Новые рекомбинантные вакцины In Ovo на основе вируса болезни Ньюкасла обходят материнский иммунитет и обеспечивают полную защиту от ранней вирулентной инфекции. Часть 1

Абстрактный:

Болезнь Ньюкасла (БН) является одной из наиболее экономически значимых болезней домашней птицы. Несмотря на интенсивные усилия в рамках текущих программ вакцинации, это заболевание все еще встречается во всем мире, вызывая значительную смертность даже в вакцинированных стадах. Частично это объясняется ослаблением иммунитета в период после вывода из-за наличия материнских антител, которые негативно влияют на репликацию обычно используемых живых вакцин. Вакцины in ovo имеют множество преимуществ и дают возможность решить эту проблему.

В настоящее время используемые in ovo вакцины против ND представляют собой вакцины на основе рекомбинантного герпесвируса индеек (HVT), экспрессирующие антигены вируса болезни Ньюкасла (NDV). Несмотря на доказанную эффективность, эти вакцины имеют некоторые ограничения, такие как отсроченная иммуногенность и невозможность введения второй вакцины HVT после вывода. Использование живых вакцин против БН для вакцинации in ovo в настоящее время неприменимо, так как это связано с высокой смертностью эмбрионов. В этом исследовании рекомбинантные экспериментальные вакцины с вектором NDV, содержащие антисмысловую последовательность птичьего интерлейкина 4 (IL4R) и их каркасы, вводили in ovo в различных дозах в 18-суточные коммерческие яйца, обладающие высокими титрами материнских антител. Вылупившихся птиц заражали вирулентным NDV в возрасте 2 недель. Выделение вакцины после вывода, выживаемость после заражения, выделение вируса после контрольного заражения и гуморальный иммунный ответ оценивали в несколько моментов времени. У птиц, вакцинированных рекомбинантным NDV (rNDV), смертность после вывода значительно снизилась по сравнению с вакциной LaSota дикого типа.

Все вакцины rNDV были способны проникать через материнский иммунитет и индуцировать сильный ранний гуморальный иммунный ответ. Кроме того, вакцины rNDV защищали от клинических проявлений болезни и значительно снижали выделение вируса после раннего заражения вирулентным NDV через две недели после вылупления. Титры антител ингибирования гемагглютинации после заражения в вакцинированных группах оставались сравнимыми с титрами до заражения, что свидетельствует о способности исследуемых вакцин предотвращать эффективную репликацию контрольного вируса. Выживаемость после вывода после вакцинации вакцинами rNDV-IL4R зависела от дозы, при этом выживаемость увеличивалась по мере снижения дозы. Эта улучшенная выживаемость и данные о дозозависимости позволяют предположить, что новые аттенуированные вакцины на основе rNDV in ovo, которые могут проникать через материнский иммунитет и вызывать сильный иммунный ответ уже через 14 дней после вылупления, что приводит к высокой или полной защите от вирулентного заражения, демонстрируют обещание в качестве вкладчика в борьбу с болезнью Ньюкасла.

В дополнение к вакцинации людей люди также могут принимать продукты питания и добавки. Цистанхе содержит различные химические вещества, такие как полисахариды, стероиды, алкалоиды, флавоноиды и т. д. Эти вещества играют важную роль в регуляции иммунной системы. Среди них полисахариды могут способствовать активации и пролиферации иммунных клеток и повышать иммунитет организма; стероиды могут регулировать функцию иммунных клеток и усиливать иммунный ответ; алкалоиды и флавоноиды могут противостоять окислению, обладают противовоспалительным, антибактериальным действием и дополнительно повышают иммунитет. Таким образом, Цистанхе обладает значительным иммунорегулирующим эффектом и может использоваться в качестве здоровой пищи и лекарств для повышения иммунитета.

Нажмите Польза цистанхе для здоровья

1. Введение

Болезнь Ньюкасла (НБ) — разрушительное заболевание домашней птицы, которое может достигать 100% смертности у интактных птиц, вызывается вирулентными штаммами вируса болезни Ньюкасла (ВБН) [1]. Этот вид вируса, недавно переименованный в Птичий ортоавулавирус 1, является членом семейства Paramyxoviridae [2,3]. Вирусы болезни Ньюкасла имеют одноцепочечный несегментированный РНК-геном с отрицательным смыслом, кодирующий по меньшей мере шесть структурных белков (30 — нуклеопротеин [NP] — фосфопротеин [P] — матричный белок [M] — гибридный белок [F] — гемагглютинин-нейраминидаза [HN] — и большая РНК-полимераза [L] — 50 ) и включающая один из трех размеров генома (15 186, 15 192 и 15 198 нуклеотидов) [4,5]. Болезнь Ньюкасла считается третьей по значимости болезнью домашней птицы в мире [6] и остается эндемичной во многих странах Азии, Африки и Америки [7].

Борьба с НБ включает в себя строгую биобезопасность для предотвращения заноса вирулентного ВНД (вНДВ) на птицефабрики [8,9] и надлежащее введение вакцин [10]. Однако многочисленные вспышки НБ, происходящие по всему миру [11], наводят на мысль о том, что современные вакцины и процедуры вакцинации не полностью эффективны. В дополнение к обычным живым и инактивированным вакцинам, за последние два десятилетия было изучено несколько концепций вакцинации против БН, в том числе векторные вакцины, комплексы антиген-антитело, вирусоподобные частицы и толл-подобные рецептор-лигандные вакцины, среди прочего [1, 8,9]. Несколько птичьих вакцин, разработанных для совместной экспрессии иммуностимулирующих цитокинов, также были предложены для улучшения защитного иммунитета [12]. Другой подход, который был изучен, заключается в использовании антигенно согласованных вакцин. Хотя все NDV считаются представителями одного серотипа [3,13], между штаммами существуют антигенные различия [14]. Предыдущие исследования с цыплятами разного возраста показали, что цыплята, вакцинированные штаммами, антигенно совпадающими с контрольным вирусом, выделяют значительно меньше контрольного vNDV, чем количество, выделяемое цыплятами, вакцинированными гетерологичными вакцинами [15–17]. Следует отметить, что пассивно переносимые материнские антитела против NDV, хотя и защищают цыплят в течение критических первых недель жизни, препятствуют развитию иммунитета хозяина после вакцинации [18].

Вакцинация in ovo представляет собой подход, обеспечивающий многочисленные преимущества, например, значительное снижение затрат, стандартизацию, массовое применение вакцины, автоматизированную вакцинацию в инкубаторе, однородную доставку вакцины в каждое яйцо и отсутствие стресса для птиц [19–21]. и является привлекательным методом иммунизации для птицеводства [22]. От 80 до 90 процентов цыплят-бройлеров, выращиваемых в США, в настоящее время проходят ововакцину за два-три дня до вылупления [23,24], а автоматизация процесса позволяет получать до 70000 яиц. вакцинироваться в час [23].

В глобальном масштабе этот метод введения вакцины используется в 26 из 30 ведущих птицеводческих стран мира [23]. В настоящее время доступно несколько in-ovo вакцин против ND, но все они созданы с использованием векторов, отличных от NDV. Было показано, что векторные вакцины против вируса оспы птиц (FPV), экспрессирующие белки NDV F и HN, применяемые in ovo, защищают домашнюю птицу от заражения vNDV [25,26].

Однако рекомбинантные вакцины против FPV-ND не получили широкого распространения из-за иммунных помех от предыдущих вакцинаций против FPV или контактов с ними (FPV обычно присутствует в окружающей среде) и отсутствия оптимизации для массового применения [9]. Наиболее широко используемым вектором для производства рекомбинантной вакцины против ND in ovo является альфагерпесвирус Meleagrid 1, широко известный как вирус герпеса индеек (HVT) или вирус болезни Марека серотипа 3 [12,23]. Только в США в 2018 г. было произведено 8,2 млрд доз рекомбинантных вакцин HVT (rHVT)-ND по сравнению с 3,6 млрд доз обычных вакцин против ND [27].

В дополнение к преимуществу использования in ovo вакцины rHVT, экспрессирующие белки NDV, вызывают сильный и долговременный иммунитет после однократного применения [28]. Кроме того, на них временно влияет присутствие материнских антител против NDV [8]. Однако вакцины rHVT-ND имеют некоторые ограничения, такие как отсроченный иммунитет, а предыдущая вакцинация HVT, по-видимому, не дает возможности использовать бустерные вакцины HVT у тех же птиц [9,29]. Вакцины против HV ассоциированы с клетками, и их необходимо хранить и транспортировать в жидком азоте, что является ограничением для их использования во многих странах.

Перспективы новых вакцин in ovo растут [23]. Были исследованы различные векторы для пути введения in-ovo, и сообщалось об обнадеживающих результатах с вакцинами на основе нереплицирующихся аденовирусов человека [30] и альфавирусов [31]. Хотя не было достигнуто никаких успехов в рутинном коммерческом использовании, также были предприняты усилия по разработке новых вакцин in ovo, отличных от HVT NDV-векторов [32–35]. Использование живых вакцин против БН in ovo представляет собой сложную задачу. В то время как живые вакцины против БН, такие как LaSota, B1, Clone 30 и Ulster, вызывают сильный иммунный ответ и обычно используются для вакцинации цыплят в возрасте одного дня, они связаны с высокой смертностью эмбрионов, когда вводят на 18-й день эмбрионального развития. Смертность достигает 100% при использовании низковирулентных вирусов дикого типа и 80% при использовании генетически аттенуированных живых вирусов после использования in ovo, и в настоящее время для этого метода введения вакцины не используются живые вакцины против ND [36,37]. .

Недавно было показано, что новая рекомбинантная экспериментальная вакцина на основе вектора NDV (rNDV), содержащая антисмысловые вставки птичьего интерлейкина 4 (IL4), названная ZJ1*l-IL4R, является многообещающим кандидатом на вакцину in ovo после оценки в среде, свободной от специфических патогенов (SPF). ) куриные яйца с эмбрионами (ЭКЕ) [38]. Это исследование было направлено на дальнейшую оценку применимости этой рекомбинантной вакцины с вектором NDV и ее рекомбинантной основы (аттенуированный сайт расщепления вируса дикого типа) и рекомбинантного вируса LaSota-IL4R для вакцинации in ovo 18-дневных коммерческие яйца с высоким титром материнских антител. Коммерчески доступные вакцины LaSota и rHVT-ND были включены в качестве контроля. Кроме того, это исследование было направлено на оценку защитной эффективности изучаемых вакцин против раннего заражения vNDV. Здесь демонстрируется способность этих рекомбинантных вакцин эффективно преодолевать материнский иммунитет даже в низких дозах и вызывать сильный иммунный ответ. Экспериментальные вакцины против rNDV продемонстрировали 100-процентную защиту после раннего заражения vNDV.

2. Материалы и методы

2.1. Вирусы

Вирулентный вирус goose/China/ZJ1/2000 (ZJ1, инвентарный номер GenBank AF431744) NDV, представитель подгенотипа VII.1.1 (бывший VIId), использовали в качестве контрольного вируса в этом исследовании. В качестве основы для создания рекомбинантных вакцин ZJ1*L и в качестве вирус. Вакцинный штамм LaSota (LS) с низкой вирулентностью использовали в качестве контроля вакцины и в качестве основы для создания рекомбинантной вакцины LS-IL4R. Все вирусы были получены из репозитория Юго-восточной исследовательской лаборатории птицеводства (SEPRL) Национального центра исследований птицеводства США (USNPRC) Министерства сельского хозяйства США (USDA). Кроме того, в качестве контроля также использовали коммерчески доступную вакцину rHVT-ND (вставка слитого гена).

Рекомбинантные экспериментальные вакцины против NDV, используемые в этом исследовании, были созданы с использованием обратной генетики, как описано ранее [38,39]. Вкратце, кодирующая последовательность птичьего IL4 была клонирована в скелеты ZJ1*L и LS в обратной ориентации (IL4R) между генами P и M, в результате чего были получены два рекомбинантных аттенуированных живых вируса, а именно, ZJ1*L-IL4R и LS- IL4R (инвентарные номера GenBank MM680659 и MM680665 соответственно). Рекомбинантные вирусы были спасены с использованием модифицированного вируса осповакцины Ankara, экспрессирующего полимеразу T7 (MVA/T7), в соответствии с ранее опубликованными протоколами [38–41]. Схематическое изображение конструкций представлено на дополнительной фигуре S1A. Для целей данной работы термин «DV-вакцины», используемый в дальнейшем, относится к ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R и LS-IL4R.

Рабочие запасы всех NDV были размножены в {{0}} до 11-суточных куриных яиц с SPF-эмбрионами (ECE) [42]. Вирусные штаммы, использованные для инокуляции яиц в этом исследовании, разводили в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом (BHI) (BD Biosciences, MD, USA), содержащем 200 мкг/мл гентамицина, 2{{22} 00 ЕД/мл пенициллина и 4 мкг/мл амфотерицина B до трех разных целевых титров, 105,5/0,1 мл, 104,5/0,1 мл и 103,5/0,1 мл эмбриональная инфекционная доза (EID50), кроме LS , который был разбавлен до 105,5/0,1 мл и 104,5/0,1 мл EID50. Титры разведенных рабочих растворов живых вакцин подтверждали обратным титрованием от 9- до 11-дневных SPF ECE в соответствии со стандартными процедурами, как указано выше. Вакцину rHVT-ND разбавляли непосредственно с использованием сахарозофосфатно-глутаматного альбуминового разбавителя для вакцин rHVT, описанного в Протоколе испытаний Центра ветеринарных биологических препаратов Министерства сельского хозяйства США [43].

2.2. яйца

Для этого эксперимента были любезно предоставлены 262 коммерческих яйца (без SPF) от стада кур-несушек Hy-Line Rockside W-36 (Мэнсфилд, Джорджия, США). Стадо несушек было регулярно вакцинировано вакциной LaSota. Иммунитет стада регулярно проверяется с помощью ELISA, и хотя эти результаты нельзя напрямую перевести в титры ингибирования гемагглютинации (HI), средние уровни антител против NDV в родительском стаде были очень высокими (т.е. 15 534 с отсечкой для положительных результатов). пробы 1159 г.). Источником SPF ECE (42 яйца) было стадо SEPRL SPF White Leghorn. Все яйца инкубировали при температуре 37,5°С и относительной влажности 55-60% в течение 18 дней.

2.3. вакцинация

Коммерческие (n {{{{10}}}}) и SPF (n=42) яйца в возрасте 18 дней эмбрионального развития (DOE) были разделены на 14 групп по 21 яйцу в каждой. группа (кроме контрольных групп BHI и Hatch, в каждой из которых было по 26 яиц). Используя 1 мл шприцев 24 G × 1/2, каждое яйцо инокулировали в аллантоисную полость 0,1 мл разбавленной вакцины или BHI, за исключением контрольной группы Hatch, в которой яйца не подвергались манипуляциям при все. Всего было тринадцать групп инокулированных яиц, разделенных на семь опытных и шесть контрольных групп. Семь экспериментальных групп были следующими: ZJ1*L-IL4R 104,5, ZJ1*L-IL4R 105,5, LS-IL4R 103,5, LS-IL4R 104,5, LS-IL4R 105,5, ZJ1*L 104,5 и ZJ1*L 105,5, каждая из которых получала соответствующую дозу инокулята EID50 на 0,1 мл, как указано в названии группы. Кроме того, было создано шесть контрольных групп. Две контрольные группы коммерческих яиц инокулировали, как описано выше, BHI и rHVT-ND соответственно. Две контрольные группы коммерческих яиц инокулировали, как описано выше, дозой инокулята LS 104,5 и LS 105,5 EID50 на 0,1 мл. Две контрольные группы яиц SPF инокулировали ZJ1*L 103,5 и ZJ1*L-IL4R 103,5. Схематическое изображение дизайна исследования представлено на дополнительном рисунке S1B, C.

После инокуляции яйца помещали в инкубаторы Turbofan Hova-Bator (GQF Manufacturing Company Inc., Джорджия, США), которые затем помещали в изоляторы в помещении с уровнем биозащиты животных 2 (ABSL-2). Инкубаторы регулировались термостатами для поддержания постоянной температуры 37,5 ◦C и относительной влажности от 55 до 60 процентов.

2.4. Вылупление, отбор проб, смертность

После вылупления в возрасте 21 DOE цыплят помещали в изолятор с отрицательным давлением (ABSL-2) и обеспечивали пищей и водой свободный доступ. Пять цыплят без SPF как из контрольной группы Hatch, так и из группы BHI умерщвляли и сразу же после вывода брали кровь для установления исходного титра материнских антител против NDV HI. Всех цыплят взвешивали через 1, 8 и 13 дней после вылупления (DPH). Мазки из ротоглотки и клоаки собирали в BHI у каждой птицы на 2 и 4 DPH. Клинические признаки и смертность регистрировали два раза в день в течение всего периода после вывода, а образцы крови собирали в 13 DPH.

2.5. Испытание

Двенадцать птиц из каждой группы (кроме LS 1{{10}}5.5, в которой все птицы погибли к 6 DPH) были переведены в установку ABSL-3E в 13 DPH. Птиц помещали в изоляторы отрицательного давления и давали им акклиматизироваться в течение 24 часов перед заражением. Всех птиц заражали на 14 DPH вирулентным ZJ1 NDV при 106 EID50/0,1 мл окулоназальным путем. За птицами ежедневно наблюдали клинические признаки и смертность. У каждой птицы собирали мазки из ротоглотки и клоаки через 2 и 4 дня после заражения (DPC). Все выжившие птицы были взвешены и обескровлены в 14 DPC и умерщвлены путем смещения шейных позвонков после анестезии 0,2 мл раствора кетамина/ксилазина (66 мг/мл кетамина и 6,6 мг/мл ксилазина), введенного внутримышечно с помощью иглы 25-калибра.

2.6. ОТ-ПЦР в реальном времени

РНК экстрагировали из всех сред для мазков с использованием набора для выделения вирусной РНК MagMAX 96 AI/ND (Ambion, Inc., Остин, Техас, США) с процессором магнитных частиц KingFisher (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя. , с модификацией удаления ингибитора, описанной Das et al. [44]. Количественную ОТ-ПЦР в реальном времени (рОТ-ПЦР) для обнаружения NDV, направленного на ген матрицы (M), проводили с использованием набора для одноэтапной ОТ-ПЦР AgPath-ID (Ambion) и ABI 750{{31 }} Система быстрой ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) с использованием праймеров и зондов, ранее описанных Wise et al. [45]. Условия анализа: обратная транскрипция в течение 10 мин при 45 ◦C; начальная денатурация в течение 10 мин при 95 ◦C; 40 циклов денатурации по 10 с при 94 ◦С, отжига праймеров по 30 с при 56 ◦С и удлинения праймеров по 10 с при 72 ◦С. Общий реакционный объем 25 мкл на каждую пробу состоял из воды молекулярной чистоты — 2,5 мкл; 2X буфер — 12,5 мкл; прямой праймер — 0,25 мкл (20 пмоль/мкл); обратный праймер — 0,25 мкл (20 пмоль/мкл); зонд — 0,50 мкл (6 пмоль/мкл); 25-кратная ферментная смесь — 1,0 мкл; матрица РНК — 8,0 мкл. Для количественного определения вируса была построена стандартная кривая для каждого вируса с РНК, экстрагированной из того же титрированного набора вирусов, который использовался для инокуляции яиц (для образцов мазков, собранных после вывода) или контрольного вируса (для образцов мазков, собранных после вывода). -испытание).

Результаты представлены как EID50/мл. Расчетный нижний предел обнаружения анализов составлял от 101,7 до 101,9 EID50/мл. Важно отметить, что rRTPCR обнаруживает вирусные нуклеиновые кислоты и что оценочные значения не обязательно представляют инфекционные вирусы. Значения EID50/мл не предназначены для представления контагиозности и используются для предоставления средств для относительного сравнения выделения вируса между группами. Несмотря на использование протокола экстракции нуклеиновых кислот с удалением ингибитора, большой объем матрицы РНК мог повлиять на расчеты по стандартной кривой. Следует отметить, что во всех реакциях использовалось одинаковое количество матрицы РНК, и потенциальные ингибиторы остатка в равной степени повлияли бы на все результаты.

2.7. HI анализ

Анализ ингибирования гемагглютинации (HI) использовали для оценки наличия и титров антител в образцах сыворотки, собранных на протяжении всего эксперимента. Следуя стандартным процедурам [46], вирус, используемый в качестве основы для каждой вакцины, использовали в качестве антигена для каждой соответствующей группы сывороток (ZJ1*L для всех групп ZJ1 и LS для всех групп LS). Для образцов сыворотки, собранных после заражения, вирулентный вирус ZJ1 использовали в качестве антигена в анализе HI. Титры рассчитывали как обратную величину последнего HI-положительного разведения сыворотки, а образцы с HI-титрами log2 3 и ниже считали отрицательными.

2.8. Статистический анализ

Программное обеспечение Prism v.7.03 (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США) использовалось для анализа данных, а выбросы определялись с помощью теста ROUT. Тест нормальности Д'Агостино-Пирсона был выполнен, чтобы оценить, получены ли значения в каждой группе из распределения Гаусса. Основываясь на распределении нормальности, для множественных сравнений между группами использовали непараметрический критерий Краскела-Уоллиса с посттестом Данна. Для статистических целей всем образцам мазков, в которых не были обнаружены вирусы, было присвоено числовое значение на 1 log ниже предела обнаружения для каждого вируса. Кривые выживаемости анализировали с использованием критерия логарифмического ранга (Мантела-Кокса). Статистическая значимость была установлена ​​на уровне p <0,05.

3. Результаты

3.1. Выводимость, выживаемость после вывода и живая масса

Выживаемость после вывода для всех групп, вылупившихся из коммерческих яиц, изображена в виде кривых выживания на рисунке 1 (разделены на рисунках 1A и B для ясности и во избежание перегруженности графиков). Комбинированный график доступен на дополнительном рисунке S2. Контрольная группа вывода (не инокулированная) была включена в план, чтобы гарантировать отсутствие аномальной выводимости или смертности после вывода, не связанных с инокуляцией яиц.

Как и ожидалось, в трех контрольных группах наблюдалась очень низкая (rHVT-ND) или нулевая (Hatch и BHI) смертность после вывода. Напротив, контрольные группы LS имели 57,1 процента и 0 процента выживаемости при использовании доз 104,5 и 105,5 соответственно, что ранее сообщалось для обычных живых вакцин против ND. Два яйца не вылупились в группе LS-IL4R 105,5 и одно яйцо не вылупилось в группе LS 104,5. В других группах наблюдалась вариабельная смертность в зависимости от дозы вакцины и прививки. В группах ZJ1*L-IL4R 104,5 и 105,5 выживаемость составила 90,5% и 71,4% соответственно, а в группах ZJ1*L-IL4R 104,5 и 105,5 выживаемость составила 80,9% и 76,2% соответственно (рис. 1А), но различия были следующие. не является статистически значимым. Выживаемость в группе LS-IL4R 103,5 составила 95,2%. Показатели выживаемости, наблюдаемые в группах LS-IL4R 104,5 и 105,5, составили 85,7% и 66,7% соответственно (рис. 1В).

Не было никаких существенных различий в выживаемости между экспериментальными группами вакцин ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R и LS-IL4R и контрольными группами Hatch, BHI и rHVT-ND, но процент выживаемости в этих контрольных группах был численно выше. , с отрицательной корреляцией между дозой вакцины и выживаемостью после вывода (выживаемость увеличивалась по мере снижения дозы вакцины). Контрольная группа LS 1{{10}}5,5 имела значительные различия в выживаемости по сравнению с экспериментальными группами (значения p между 0.0001 и 0,02). Контрольная группа LS 104.5, хотя и не отличалась статистически, имела значительно более низкие показатели выживаемости по сравнению с экспериментальными группами с той же дозой. Две контрольные группы LS имели значительные различия в выживаемости по сравнению с контрольными группами Hatch, BHI и rHVT-ND (значения p между 0,0001 и 0,04). Клинические признаки не наблюдались ни в одной из групп после вывода. В группах, в которых присутствовала падеж после вылупления, птиц находили мертвыми при ежедневных проверках.

Все птицы были взвешены на 1, 8 и 13 день после вывода (таблица 1). На 1 DPH средняя живая масса птицы в большинстве групп составляла от 38,5 до 42,6 граммов (г). Существовали значительные различия в массе тела только между группами rHVT-ND и ZJ1*L-IL4R 104,5 с одной стороны и ZJ1*L 104,5 и контрольной LS 1{{40 }}}4,5 от другой (птицы в двух первых группах весили больше, чем птицы в контрольной группе) (значения p между 0.0001 и 0,017 соответственно). На 8 DPH две группы ZJ1*L и LS-IL4R 104,5, группа LS-IL4R 105,5 и контрольная группа LS (средний вес 50–63 г) имели живую массу значительно ниже по сравнению с птицами из Hatch, BHI и контрольные группы rHVT-ND (средний вес 77–82 г) (значения p от 0,0001 до 0,03). Те же группы, которые значительно отличались от контроля при 8 DPH (за исключением LS-IL4R 104,5), имели значительно более низкую массу тела, чем контрольные группы Hatch, BHI и rHVT-ND, также при 13 DPH (значения p между 0,0001 и 0,01). Птицы из контрольных групп с инокулированными SPF не были включены в это сравнение, поскольку яйца SPF (и птицы, вылупившиеся из них) традиционно меньше и легче, чем коммерческие яйца.

Рис. 1. Выживаемость цыплят после инокуляции коммерческих яиц на 18-й день эмбрионального развития экспериментальными вакцинами против NDV in ovo. Яйца Hy-Line Rockside W-36 инокулировали рекомбинантными вирусами и LaSota. Три контрольные группы были привиты вакциной BHI или rHVT-ND или не были привиты (контрольная группа Hatch). За птицами наблюдали в течение 13 дней после вылупления. Кривые выживаемости представлены на двух рисунках: (А) контрольные группы и группы ZJ1*L и (В) контрольные группы и группы LS-IL4R. Различные надстрочные буквы указывают на статистически значимые различия между группами (p-значение < 0,05). Сокращения групп: HATCH – яйца не инокулированные; BHI – яйца, инокулированные BHI; rHVT-ND – яйца, инокулированные рекомбинантной вакциной HVT; ZJ1*L – яйца, инокулированные рекомбинантным вирусом ZJ1*L, сайт расщепления которого был изменен на низковирулентный; ZJ1*L-IL4R — яйца, инокулированные рекомбинантным низковирулентным ZJ1*L со встроенным в обратную ориентацию геном интерлейкина-4; LS – яйца, инокулированные штаммом LaSota; LS-IL4R — яйца, инокулированные рекомбинантным вирусом LaSota с геном интерлейкина -4, вставленным в обратной ориентации. Доза вируса, которую получили яйца в каждой группе, представлена ​​числом после названия группы в EID50/на яйцо.

Таблица 1. Средние значения веса (и стандартные отклонения) цыплят через 1, 8 и 13 дней после вывода после инокуляции коммерческих яиц на 18-й день эмбрионального развития экспериментальными вакцинами in ovo и на 14-й день после заражения вирулентной болезнью Ньюкасла вирус.

3.2. Выделение вакцинных вирусов после вакцинации, как показано с помощью rRT-PCR

На 2 DPH не было никаких существенных различий в выделении вируса среди вакцинированных групп. (Рисунок 2А). Точно так же при 4 DPH различия между группами не были статистически значимыми. (Рисунок 2Б). Выделения вируса не было обнаружено ни у одной из контрольных птиц Hatch и BHI.

Рисунок 2. Среднее значение выделения вакцины после вывода у цыплят, вылупившихся из коммерческих яиц, инокулированных на 18-й день эмбрионального развития экспериментальными вакцинами in ovo. Каждая точка данных представляет одну птицу и титры NDV, обнаруженные в мазках из ротоглотки (OP) и клоаки (CL) в разные дни после вылупления (DPH). Линька представлена ​​отдельно для 2 дней после вывода (A) и 4 дней после вывода (B). Столбцы представляют собой стандартные отклонения среднего значения. Всем мазкам, в которых вирус не был обнаружен, было присвоено числовое значение на 1 log ниже предела обнаружения для каждого из соответствующих вирусов. Предел обнаружения rRT-PCR представлен горизонтальной пунктирной линией (используется самый низкий предел). Сокращения групп: HATCH – яйца не инокулированные; BHI – яйца, инокулированные BHI; rHVT-ND – яйца, инокулированные рекомбинантной вакциной HVT; ZJ1*L – яйца, инокулированные рекомбинантным вирусом ZJ1*L, сайт расщепления которого был изменен на низковирулентный; ZJ1*L-IL4R – яйца, инокулированные рекомбинантным низковирулентным ZJ1*L со встроенным в обратную ориентацию геном интерлейкина-4; LS – яйца, инокулированные штаммом LaSota; LS-IL4R — яйца, инокулированные рекомбинантным вирусом LaSota с геном интерлейкина -4, вставленным в обратной ориентации. Доза вируса, которую получили яйца в каждой группе, представлена ​​числом после названия группы в EID50/на яйцо.

3.3. Гуморальный иммунный ответ после вывода

Анализ образцов сыворотки, собранных на 13 DPH (диагональные полоски, заполненные столбцами) с помощью анализа HI (обнаружение гемагглютинационных антител к NDV), показан на рисунке 3. Чтобы установить титр пассивно переносимых материнских антител HI против NDV в коммерческих яйцах, десять у цыплят обескровливали сразу после вывода (0 DPH). Титры HI при вылуплении варьировались от log2 5 до log2 8 со средним значением log2 7,17 (рис. 3, пунктирная горизонтальная красная линия). Антитела на 13 DPH в группах Hatch, BHI и rHVT-ND (среднее значение log{12}},7) являются остаточными материнскими антителами, поскольку эти группы либо не были вакцинированы, либо вакцинированы вакциной rHVT-ND, которая не не индуцируют антитела HI к NDV. Титры антител в группах ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R и LS 104.5 были значительно выше по сравнению с контрольными группами Hatch, BHI и rHVT-ND. Значимых различий между различными дозовыми группами вакцин с одним и тем же остовом не наблюдалось. Группы LS-IL4R имели более низкие поствакцинальные титры HI по сравнению с группами ZJ1*L-IL4R и ZJ1*L, хотя эти различия не были статистически значимыми. Следует отметить, что поствакцинальные титры HI у птиц во всех группах LS-IL4R, хотя и были несколько выше в числовом выражении, существенно не отличались от титров, измеренных у контрольных невакцинированных птиц.

Рисунок 3. Титры антител HI до и после заражения (и стандартное отклонение) у цыплят, вылупившихся из коммерческих яиц, инокулированных на 18-й день эмбрионального развития экспериментальными вакцинами in ovo и раннего заражения вирулентным вирусом болезни Ньюкасла на 14-й день после вылупления. Столбцы, заполненные диагональными полосами, представляют титры до заражения через 13 дней после вылупления. Заштрихованные столбцы представляют титры после заражения через 14 дней после заражения. Статистически значимые различия между различными группами представлены строчными буквами над каждой группой (p-значение<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. Клинические признаки и выживаемость после раннего заражения CDV

В контрольных группах первые клинические признаки наблюдались в группах Hatch и BHI на 3 DPC. У трех птиц в группе Hatch и у одной птицы в группе BHI было затрудненное дыхание. На 4 DPC взъерошенные перья и тремор головы наблюдались в группах BHI и штриховки, а на 5 DPC в группе rHVT-ND; в последней группе также у двух птиц регистрировали атаксию и тяжелую кривошею. У птиц в контрольной группе Hatch наблюдалась вялость на 5 DPC, а у двух птиц в группе BHI наблюдался паралич. Летаргия и параличи наблюдались в группе rHVT-ND на 6 и 7 ДПК. Опистотонус, кривошея и затрудненное дыхание наблюдались в контрольных группах Hatch и BHI, начиная с 9 DPC. В группе rHVT-ND кривошея наблюдалась уже в 5 ДПК, затрудненное дыхание и атаксия начинались в 6 ДПК, а опистотонус начинался в 13 ДПК. К 14 DPC все птицы, за исключением двух птиц Hatch, одной BHI и двух птиц rHVT-ND (83,3%, 91,6% и 83,3% заболеваемости соответственно) либо погибли, либо у них развились преимущественно неврологические клинические признаки, такие как атаксия, опистотонус, кривошея, тремор. , и парализует. Птиц, у которых проявлялись серьезные клинические признаки, которые прекращали есть или пить или оставались лежать, подвергали эвтаназии и на следующий день регистрировали как мертвых для расчета времени выживания. Никаких клинических признаков не наблюдалось ни в одной из групп ZJ1*L и ZJ1*L-IL4R. Незначительные клинические признаки опистотонуса или кривошеи наблюдались у одной птицы (заболеваемость 8,4%) в каждой из групп LS-IL4R и группе LS 104,5 на 14 DPC.

Выживаемость после заражения вирулентным ZJ1 NDV представлена ​​в виде кривых выживаемости на рисунке 4. В то время как все группы, инокулированные рекомбинантными вакцинами и LS, показали 100-процентную выживаемость, птицы в группах Hatch, BHI и rHVT-ND имели 58,3 %. выживаемость 58,3% и 66,6% соответственно. Выживаемость после заражения в контрольных группах Hatch и BHI была значительно ниже по сравнению с экспериментальными группами вакцин. Следует отметить, что хотя масса тела птиц в инокулированных группах колебалась после вывода по сравнению с контрольными группами Hatch, BHI и rHVT-ND, все птицы, вакцинированные rNDV (282–328 г), превышали массу тела невакцинированных птиц. контрольные птицы после контрольного заражения (255–266 г) (таблица 1). Однако существенной разницы в массе тела между исследуемыми группами не наблюдалось.

Рисунок 4. Выживаемость цыплят после инокуляции коммерческих яиц на 18-й день эмбрионального развития экспериментальными вакцинами in ovo и раннего заражения вирулентным вирусом болезни Ньюкасла на 14-й день после вылупления. За птицами наблюдали в течение 14 дней после заражения. Различные надстрочные буквы указывают на статистически значимые различия между группами (p-значение < 0,05). Сокращения групп: HATCH – яйца не инокулированные; BHI – яйца, инокулированные BHI; rHVT-ND – яйца, инокулированные рекомбинантной вакциной HVT; ZJ1*L – яйца, инокулированные рекомбинантным вирусом ZJ1*L, сайт расщепления которого был изменен на низковирулентный; ZJ1*L-IL4R — яйца, инокулированные рекомбинантным низковирулентным ZJ1*L со встроенным в обратную ориентацию геном интерлейкина-4; LS – яйца, инокулированные штаммом LaSota; LS-IL4R — яйца, инокулированные рекомбинантным вирусом LaSota с геном интерлейкина -4, вставленным в обратной ориентации. Доза вируса, которую получили яйца в каждой группе, представлена ​​числом после названия группы в EID50/на яйцо.

3.5. Выделение после заражения, как показано с помощью rRT-PCR

На 2 DPC птицы в контрольных группах Hatch, BHI и rHVT-ND выделяли высокие титры вируса (1{{2{0}}}5,3–5,7 EID50/мл) при пероральном введении, в то время как все группы вакцинации имели средние титры выделения ниже 104 EID50/мл (рис. 5А). Результаты выделения вируса через клоаку были ниже предела обнаружения анализа во всех группах. На 2 DPC у птиц во всех группах ZJ1*L и ZJ1*L-IL4R, а также у птиц в группе LS-IL4R 105,5 было обнаружено значительно меньше вирусной РНК при пероральном введении по сравнению с контрольными группами Hatch, BHI и rHVT-ND. (значения p варьировались от 0,001 до 0,02). На 4 DPC выделение пероральным путем в группах Hatch, BHI и rHVT-ND было высоким (106,2–6,9 EID50/мл) (рис. 5B).

Напротив, меньшее выделение наблюдалось во всех группах вакцин при 4 DPC по сравнению с 2 DPC, с самым высоким средним титром 102,9 EID50/мл в группе ZJ1*L 104,5 и самым низким средним титром 101,5 EID50/мл в ZJ1* l-IL4R 104.5 (у некоторых птиц вирусная РНК не обнаружена). Все экспериментальные группы вакцины rNDV выделяли значительно меньше вируса при пероральном введении по сравнению с контрольными группами Hatch, BHI и rHVT-ND (значения p из<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

Рисунок 5. Среднее выделение вируса после заражения цыплятами после инокуляции коммерческих яиц на 18-й день эмбрионального развития экспериментальными вакцинами in ovo и раннего заражения вирулентным вирусом болезни Ньюкасла на 14-й день после вылупления. Каждая точка данных представляет титры NDV, обнаруженные в мазках из ротоглотки (OP) и клоаки (CL) в разные дни после заражения (DPC). Выделение представлено отдельно для 2 дней после заражения (А) и 4 дней после заражения (В). Столбцы представляют собой стандартные отклонения среднего значения. Всем мазкам, в которых вирус не был обнаружен, присваивалось числовое значение на 1 log ниже предела обнаружения. Предел обнаружения rRT-PCR представлен горизонтальной пунктирной линией.

Статистически значимые различия между различными группами представлены строчными буквами над каждой группой (p-значение < 0,05). Сокращения групп: HATCH – яйца не инокулированные; BHI – яйца, инокулированные BHI; rHVT-ND – яйца, инокулированные рекомбинантной вакциной HVT; ZJ1*L – яйца, инокулированные рекомбинантным вирусом ZJ1*L, сайт расщепления которого был изменен на низковирулентный; ZJ1*L-IL4R – яйца, инокулированные рекомбинантным низковирулентным ZJ1*L с геном интерлейкина-4, вставленным в обратной ориентации; LS – яйца, инокулированные штаммом LaSota; LS-IL4R — яйца, инокулированные рекомбинантным вирусом LaSota с геном интерлейкина -4, вставленным в обратной ориентации. Доза вируса, которую получили яйца в каждой группе, представлена ​​числом после названия группы в EID50/на яйцо.

3.6. Серология после заражения

Все птицы в контрольных группах Hatch, BHI и rHVT-ND показали повышенные (более чем в два раза) титры HI-антител на 14 DPC (выше log{3}}) по сравнению с титрами до заражения на 13 DPH (log{ {6}}.7). Различия в титрах в этих трех группах до и после заражения были значительными (p-значение<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. Привитые контрольные группы SPF

Выживаемость в контрольных группах SPF после вывода составила 66,7% в группе, инокулированной ZJ1*L 103,5, и 57,1% в группе, инокулированной ZJ1*L-IL4R 103,5 (дополнительная фигура S3A). Активное выделение вируса было обнаружено у птиц в контрольных группах SPF обоими путями, при этом более высокие титры были обнаружены в образцах мазков из ротоглотки (см. Дополнительный рисунок S3B). Поствакцинальные титры HI инокулированных контрольных птиц SPF были выше, чем титры в контрольных группах Hatch, BHI и rHVT-ND, и достигали средних значений log2 7,08 и log2 7. 58 на 13 DPH в группах ZJ1 * L-IL4R 103,5 и ZJ1 * L-IL4R 103,5 соответственно (см. Дополнительную фигуру S3C). Никаких клинических признаков или смертности после заражения не наблюдалось в двух контрольных группах с привитым SPF (кривые выживаемости см. на дополнительном рисунке S3D). Птицы из контрольных групп с инокулированными SPF выделяли значительно меньше вируса оральным путем на 2 и 4 DPC по сравнению с контрольными группами (значения p из<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com