рисунок S1) [1,12]. Таким образом, нейропротекторные эффекты, опосредованные сигнальным путем SIRT1/Nrf2, могут быть результатом присутствия биоактивных соединений в экстракте GZM. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить участие нейропротекторных эффектов и изучить больше возможных мишеней экстракта GZM.

5. Выводы

В заключение, в этом исследовании были продемонстрированы нейропротекторные эффекты экстракта GZM против токсичности, вызванной H2O2/глутаматом/A, и свойства роста нейритов. Экстракт GZM защищает от окислительной токсичности, вызванной H4O2/глутаматом, путем ингибирования накопления внутриклеточных АФК и увеличения эндогенных антиоксидантных ферментов через сигнальный путь SIRT1/Nrf2. Более того, экстракт GZM защищает C. elegans от индуцированной А токсичности. В дополнение к своим нейропротекторным эффектам экстракт GZM продемонстрировал благотворное влияние на активность роста нейритов. Основными мишенями нейропротекторной терапии стали антиоксиданты, взаимосвязанные в процессе преодоления токсичности, вызванной окислительным стрессом, и активности, индуцирующей рост нейритов. Экстракт GZM обладает нейропротекторными свойствами, которые не только защищают от токсичности, вызванной H2O2/глутаматом/A, но также способствуют активности роста нейритов. Нейропротекторные эффекты экстракта GZM были успешно подтверждены на культивируемых нейронах (HT22 и Neuro-2a) и моделях C. elegans. Настоящее исследование впервые подтверждает благотворное нейропротекторное действие экстракта GZM, предполагая, что G.zeylanicum может быть кандидатом в нейропротекторы для профилактики и лечения БА и других нейродегенеративных расстройств, связанных с окислительным стрессом. Однако необходимы дальнейшие исследования на более сложных модельных организмах, чтобы осветить активные компоненты экстракта GZM и механизмы, участвующие в нейропротекции, чтобы подтвердить терапевтический потенциал растительных экстрактов для альтернативного или дополнительного лечения нейродегенеративных заболеваний.

Эта статья взята из Biology 2021, 10, 800. https://doi.org/10.3390/biology10080800 https://www.mdpi.com/journal/biology