NGF модулирует метаболизм холестерина и стимулирует секрецию ApoE в глиальных клетках, обеспечивая нейропротекцию против окислительного стресса. Часть 2

2.6. NGF-опосредованная секреция ApoE с помощью U373 защищает нейрональные клетки от окислительного повреждения

Накопленные данные подчеркивают, что ApoE повышает устойчивость нейронов к окислительным повреждениям, тем самым предотвращая апоптоз и нейродегенерацию [17,18,37]. В этом контексте мы оценили, может ли индуцированная NGF секреция ApoE клетками U373 защитить нейроны N1E-115 от окислительного стресса. Полностью дифференцированные N1E-115 предварительно обрабатывали ротеноном, который вызывает окислительный стресс путем ингибирования митохондриального комплекса I.

Апоптоз — это процесс самоуничтожения, и это важный способ для клеток поддерживать гомеостаз организма посредством запрограммированного самоуничтожения при определенных обстоятельствах. Апоптоз играет разную роль на разных этапах жизни.

Недавние исследования показали, что существует определенная связь между апоптозом и памятью. Мы уже знаем, что память — это сложный нейронный процесс в мозге, включающий связи и координацию между несколькими областями мозга. Апоптоз может играть роль в этом нервном процессе.

С одной стороны, апоптоз может стабилизировать сетевую структуру нейронов, очищая ненужные нейроны и синапсы, делая связи нейронов более тонкими, тем самым улучшая качество и эффективность памяти. С другой стороны, чрезмерный апоптоз может также привести к уменьшению количества клеток мозга, что может негативно повлиять на хранение и запись воспоминаний.

Таким образом, поддерживая соответствующий уровень апоптоза, мы можем улучшить память с помощью ряда действий и навыков, таких как чтение, обучение, физические упражнения и корректировка нашего мышления. Такое поведение и навыки могут способствовать росту и соединению клеток мозга, а также улучшать качество и эффективность памяти, стимулируя связи и координацию между нейронами мозга.

В заключение отметим, что взаимосвязь между апоптозом и памятью сложна. Только поддерживая правильный апоптоз, мы можем стимулировать наш мозг и улучшать память с помощью различных моделей поведения и навыков. С этой точки зрения нам необходимо улучшить нашу память. Cistanche Deserticola может значительно помочь нам улучшить нашу память, поскольку Cistanche Deserticola также может регулировать баланс нейротрансмиттеров, например, повышая уровень ацетилхолина и факторов роста. Эти вещества важны для памяти. Это очень важно для обучения и обучения. Кроме того, мясо из мяса также может улучшить текучесть крови и способствовать транспортировке кислорода, что может гарантировать получение мозгом достаточного количества питательных веществ и энергии, тем самым повышая жизнеспособность и выносливость мозга.

improve working memory

Нажмите «Знайте добавки для улучшения памяти»

После 16 часов воздействия ротенона нейроны N1E-115 культивировали в свежей среде (Ctrl), кондиционированной среде из клеток U373 (U373-Ctrl), кондиционированной среде из U373, предварительно обработанной NGF, в течение 48 часов. (U373-NGF) или кондиционированную среду из ApoE-заглушенного U373, предварительно обработанную NGF в течение 48 часов (U373-NGF ApoE siRNA). Предварительная обработка ротеноном значительно снизила количество N1E-115, культивируемых в контрольной среде, что указывает на то, что введение этого пестицида серьезно влияет на выживаемость N1E-115.

Цитотоксичность ротенона также обусловливала интенсивную ретракцию нейритов, что наблюдалось по длине нейритов. Повреждение нейритов, вызванное обработкой ротеноном, было особенно очевидным при оценке клеток, несущих нейриты, поскольку количество N1E-115 с нейритами снизилось до 50%. Аналогичные результаты были получены при культивировании клеток N1E-115 в среде, кондиционированной U373-Ctrl, что позволяет предположить, что наличие супернатанта, полученного из нестимулированных астроцитов, недостаточно для защиты нейрональных клеток от ротенон-опосредованной токсичности. Напротив, применение кондиционированной среды, полученной из U373, обработанного NGF, эффективно предотвращало гибель нейронов, а также уменьшение числа несущих нейритов клеток и длины нейритов, вызванное введением ротенона (рис. 5).

Что еще более важно, кондиционированная среда, полученная из ApoE-молчащих клеток U373, полностью утратила полезные эффекты, индуцированные средой, кондиционированной U373-NGF, что указывает на то, что нейропротекция обусловлена NGF-опосредованным высвобождением ApoE в культуральной среде. Примечательно, что кондиционированная среда из U373, обработанного NGF, трансфицированная скремблированной миРНК, полностью сохраняла защитные эффекты, оказываемые средой, кондиционированной U373-NGF, демонстрируя, что потеря нейропротекции, наблюдаемая в кондиционированной среде из клеток, молчащих по ApoE, эффективно зависит от ApoE. понижающая регуляция (рис. S3C).

supplements to boost memory

Рисунок 5. Влияние кондиционированной среды U373 на окислительный стресс в нейронах. Репрезентативные изображения в светлом поле и количественная оценка морфологии нейронов N1E-115. Клетки предварительно обрабатывали (+) или не обрабатывали (-) ротеноном (0,1 мкМ) в течение 16 часов, а затем культивировали в свежей DMEM (Ctrl) в кондиционированной среде, полученной из контрольного U373 (U{{ 9}}Ctrl), U373, предварительно обработанный NGF (U373-NGF), и U373, предварительно обработанный NGF, подавленный в отношении апоЕ (миРНК U373-NGF ApoE) в течение 48 часов. n=5 разных экспериментов. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. Статистический анализ оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Для усиления результатов, полученных на кондиционированной среде, мы провели совместные культуры U373/N1E115. Для начала клетки U373 предварительно обрабатывали или не обрабатывали NGF в течение 48 часов. Кроме того, дифференцированные клетки N1E-115 предварительно обрабатывались или не обрабатывались ротеноном в течение 16 часов. Впоследствии среду U373 заменяли свежей средой, содержащей 0,5% FBS, а покровные стекла, засеянные N1E-115, переносили на слой U373 для подготовки совместных культур (рис. 6А).

Окислительное повреждение, вызванное обработкой ротеноном, значительно повлияло на клетки, несущие виабилиневриты, и длину нейритов контрольных N1E-115 и N1E-115, совместно культивированных с астроцитами U373-Ctrl (рис. 6B). В соответствии с экспериментами с кондиционированной средой, клетки N1E-115, культивированные совместно с клетками U373-NGF, были защищены от окислительного повреждения, тогда как подавление ApoE в U373 отменяло нейропротекцию, поддерживаемую NGF.

improve cognitive function

Рисунок 6. Секреция АроЕ обработанными NGF клетками U373 обеспечивает нейрозащиту от окислительного стресса. (A) Репрезентативная схема совместных культур астроцитов и нейронов, созданная, как описано в разделе «Материалы и методы». Клетки, несущие нейриты, длину нейритов и количество клеток оценивали через несколько часов после начала совместного культивирования. (B) Репрезентативные изображения в светлом поле и количественная оценка морфологии нейронов клеток N1E-115, ранее обработанных (+) или не (-) ротеноном (0,1 мкм) в течение 16 часов.

N1E-115 затем хранили в свежей DMEM (Ctrl) или совместно культивировали с контролем U373 (U373-Ctrl), U373, предварительно обработанным NGF (U373-NGF), и U373, предварительно обработанный NGF, подавлял активность ApoE (миРНК U{{12}NGNGApoE) в течение 48 часов. n=5 разных экспериментов. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

3. Обсуждение

Дисбаланс сигнальных путей нейротрофинов, а также изменения метаболизма холестерина в мозге тесно связаны с неврологическими и нейродегенеративными заболеваниями, такими как синдром Ретта, HD, болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Паркинсона (БП) [2,38,39] . В этом контексте фундаментальные исследования биологической активности нейротрофинов имеют решающее значение для анализа молекулярных механизмов, связывающих метаболизм холестерина и физиопатологию мозга. В течение последних нескольких лет в интересном исследовании сообщалось о роли BDNF в регуляции метаболизма холестерина в астроцитах [38].

Несмотря на это мнение, нет информации о предполагаемом участии NGF в регуляции астроцитарного холестерина. Поэтому в этой работе мы сосредоточились на предполагаемой роли NGF в регуляции метаболизма холестерина, уделяя особое внимание влиянию секреции ApoE на дифференцировку и выживаемость нейронов. U373, линия клеток астроцитомы, используемая в качестве экспериментальной модели астроцитов человека, сохраняет потенциал полностью реагировать на NGF, поскольку экспрессирует значительные уровни как TrkA, так и p75NTR.

Основные результаты показали, что NGF повышает уровень основных белков, участвующих в биосинтезе холестерина (HMGCR), внутриклеточном транспорте (NPC1) и секреции (ABCA1). Эти события сопровождаются одновременным повышением уровня АроЕ и холестерина в культуральной среде, что позволяет предположить, что NGF увеличивает биосинтез холестерина и его экструзию из глиальных клеток. Сообщалось, что NGF индуцирует экспрессию белка ApoE за счет увеличения его транскрипции [40]. Однако мы не наблюдали каких-либо существенных изменений во внутриклеточной экспрессии АроЕ. Это кажущееся несоответствие можно объяснить тем, что накопление АроЕ невозможно оценить из-за его повышенного оттока из UIn, обработанного NGF.
В попытке лучше разобраться в молекулярных механизмах мы обработали U373 LM11A-31 и обнаружили, что модулятор p75NTR способен только имитировать повышение экспрессии HMGCR, опосредованное NGF. Участие p75NTR в модуляции уровней HMGCR согласуется с предыдущими данными, полученными на других типах клеток, показывающими, что этот рецептор контролирует транскрипцию холестериногенных ферментов [41]. Однако LM11A-31 не вызывал никаких изменений ни в других белках, проанализированных в этом исследовании, включая ABCA1, ни в уровнях холестерина и АроЕ в культуральной среде, что указывает на то, что селективная модуляция p75NTR недостаточна для повышения уровня холестерина. экструзия через частицы, богатые ApoE, наблюдаемая в клетках, обработанных NGF. Эти результаты позволяют нам предположить, что NGF регулирует метаболизм холестерина в глиальных клетках посредством участия как рецепторов p75NTR, так и TrkA.

Хорошо известно, что связывание нейротрофина с рецепторами Trk активирует ERK1/2, регулируя тем самым несколько путей, участвующих в дифференцировке, пролиферации и выживании клеток [2,38]. Интересно, что было замечено, что активация ERK1/2 также регулирует экспрессию ABCA1 и ApoE в разных типах клеток [38,42,43]. Эти данные, а также данные о том, что ось BDNF/TrkB/ERK способствует экструзии ApoE и экспрессии ABCA1 в глиальных клетках [38], позволяют предположить, что путь передачи сигнала, включающий ось TrkA/ERK, может частично объяснить эффекты, оказываемые NGF. в нашем исследовании.

ways to improve your memory

Хотя никаких изменений в росте нейритов не наблюдалось, использование среды, кондиционированной U373-, и проведение экспериментов по совместному культивированию показали, что повышенная секреция АроЕ из глиальных клеток, опосредованная NGF, является определяющим фактором для предотвращения вредных последствий, вызванных окислительными реакциями. стресс в нейрональных клетках. Чтобы вызвать цитотоксичность, мы использовали ротенон, пестицид, обычно используемый в доклинических исследованиях для индукции митохондриальных активных форм кислорода (АФК) и последующего апоптоза [44].

Наши результаты подчеркивают, что NGF стимулирует секрецию ApoE глиальными клетками, что необходимо для обеспечения нейропротекторного эффекта против введения ротенона в дифференцированные клетки N1E-115. Роль АроЕ в предотвращении окислительного стресса хорошо документирована. Например, истощение АроЕ на мышиных моделях усугубляет окислительное повреждение ткани головного мозга [45,46]. Соответственно, введение экзогенного АроЕ защищает от необратимого окислительного повреждения в результате обработки перекисью водорода, противодействуя вторичной токсичности глутамата [18]. Кроме того, ApoE-содержащие липопротеины эффективны в ослаблении апоптоза, вызванного прекращением трофической поддержки в ганглиозных нейронах сетчатки [47].

В нашем исследовании использование ротенона предполагает, что ApoE-опосредованная нейропротекция, которой способствуют NGF-стимулированные глиальные клетки, может быть актуальной в контексте нейродегенеративных состояний, таких как болезнь Паркинсона. Примечательно, что ротенон воспроизводит дегенерацию дофаминергических нейронов, аналогичную той, которая наблюдается при БП, как на животных моделях, так и в клеточных культурах, включая нейроны, происходящие из N1E-115- [48–50]. В целом, наши результаты подтверждают предыдущие данные, показывающие, что ApoE вызывает нейропротекцию при введении 6-гидроксидофамина (6-OHDA), другого нейротоксина, способного индуцировать PD-подобный фенотип [51]. В совокупности наше исследование показывает, что NGF является важным модулятором метаболизма холестерина и экструзии ApoE из глиальных клеток. Самое главное, что усиление секреции АроЕ, которому способствует этот нейротрофин, необходимо для обеспечения нейропротекции против цитотоксичности ротенона.

BDNF является наиболее распространенным нейротрофином в мозге взрослого человека. Несмотря на эти данные, было показано, что NGF может играть решающую роль не только во время развития, но и в центральной нервной системе взрослого человека. Например, NGF влияет на активность гиппокампа и, как следствие, на пространственную память и обучение [52]. Другие данные свидетельствуют о том, что NGF оказывает нейропротекторное действие на нигростриарные дофаминергические нейроны и что эта активность может заложить основу для новых терапевтических подходов на основе NGF для лечения БП [53].

Согласно этому представлению было показано, что продукция NGF глубоко регулируется в астроцитах во взрослом возрасте и оказывает модулирующее действие на нейровоспаление, повреждение головного мозга и нейродегенерацию [54–56]. В этом контексте было бы интересно оценить в будущих исследованиях, могут ли эти эффекты быть опосредованы, по крайней мере частично, модуляцией глиального холестерина, стимулируемой NGF. В настоящей работе представлены некоторые ограничения, которые необходимо преодолеть в следующих экспериментальных исследованиях; например, было бы важно лучше проанализировать молекулярные механизмы, связывающие лечение NGF и метаболизм холестерина в глиальных клетках.

Широкое понимание полезно для идентификации конкретных молекулярных мишеней, поддающихся фармакологическим манипуляциям, которые можно использовать в нейродегенеративных контекстах. Более того, хотя клетки U373 и N1E-115 широко используются в качестве управляемых клеточных линий для воспроизведения астроцитарных и нейрональных свойств соответственно [27–29,57], эти результаты должны быть дополнительно подтверждены в первичных клеточных культурах. Хотя необходимы дальнейшие усилия для усиления участия передачи сигналов нейротрофинов в гомеостазе холестерина в мозге, эта работа впервые демонстрирует, что NGF может косвенно оказывать нейропротекцию, влияя на метаболизм глиального холестерина.

4. Материал и методы.

4.1. Культура клеток

Клетки нейробластомы N1E-115 и клетки U373 культивировали при 5% CO2 в DMEM при высоком уровне глюкозы (Merck Life Science, Милан, Италия) с 10% (об./об.) фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Merck Life Science). , Милан, Италия) и добавляли раствор пенициллина/стрептомицина.

Чтобы вызвать дифференцировку нейронов, клетки N1E-115 высевали при конфлюентности 30% и переключали на DMEM с 0,5% FBS на 96 часов.

Совместные культуры астроцитов и нейронов создавали в соответствии с протоколом, описанным Иоанну и его коллегами, с модификациями [59]. Для обеспечения прилегания к покровным стеклам прижимали парафиновые прокладки; мы использовали прокладки на покровных стеклах нейронов, чтобы эффективно предотвратить механические повреждения, когда клетки располагались лицом друг к другу. Затем покровные стекла стерилизовали в этаноле и покрывали поли-D-лизином (Merck Life Science, Милан, Италия). N1E-115 высевали на покрытые покровные стекла с желаемой плотностью и, когда они были готовы к совместному культивированию, стерильными щипцами поднимали покровные стекла с нейронами N1E-115 и помещали их лицевой стороной вниз в { {10}}лунки, засеянные астроцитами U373.

Предварительную обработку клеток N1E-115 проводили путем введения 0,1 мкМ ротенона (Sigma-Aldrich, Милан, Италия, R8875) в течение 16 часов. Контрольные клетки получали ДМСО (разведение 1:1000 в среде культуры клеток) в качестве носителя. Клетки U373 обрабатывали NGF (Alomone Labs, Иерусалим, Израиль, N-245) в дозе 100 нг/мл в течение 48 часов во всех экспериментах.

4.2. Приготовление лизата и вестерн-блот-анализ

Клетки U373 обрабатывали ультразвуком (рабочий цикл 20%, выход 3) в буфере для образцов (0,1 Tris-HClisHCl, содержащий 10% SDS, коктейль ингибиторов протеаз, pH 6,8) для получения общего лизата, как описано ранее [ 60,61]. Добавляли буфер Лэммли и образцы денатурировали при 95 ◦C в течение 5 мин. Белковые экстракты (двадцать микрограммов белков) разделяли с помощью SDS-PAGE, а перенос на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли с использованием системы транс-блот-турбопереноса (Biorad Laboratories, Милан, Италия), как сообщалось ранее [62].

Затем мембрану инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа с 5% обезжиренным сухим молоком в трис-солевом буфере (25 мМ трис-HCl, 138 мМ NaCl, 27 мМ KCl, 0,05% твин{). {10}}, pH 6,8) и зондировали в течение ночи при 4 ◦C со следующими первичными антителами: анти-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc-271708, разведение 1:500), анти- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc-118, разведение 1:500), анти-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc-8984 , разведение 1:1000), анти-SREBP-2 (Abcam, Кембридж, Великобритания, ab30682, разведение 1:1000), анти-HMGCR (Abcam, Кембридж, Великобритания, ab242315, разведение 1:1000), анти-ЛПНП (Abcam, Кембридж, Великобритания, ab30532, разведение 1:500), анти-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, США, NB400-148, разведение 1:3000) ), антиABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, подкожно -58219, разведение 1:400), анти-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, подкожно -53570, разведение 1) :400), антивинкулин (SigmaAldrich, Милан, Италия, V9264, разведение 1:10 000) и анти- -актин (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc-47778, разведение 1). :10 000).

Мембраны последовательно инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с конъюгированными с HRP вторичными антимышиными или антикроличьими антителами (Bio-Rad Laboratories, Милан, Италия). Связанные с белками антитела визуализировали с помощью вестерн-блоттинга ECL (Bio-Rad Laboratories, Милан, Италия, № 1705061), а хемилюминесценцию регистрировали с помощью системы ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Милан, Италия). Затем проводили денситометрический анализ, полученный с помощью вестерн-блоттинга, с использованием программного обеспечения ImageJ версии 1.52t (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США) для Windows. Винкулин или -актин использовались в качестве вспомогательных белков, которые служили внутренним контролем загрузки белка. Денситометрические расчеты были получены в произвольных единицах, полученных из соотношения между интенсивностью белковой полосы и соответствующего белка домашнего хозяйства.

4.3. Окрашивание Oil Red O

Клетки U373 высевали на покровные стекла, покрытые поли-L-лизином (Sigma-Aldrich, P6282-5MG), в планшеты с лунками 6- и окрашивали масляным красным O, как сообщалось ранее [60]. Вкратце, клетки фиксировали в параформальдегиде (4% раствор) в течение 10 минут и осторожно трижды промывали PBS. Фиксированные клетки инкубировали с 60%-ным изопропанолом в течение 5 мин, а затем промывали дистиллированной водой. Затем клетки зондировали 1 мл рабочего раствора Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) в течение 15 минут при комнатной температуре, помещая планшет с лунками 6- на шейкер с орбитальным ротатором. После инкубации с красящим раствором лунки трижды промывали дистиллированной водой для удаления излишков красителя.

Покровные стекла наконец фиксировали с помощью монтажной среды Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182), а автофлуоресценцию масляного красного O визуализировали с помощью конфокальной микроскопии (TCS SP8; Leica, Вецлар, Германия). Изображения были получены с помощью Leica TCS SP8 с 63-кратным увеличением и программного обеспечения Leica LAS X (Милан, Италия). Количественную оценку окрашивания масляным красным O проводили с помощью программного обеспечения ImageJ для Windows и рассчитывали как среднюю интенсивность флуоресценции на площадь клетки.
4.4. Филиппинское окрашивание

Окрашивание филиппином осуществляли с использованием филиппинового комплекса (Sigma-Aldrich, F9765). Маточный раствор филипина (10 мг/мл в PBS) всегда готовили непосредственно перед использованием. Клетки фиксировали в параформальдегиде (4% раствор) в течение 10 мин и промывали PBS. Затем U373 окрашивали 1 мл рабочего раствора филиппина (0,05 мг/мл в PBS) в течение 1 часа в темноте при комнатной температуре. Затем клетки трижды промывали PBS, покровные стекла помещали в среду для монтажа Fluoroshield и сразу же анализировали с помощью конфокальной микроскопии с использованием набора УФ-фильтров (возбуждение 340–380 нм). Изображения были получены при 40-кратном увеличении. Количественное определение филиппина рассчитывали как среднюю интенсивность флуоресценции на площадь клетки с использованием программного обеспечения ImageJ для Windows.

4.5. Количественное определение холестерина

Количественное определение холестерина проводили с использованием колориметрического анализа (набор для количественного определения холестерина, MAK043, Sigma-Aldrich, Милан, Италия) в соответствии с инструкциями производителя.

4.6. ИФА
Уровни АроЕ в культуральной среде оценивали с использованием набора ELISA для аполипопротеина Е человека (Abcam, Кембридж, Великобритания, ab108813) в соответствии с инструкциями производителя.

4.7. Иммунофлуоресценция

Иммунофлуоресценцию клеток U373 проводили, как описано ранее [60]. U373 фиксировали в параформальдегиде (4% в PBS) и зондировали в течение ночи первичными антителами: анти-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc-271708, разведение 1:100) и анти-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc-118, разведение 1:100). Затем клетки инкубировали в течение 1 часа с козьим вторичным антителом против мыши Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США, A28180) и с козьим вторичным антителом против кролика Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). , А27034). Окрашивание DAPI проводили для визуализации ядер, а покровные стекла наконец фиксировали с помощью среды для монтажа Fluoroshield. Образцы анализировали с помощью конфокальной микроскопии, как описано выше.

improve brain

4.8. Отключение ApoE

Замалчивание мРНК АроЕ проводили на клетках U373 с использованием миРНК АроЕ (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc-29708) в соответствии с инструкциями производителя. Трансфекцию проводили в 6-луночном планшете для культуры ткани, где по 100000 клеток на лунку высевали в не содержащую антибиотиков среду роста DMEM, дополненную 10% FBS, на 24 часа. В каждую лунку среду для трансфекции siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc-36868) добавляли к раствору для реакции трансфекции siRNA, приготовленному с использованием дуплекса siRNA и реагента для трансфекции siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США, sc29528). Затем клетки один раз промывали средой для трансфекции siRNA и покрывали ранее приготовленной смесью для трансфекции. Затем культуральный планшет инкубировали в течение 7 часов при 37 ◦C в инкубаторе с 5% CO2.

Среду роста DMEM с 20% FBS и антибиотиками (в 2- раза превышающей нормальную концентрацию) добавляли к трансфекционной смеси в каждой лунке в соотношении 1:1. Клетки инкубировали в течение 18 ч, затем среду сливали и заменяли свежей нормальной ростовой средой; Через 24 часа после последнего этапа клетки были готовы к использованию для дальнейших экспериментов. Эффективность подавления ApoE оценивали с помощью RT-qPCR в клетках U373 и с помощью ELISA в клеточном супернатанте; SiRNA ApoE эффективно предотвращала индукцию ApoE с помощью NGF по сравнению с siRNA скремблирования (мРНК ApoE: снижение на 83%; ELISA ApoE: снижение на 78%). Примечательно, что экспрессия ApoE после подавления siRNA была ниже, чем базальные уровни экспрессии, наблюдаемые в контрольном U373 (мРНК ApoE: снижение на 72%; ELISA ApoE: снижение на 58%) (рис. S3A, B).

4.9. Экстракция РНК и ПЦР в реальном времени

Анализ мРНК проводили, как сообщалось ранее [22,63]. Вкратце, тотальную РНК из клеток U373 экстрагировали с помощью реагента TRI (Merck Life Science, Милан, Италия) в соответствии с инструкциями производителя. Проводили обработку ДНКазой (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Милан, Италия), а затем очищали РНК с использованием набора для очистки РНК (Zymo, Италия). РНК последовательно подвергали обратной транскрипции в кДНК с помощью набора клеток для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Bio-System, Фостер-Сити, Калифорния, США) и использовали для анализа кПЦР.

Праймеры, использованные в qRT-PCR для апоЕ, были следующими: прямой 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 и обратный 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. Праймеры, использованные в qRT-PCR для gapdh (выбранные в качестве эталонного гена), были следующими: прямой 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 и обратный 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Продукцию правильного ампликона оценивали по оценке кривой плавления. Каждый биологический образец анализировали в трех экземплярах с реагентом SYBR green IQ (Bio-Rad Laboratories, Милан, Италия) и с использованием системы обнаружения CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, Милан, Италия).

4.10. Количественная оценка морфологии нейронов

Морфологию нейронов в клетках N1E-115 оценивали путем захвата изображений с помощью инвертированного микроскопа. Морфометрический анализ проводили с помощью программного обеспечения ImageJ для Windows и оценивали общее количество клеток (выраженное в процентах от контроля), среднюю длину нейритов (выраженную в процентах от контроля) и клеток, несущих нейриты. Для клеток, несущих нейриты, процент рассчитывали путем деления количества дифференцированных клеток на общее количество клеток в поле. N1E-115 считались дэвами дифференцированными, если у них был хотя бы один нейрит a длиной, равной или превышающей диаметр сомы. Морфологическую оценку проводили как минимум в пяти независимых экспериментах, в которых анализировали как минимум три изображения.

4.11. Статистический анализ

Все результаты, представленные в этом исследовании, были выражены как среднее значение ± SD (стандартное отклонение, нормальное распределение данных проверялось с помощью теста Шапиро-Уилка. При сравнении двух экспериментальных групп применялись непарные тесты. Однако, когда три или более групп Для сравнения использовался однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки. Что касается экспериментов с ротеноном, где присутствовали две переменные, использовался двухфакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Бонферрони. p < 0.05 считались статистически различными. Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism 5 (GraphPad, Ла-Хойя, Калифорния, США) для Windows.

Вклад автора:

Концептуализация, MS; методология, МС и МК; валидация, MS и MC; формальный анализ, MS, MC, DP и MP; расследование, MC, NM, LL, MP и DP; ресурсы, MS и VP; курирование данных, MS и MC; письмо – подготовка оригинального черновика, МС и МК; написание — обзор и редактирование, MP, LL, DP, NM и VP; визуализация, МС, МК и МП; супервизия, МС; администрирование проектов, магистр; финансирование приобретения, М.С. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование:

Это исследование финансировалось Фондом ведомственных исследований 2021 (Университет Молизе) для MS, а также Фондом Жерома Лежена для грантовой сессии 2021a, № 2043 для MS.

Заявление Институционального наблюдательного совета:

Непригодный.

improve memory

Заявление об информированном согласии:

Непригодный.

Заявление о доступности данных:

Непригодный.

Благодарности:

Благодарим Клаудию Тонини за помощь с анализом холестерина.

Конфликт интересов:

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

NGF модулирует метаболизм холестерина и стимулирует секрецию ApoE в глиальных клетках, обеспечивая нейропротекцию против окислительного стресса. Часть 2