Нановолокна олеаноловой кислоты ослабляют окислительный стресс, вызванный твердыми частицами, в кератиноцитах

Пожалуйста, свяжитесь с oscar.xiao@wecistanche.com для получения дополнительной информации.

Абстрактный:Взвешенные в воздухе твердые частицы (ТЧ) являются одним из индикаторов загрязнения воздуха, а также основным фактором, вызывающим окислительный стресс в коже. Олеаноловая кислота (ОА), природное терпеноидное соединение, эффективно ингибирует старение кожи, вызванное ТЧ; однако ОА плохо растворяется в воде и плохо впитывается в кожу, что ограничивает ее применение в медицине и косметике. Целью этого исследования было получение нановолокон олеаноловой кислоты (OAnf) и оценка эффектов OA и OAnf на кератиноциты, обработанные РМ. Результаты показали, что (OA, растворенный в растворенном в диметилсульфоксиде (ДМСО) ослаблял PM-индуцированную гиперпродукцию активных форм кислорода, активацию стресс-активируемой протеинкиназы/Jun-аминотерминальной киназы (SAPK/JNK) и экспрессию воспалительных и кожных реакций. -белки, связанные со старением. Кроме того, нановолоконный процесс ОА эффективно улучшил растворимость ОА в воде более чем в 99 раз000-за счет изменения его физико-химических свойств, включая увеличение площади поверхности, уменьшение размера частиц, аморфное превращение и образование водородных связей с вспомогательными веществами. Способность OAnf к проникновению через кожу была более чем в 10- раз выше, чем у OA. Кроме того, при растворении в PBS OAnf проявлял превосходную антиоксидантную, противовоспалительную и антивозрастную активность в PM. -обработанные кератиноциты, чем OA. В заключение, наши результаты показывают, что OAnf может быть местной антиоксидантной формулой для смягчения проблем с кожей, вызванных PM.

Ключевые слова:твердые частицы; олеаноловая кислота; нальноволокно; антиоксидант; противовоспалительное средство; против старения

1. Введение

Загрязнение воздуха в настоящее время является проблемой общественного здравоохранения во всем мире. С развитием техники различные вредные вещества, в том числе газы, химические вещества, биологические загрязнители, частицы, накапливаются в атмосфере и серьезно влияют на жизнь и здоровье людей. Твердые частицы (ТЧ), индикатор загрязнителей воздуха, представляют собой комбинацию различных органических соединений, материалов биологического происхождения и твердых частиц углерода[1]. ТЧ попадают в легкие при вдыхании и попадают в кровоток, вызывая системные опасности для здоровья, такие как воспаление органов, сердечно-сосудистые и респираторные заболевания [2,3]. Кроме того, ПМ могут проходить через кожный барьер и накапливаться в волосяных фолликулах и даже проникать в дерму при повторном контакте; таким образом, чрезмерное воздействие на кожу ТЧ было связано с внешним старением кожи, изменениями пигментации, атопическим дерматитом, акне и псориазом [2,4]. Продолжительный контакт с РМ вызывает перепроизводство активных форм кислорода (АФК) в кератиноцитах, что запускает несколько сигнальных путей, включая путь апоптоза, пути митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) и воспаление. Повышенная экспрессия циклооксигеназы -2 (ЦОГ-2), фактора некроза опухоли- (TNF-a) и интерлейкина -1 (IL-1) обычно наблюдается в кератиноцитах, подвергшихся воздействию ПМ. Кроме того, ПМ также активирует матриксные металлопротеиназы (ММП) и приводит к потере эластичности кожи и старению [5].

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Натуральные продукты уже давно используются в качестве эффективных космецевтических ингредиентов. Олеаноловая кислота (ОА, 3 -гидроксиолеан-12-ен-28-ойная кислота), пятикольцевое тритерпеноидное соединение, широко присутствует в растениях, фруктах и ​​овощах [6]. ОА хорошо известен своим защитным действием на печень, таким как уменьшение вызванного химическими препаратами острого повреждения печени и фиброза/цирроза при хронических заболеваниях печени [6,7]. Кроме того, предыдущие исследования показали, что ОА обладает антиоксидантным, противораковым, противовоспалительным, антидиабетическим, противомикробным действием [8] Kim et al. показали, что ОА может снижать экспрессию провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-6) и белка старения кожи (MP-1) в кератиноцитах, обработанных PM [9]. Однако физико-химические свойства ОА затрудняют его растворение в воде, что ограничивает его применение в медицине, пищевых продуктах и ​​косметике.

Конструкции рецептур для доставки лекарств, такие как наноносители на полимерной основе, li. посомы и нановолокна обычно используются для улучшения физико-химических свойств активных ингредиентов. Инкапсулирование активных ингредиентов с наполнителями в этих фармацевтических препаратах может повысить их растворимость в воде и абсорбцию через кожу, а также снизить потенциальную токсичность и раздражение кожи. Среди них нановолокна представляют собой новый наноразмерный состав с большой площадью поверхности, низкой плотностью и большим объемом пор, и уже широко используются в биомедицине, что может уменьшить объем пероральных препаратов, повысить стабильность активных ингредиентов, контролировать высвобождать, улучшать биодоступность и создавать искусственные ткани [10]. Электропрядение является распространенной технологией, используемой для производства нановолокон, и хорошо совместимо с массовым производством [1]. Таким образом, получение нановолокна с использованием процесса электропрядения может одновременно улучшить биодоступность. эффективность и эффективность производства активного ингредиента с плохой растворимостью в воде. Поливинилпирролидон (PVPK90) и 2-гидроксипропил- -циклодекстрин (HPBCD) являются одобренными FDA соединениями для солюбилизации и доставки гидрофобных активных фармацевтических ингредиентов в организме человека.цистанхе холестеринПредыдущие исследования показали, что нановолокна, приготовленные из HPBCD и PVPK90, значительно улучшают растворимость в воде и проникновение через кожу ресвератрола [12] и масла плаи [13]. Таким образом, целью этого исследования было использование PVPK90 и HPBCD в качестве носителей доставки для получения нановолокон олеаноловой кислоты (OAnf) и оценки эффектов OA и OAnf в кератиноцитах, обработанных PM.

Цистанхе может омолаживать

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы оценить биологический эффект ОА, растворенного в ДМСО, на повреждение кератиноцитов, вызванное ПМ. Чтобы преодолеть плохую растворимость OA в воде, мы использовали PVPK90 и HPBCD в качестве носителей доставки для получения нановолокон олеаноловой кислоты (OAnf) с помощью процесса электропрядения, а затем определили изменения физико-химических свойств между необработанным OA и OAnf, чтобы выяснить улучшение растворимости в воде и проникновение через кожу. Чтобы сравнить биологический эффект после процесса ОА с нановолокнами, модель повреждения кератиноцитов, вызванная РМ, использовалась для оценки антиоксидантной, противовоспалительной и антивозрастной активности ОАнф и ОА.

2. Материалы и методы

2.1.Материалы

Гидрат олеаноловой кислоты (OA) был приобретен у Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Токио, Япония). Поливинилпирролидон (Luviskol K90 Powder, PVP) был приобретен у Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co., Ltd. Тайбэй, Тайвань. Гидроксипропил-бета-циклодекстрин (HPBCD) был получен у Zibo Qianhui (Zibo, Китай). Метанол и диметил сульфоксид (ДМСО) были приобретены у Aencore Chemical (Surrey Hills, Австралия).Все химические вещества или реагенты для клеточных культур имели биологическую чистоту, а другие химические вещества для физико-химического определения имели чистоту для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2.2. Анализ жизнеспособности клеток

Определение жизнеспособности клеток активного ингредиента является распространенным методом, используемым для выбора надлежащих диапазонов концентраций активных ингредиентов для оценки их биологической активности. Кератиноциты HaCaT были приобретены в Istituto Zooprofilattic Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Брешиа, Италия). Клетки HaCaT культивировали в среде DMEM (Himedia Laboratories, Мумбаи, Индия), содержащей 1% фетальной телячьей сыворотки (Hazelton Product, Денвер, Пенсильвания, США) с 1% пенициллином-стрептомицином (Biological Industries, Connecticut, NE). , США), а клетки HaCaT инкубировали в инкубаторе (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) при температуре 37°С и 5% СО2. Для приготовления тестовых образцов OA и OAnf растворяли в ДМСО и PBS соответственно, а затем каждый образец разводили в DMEM без эмбриональной бычьей сыворотки для определения жизнеспособности клеток. Клетки HaCaT высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток/100 мкл/лунку в течение 24 часов. Затем культуральную среду удаляли и клетки обрабатывали различными концентрациями OA и OAnf в диапазоне от 5 до 80 мкМ в бессывороточной среде DMEM в течение 24 часов. Во время анализа среду для обработки удаляли и в каждую лунку добавляли по 150 мкл раствора МТТ с концентрацией 0,5 мг/мл. После 3 ч инкубации раствор МТТ удаляли, а фиолетовые кристаллы формазана из каждой лунки растворяли в 100 мкл ДМСО. Затем измеряли поглощение при 550 нм в каждой лунке с использованием спектрофотометра для микропланшетов (BioTek uQuant, Winoski, VT, USA). Жизнеспособность клеток рассчитывали по следующей формуле:

2.3.Определение содержания активных форм кислорода (АФК)

PM (стандартный эталонный материал, SRMB1649b) были приобретены в Национальном институте стандартов и технологий. Этот продукт был собран в 1976 и 197 годах в Вашингтоне, округ Колумбия. В общей сложности 10 мг/мл PM суспендировали в PBS, а затем обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут перед использованием. В общей сложности 1 × 10+ кератиноцитов HaCaT культивировали в 96-луночных планшетах в течение 24 часов при температуре 37°С и 5% СО2. Клетки обрабатывали различными концентрациями OA в ДМСО, OA в PBS и OAnf в PBS в течение 24 часов соответственно. Затем их инкубировали с 20 мкМ раствором диацетата дихлордигидрофлуоресцеина (DCFH-DA; Sigma, Токио, Япония) в течение 30 мин. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкг/см² ФМ и инкубировали в течение 1 ч. После этого клетки отмывали. дважды с PBS, и интенсивность флуоресценции каждого образца анализировали с помощью флуоресцентного планшет-ридера (возбуждение: 485 нм; испускание: 528 нм) (BioTek, Winooski, VI, USA). Следующее уравнение использовали для расчета процента ингибирования Производство АФК:

2.4. Вестерн-блот-анализ

В общей сложности 4 × 105 кератиноцитов HaCaT культивировали в 6-луночных планшетах в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали OA или OAnf в бессывороточной среде в течение 24 часов с последующим добавлением PM. Через различные промежутки времени клетки лизировали буфером RIPAlysis (Merck Millipore, Burlington, MA, USA), затем центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 10 мин. Набор для анализа белка BCA (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) использовали для определения концентрации белка. Затем белки разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), а затем наносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) (Merck Millipore). Мембраны блокировали в течение 1 ч и промывали трис-буферным солевым раствором ( TBS) с 1% Tween-20. Мембраны инкубировали с первичными антителами при 4 градусах в течение ночи. Первичные антитела, использованные в этом исследовании, включали циклооксигеназу-2 (ЦОГ-2), матриксную металлопротеиназу-9 (ММП-9), тканевой ингибитор металлопротеиназы-1. (TIMP-1), стресс-активируемая протеинкиназа/Jun-аминотерминальная киназа (SAPK/JNK) (Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс, США), GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, США), матриксная металлопротеиназа-1 (MMP-1) (Proteintech Group, Rosemont, IL, USA), p380, внеклеточно регулируемые протеинкиназы (ERK) и ядерный фактор каппа-легкая цепь- энхансер активированных В-клеток (NF-kB) (Merck Millipore, Burlington, MA, USA). Затем добавляли вторичные антитела на 1 ч при комнатной температуре и реагировали с реагентами для усиления хемилюминесценции (ECL; Thermo Fisher Scientific). В качестве внутреннего контроля использовали антитела против GAPDH. Экспрессию каждого белка анализировали с помощью Touch Imager (e-BLOT; Шанхай, Китай), а экспрессию определяли количественно с помощью ImageJ.

2.5. Приготовление нановолокон олеаноловой кислоты (OAnf)

OAnfs подвергали электропрядению с различными соотношениями OA:PVP:HBPCD (1:8:5, 1:8:10 и 1:8:20). Раствор для электропрядения готовили следующим образом: 25 мг ОА растворяли в 5 мл метанола, добавляли ГПБЦД и перемешивали магнитной мешалкой до получения прозрачного раствора; затем сразу добавляли ПВПК90 и смесь перемешивали в течение 1 часа.Побочные действия цистанхе пустынногоНановолокна были сотканы с использованием электропрядильного оборудования FES-COS (Falco Tech Enterprise Co., Тайбэй, Тайвань) в следующих условиях: шприц объемом 10 мл с иглой с внутренним диаметром 0. 22 мм было использовано для электропрядения; скорость потока доводили до 0,2 мл/ч; приложенное напряжение было установлено на уровне 12 кВ; расстояние между наконечником и коллектором составляло 10 см. После процесса электроформования нановолокна собирали с помощью алюминиевой фольги. Вновь синтезированные нановолокна помещали в герметичный пластиковый пакет и хранили во влагонепроницаемом контейнере.

2.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Анализ олеаноловой кислоты

Система анализа ВЭЖХ (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Токио, Япония) состояла из насоса L-2130, автоматического пробоотборника L-2200 и дозатора L{{3 }} ультрафиолетовый-видимый (UV-vis) детектор. Колонка для анализа представляла собой колонку Mightysil RP-18 GP (внутренний диаметр 250×4,6 мм, 5 мкм). Подвижная фаза состояла из метанола и 0,1% раствора ледяной уксусной кислоты в фиксированном соотношении (95:5; вес/объем). Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин, а длина волны детектирования УФ-детектора была установлена ​​на 215 нм. Пик поглощения олеаноловой кислоты появляется при 7,5 мин. Калибровочная кривая олеаноловой кислоты показала хорошую линейность (r =0,999) в диапазоне 0,01-100 мкг/мл.

2.7. Морфология, диаметр волокон и измерение размера частиц OAnf

Различные образцы нановолокон были покрыты платиной с помощью ионного покрытия (E{{0}}, HITACH, Токио, Япония); условие было установлено на 10 мА через 120 с. Морфологию и форму каждого образца наблюдали с помощью сканирующего электронного микроскопа (Hitachi S4700 Hitachi, Токио, Япония). Диаметр каждого образца рассчитывали с помощью программного обеспечения image j. Анализатор Zetasizer 3000HS (Malvern, Worcestershire, UK) использовали для измерения размера частиц OAnf. Размер частиц OA и OAnf измеряли при концентрации 1 мг/мл и 0,1 мг/мл соответственно.доза цистанхеКроме того, мы также наблюдали однородность морфологии OAnf после растворения в воде с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM, JEM {{0}} EXII, JEOL Co., Токио, Япония). Испытываемый образец доводили до 1 мкг/мл OA в деионизированной воде и затем капали на медную сетку, а затем сразу же капали 0,5% (масса/объем) фосфорно-вольфрамовой кислоты. После сушки каждый образец помещали на ТЭМ для наблюдения.

2.8. Загрузка лекарственного средства и эффективность инкапсуляции OAnf

Очень важно определить загрузку препарата и эффективность инкапсуляции системы доставки для оценки производительности фармацевтического процесса. Нагрузку лекарственным средством рассчитывали как процент от определенного содержания и теоретического содержания ОА, содержащегося в нановолокнах ОА. Для определения нагрузки лекарственным средством 100 мкл каждого образца добавляли к 900 мкл метанола, и концентрация ОА была равна, где КоА — концентрация ОА из ОАнф, WoA — теоретическое количество добавленного ОА, VoAnf — объем раствора ОАнф.

Эффективность инкапсуляции показывает, успешно ли нановолокна инкапсулировали активные соединения. Образцы OAnf растворяли в деионизированной воде и добавляли в центрифужные фильтрующие устройства (Microcon YM-10, Millipore, Billerica, MA, USA), а затем центрифугировали при 12{3}} об/мин в течение 10 мин при центрифуга с охлаждением (Centrifuge 5430R,Eppendorf, Гамбург, Германия). Инкапсулированную часть оставляли в верхней пробирке, а неинкапсулированную часть собирали из нижней пробирки из-за разницы в молекулярной массе. Количество неинкапсулированного ОА определяли вышеупомянутым методом ВЭЖХ. Для расчета эффективности инкапсуляции использовалось следующее уравнение:

где AoA представляет собой теоретическое количество OA (полученное в условиях кормления), включенное в нановолокна, а Aun-захваченный OA представляет собой количество неинкапсулированного OA.

2.9. Водная растворимость OAnf

Сырой OA (1 мг) и составы OAnf в различных соотношениях (содержащие эквивалент 1 мг олеаноловой кислоты) растворяли в 1 мл деионизированной воды соответственно, а затем обрабатывали ультразвуком в ультразвуковом аппарате (Branson 551 0, Emerson Electric, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 20 мин. Каждый образец фильтровали через мембрану 0,45 мкм (Pall Corporation, Вашингтон, штат Нью-Йорк, США) и разбавляли в 10-кратном размере. Разбавленные растворы анализировали с помощью ВЭЖХ и использовали стандартную кривую для определения количества олеаноловой кислоты для сравнения их растворимости в воде.

2.10. Определение кристаллического превращения в аморфное.

Рентгеновскую дифрактометрию (Siemens D500, Карлсруэ, Германия) использовали для анализа кристаллической формы ОА, наполнителей и ОАнф. Анализ проводился с использованием Cu-Ka-излучения, отфильтрованного никелем, при напряжении 40 кВ и токе 25 мА. Скорость сканирования составляла 1 град/мин, а диапазон углов сканирования составлял от 5 до 50 градусов. 2.11. Межмолекулярное взаимодействие между ОА и вспомогательными веществами.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) и 1H-ядерный магнитный резонанс (1H-ЯМР) обычно используются для подтверждения межмолекулярного взаимодействия между активными ингредиентами и вспомогательными веществами. Олеаноловую кислоту, PVP, HPBCD и составы OAnf в различных соотношениях соответственно смешивали с бромидом калия (KBr) в объемном соотношении 1:9 с использованием ступки и прессовали в таблетки. Затем каждый образец анализировали с помощью FTIR-спектрофотометра (спектрофотометр Perkin-Elmer 200, Perkin-Elmer, Norwalk, CT USA). Диапазон сканирования составлял 400-4000 см-4. , каждый образец растворяли в 0,8 мл 99,8-процентного ДМСО-dg (Merck, Сент-Луис, Миссури, США) и анализировали на спектрометре JEOL Alpha 400 (Nihon Denshi Co., Токио, Япония).

2.12. Проникновение олеаноловой кислоты и ее нановолокна в кожу Ex Vivo

Этот эксперимент проводили в соответствии со стандартным протоколом рекомендаций Европейской ассоциации косметических, туалетных и парфюмерных изделий (COLIPA). Систему диффузионных ячеек Франца можно разделить на стеклянные контейнеры верхней донорской камеры и нижней приемной камеры. Всего 1,5 мл буферного раствора, содержащего 0,14 МNaCl, 2 мМК-HPO4, 0,4 мМ KH2PO4 (pH 7,4), помещали в приемную камеру и перемешивали магнитным стержнем при 600 об/мин в течение всего времени. эксперимент. Свежую кожу с пашины свиньи получали от местного мясника на рынке и охлаждали в течение периода эксперимента. Каждый образец кожи разрезали на кусочки размером 2 см × 2 см и помещали между двумя камерами роговым слоем вверх. В диффузионной ячейке Франца поддерживали температуру 32°С с ​​помощью бани с циркулирующей водой.Преимущества экстракта цистанхеЗатем в донорскую камеру добавляли 200 мкл 1 мг/мл ОА или ОАнф на 1, 2 или 4 часа. После этого с диффузионной камеры Франца снимали кожу свиньи и получали роговой слой путем 15-кратной зачистки лентой. Каждый остаточный образец кожи нагревали до 95 градусов с помощью грелки, а эпидермис и дерму разделяли с помощью скальпеля. Каждый образец погружали в метанол и обрабатывали ультразвуком в течение 1 ч для извлечения ОА, а содержание олеаноловой кислоты в каждом образце определяли методом ВЭЖХ. 2.13. Статистический анализ

Все данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистическая значимость между различными группами была проанализирована с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки.p<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">

3.1. Олеаноловая кислота может подавлять воспаление, старение и сигнальные пути ROS/MAPK при повреждении кератиноцитов, вызванном PM

Чтобы найти правильный диапазон концентраций для оценки биологической активности, цитотоксичность ОА, растворенного в ДМСО, определяли в клетках кератиноцитов человека HaCaT с использованием анализа МТТ. Как показано на рисунке 1А, 40 и 80 мкМ ОА были связаны с жизнеспособностью клеток от 32 до 16 процентов. OA при концентрации менее 20 мкМ по-прежнему обеспечивал выживаемость клеток более 85 процентов. Эти результаты показали, что ОА в концентрации 5-20 мкМ не оказывает цитотоксического действия на кератиноциты человека HaCaT (рис. 1А). Соответственно, ОА изучали в концентрации 5-20 мкМ, чтобы исследовать его антиоксидантную и противозагрязняющую активность при повреждении кератиноцитов, вызванном ТЧ. В последнее время многие исследования показали, что ТЧ являются распространенным загрязнителем воздуха, вызывающим перепроизводство АФК и последующее повреждение системы кожи в результате ряда окислительных стрессов, включая перекисное окисление липидов, карбонилирование белков и мутации ДНК [14-16]. Как показано на рис. Рисунок 1B, обработка PM значительно увеличила продукцию ROS по сравнению с необработанной группой (p<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">

3.2. Нановолокна олеаноловой кислоты повышают растворимость в воде и проникновение сырой олеаноловой кислоты в кожу за счет улучшения физико-химических свойств

3.2.1. Морфология поверхности олеаноловой кислоты и ее нановолокон

При наблюдении с помощью СЭМ внешний вид HPBCD представлял собой сферический и пористый наполнитель, размер которого составлял от 20 до 50 мкм (рис. 2A). PVPK90 представляет собой наполнитель с неправильными многоугольными частицами и размером частиц более 60 мкм (рис. 2B). .Необработанная олеаноловая кислота представляет собой гранулированный порошок неправильной круглой формы размером 3-60 мкм. На рис. 2D-F показан средний диаметр волокна при различных весовых соотношениях олеаноловой кислоты: ГПБЦД:ПВПК90: 174,83±19,53 нм, 219,23±18,93 нм и 403,17±32,99 нм соответственно. :20) привело к OAnf, имеющему больший диаметр волокна (таблица 1).

3.2.2. Размер частиц и морфология OAnf, восстановленного в воде

Чтобы наблюдать за формой и размером частиц OAnf (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20), растворенного в воде, изображение OAnf под просвечивающим электронным микроскопом (ПЭМ) показало что частицы олеаноловой кислоты имеют сферическую форму и равномерно диспергированы в воде (рис. 3). Размер частиц был также подтвержден с помощью лазерного анализатора размера частиц (таблица 2). Размеры частиц OA и OAnf составили 5079,50±384,87 нм и 302,37±11,91 нм соответственно. Индексы полидисперсности (PDI) ОА и ОАнф составили 1,63±0,21 и 0,32±0,02 соответственно. Эти результаты показывают, что процесс электропрядения эффективно уменьшал размер частиц OA с равномерным распределением частиц и приводил к увеличению площади поверхности.

3.2.3. Лекарственная нагрузка, эффективность инкапсуляции и растворимость в воде нановолокон олеаноловой кислоты

Как показано в Таблице 3, процентное содержание OA при различных соотношениях наполнителей составляло 72,36±10,45%, 84,23±3,62% и 98,19±4,82% соответственно. Результаты показали, что более высокое соотношение HPBCD продемонстрировало лучший эффект загрузки лекарственным средством. Эффективность инкапсуляции всех составов превышала 95%, что указывает на то, что PVPK90 и HPBCD эффективно инкапсулировали OA. Кроме того, растворимость в воде OAnf с различным соотношением наполнителей составляла 296,14±57,75 мкг/мл, 395,87±32,77 мкг/мл. и 998,7±58,32 мкг/мл соответственно.Цистанче ЧингисханЭти результаты показали, что увеличение содержания ГПБЦД в составе резко повысило растворимость в воде сырого ОА. Напротив, растворимость в воде необработанного ОА не могла быть определена из-за того, что она была ниже предела обнаружения (0,01 мкг/мл) методом ВЭЖХ. Этот результат показал, что OAnf 1:8:20 имеет более чем 1000-кратное улучшение растворимости в воде по сравнению с необработанным OA. Таким образом, в следующих исследованиях 18:20 OAnf использовали для определения биологической активности в модели повреждения кератиноцитов, вызванного РМ.

3.2.4. Кристаллическое изменение олеаноловой кислоты и ее нановолокон

Рентгеновские дифрактограммы (XRD) сырого OA, наполнителей и его нановолокон показаны на рисунке 4. Сырой OA показал несколько высокоинтенсивных характеристических дифракционных пиков при угле сканирования 5 градусов -20 градусов, что указывает на то, что сырой OA представлял собой кристаллическое соединение. С другой стороны, на дифрактограммах ПВПК90 и ГПБЦД отсутствуют явные характерные дифракционные пики. ОА трансформировался из кристаллического в аморфный (рис. 4). В соответствии с этими результатами мы можем сделать вывод, что сырая олеаноловая кислота была успешно инкапсулирована в HPBCD и инкапсулирована PVPK90 после процесса с нановолокнами.

3.2.5. Образование межмолекулярной водородной связи между олеаноловой кислотой и вспомогательными веществами.

Межмолекулярное взаимодействие сырого OA и HPBCD с PVPK90 было определено с помощью FTIR-спектроскопии, и результаты показаны на рисунке 5. FTIR-спектр четко показал поглощение нескольких химических функциональных групп необработанного OA, включая полосу поглощения при 3463 см{{ 3}} (——вибрация растяжения ОН), 1696 см-1 (——колебание растяжения С=О) и 1462 см-л (вибрация растяжения CHHz) (рис. 5). Когда ОА, ПВПК90 и ГПБЦД образовывали комплексы с образованием нановолокон, поглощение этих химических функциональных групп, очевидно, смещалось в сторону более низкого поглощения. Эти результаты указывали на межмолекулярные взаимодействия водородных связей между OA и HPBCD с PVPK90. Кроме того, в настоящем исследовании для подтверждения межмолекулярного взаимодействия ОА и наполнителей также использовали 1Н-ЯМР. Спектр 1H ЯМР необработанного OA (рис. 6C) показал карбоксильный сигнал при 812 м.д. (H28), двойные протоны при 85,15 м.д. (H12), сигнал гидроксильного протона при 83,38 м.д. (H3) и метильные протоны (81 м.д.). Однако , спектр HNMR нановолокон OA показал, что карбоксильный сигнал OA исчез, а химические сдвиги двухсвязанных, гидроксильных и метильных протонов явно сместились в сильное поле (рис. 6). Эти результаты продемонстрировали образование межмолекулярных водородных связей между OA и вспомогательными веществами, что подтверждает успешное инкапсулирование OA с помощью HPBCD и PVPK90.

3.2.6. Проникновение в кожу сырой олеаноловой кислоты и ее нановолокон in vitro.

Биологическая активность препарата для местного применения в основном зависит от абсорбции через кожу. Проникновение в кожу сырого ОА и его нановолокон определяли в свиной коже ex vivo. Как показано на рисунке 7, более низкое содержание OA（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>

3.3. Нановолокна олеаноловой кислоты в нецитотоксических концентрациях обладали лучшей активностью против загрязнения за счет улучшения антиоксидантной, противовоспалительной и антивозрастной активности.

Подобно OA, растворенному в ДМСО, OAnf, растворенный в PBS в концентрациях 40 мкМ и 80 мкМ, снижал жизнеспособность клеток HaCaT до 14,1% и 5,6% соответственно (фиг. 8А). Таким образом, 10 мкМ OAnf были оценены на предмет дополнительной антиоксидантной и противозагрязняющей активности, чтобы понять, обладают ли OA и его нановолокна способностью ингибировать избыточное производство АФК, вызванное ТЧ. На фигуре 8B показано, что OAnf в концентрации 10 мкМ заметно снижает индуцированное PM перепроизводство ROS. Мы также рассчитали скорость ингибирования продукции АФК, чтобы сравнить антиоксидантную активность ОА, растворенного в PBS, и ОАнф. Десять микромолей OA в PBS привели к 28,3-процентному ингибированию продукции ROS, а OAnf достигла 97,6-процентного ингибирования (рис. 8B). Эти результаты показали, что OAnf обладает лучшей антиоксидантной активностью, чем OA в PBS, при окислительном стрессе, вызванном PM в кератиноцитах. Кроме того, мы также сравнили противовоспалительную активность повреждения кератиноцитов, вызванного ПМ. Предварительная обработка необработанным OA в PBS не могла ингибировать индуцированную PM экспрессию белка NF-KB и ЦОГ-2. Напротив, предварительная обработка OAnf в PBS значительно снижала экспрессию NF. kB и ЦОГ-2 в клетках, обработанных ТЧ (p<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">

4. Дискуссия

В последнее время мониторинг концентрации твердых частиц в воздухе стал одним из важнейших показателей, используемых для оценки индекса качества воздуха. Кожа является крупнейшим иммунным органом человека, и чрезмерное воздействие ТЧ может привести к нарушению функций кожи. Джин и др. выявили, что различные виды ПМ не только остаются в наружном роговом слое эпидермиса, но и проникают в шиповатый слой и волосяные фолликулы [14]. При длительном воздействии избыточного PIA это вызывает дисфункцию кожного барьера и связано со многими кожными заболеваниями, такими как атопический дерматит, псориаз, акне и старение [19,20]. Дийкхофф и др. четко показано, что ТЧ могут запускать экзогенное и эндогенное образование АФК, что приводит к прогрессированию окислительного стресса, включая перекисное окисление липидов, окисление белков, митохондриальную дисфункцию, повреждение ДНК, активацию воспаления и ускорение процесса старения [15]. Соответственно, противодействие перепроизводству АФК, вызванному ТЧ, является хорошей стратегией и первым выбором для предотвращения повреждения окислительного стресса при чрезмерном воздействии ТЧ. Предыдущие исследования также продемонстрировали, что антиоксидантные препараты, такие как дифлоретогидроксикармалол [21], диекол [22], экстракт Opuntia humifusa [23] и экстракт вишни [24], могут эффективно ослаблять дисфункцию кератиноцитов, вызванную ТЧ. Наши результаты также показали, что ОА в ДМСО может снизить чрезмерное производство АФК, индуцированных ТЧ, и предотвратить повреждение от ТЧ. Кроме того, NF-kB является вездесущим и индуцируемым фактором транскрипции, регулирующим экспрессию провоспалительных белков, таких как ЦОГ-2, которые играют критическую роль при многих кожных заболеваниях. В наших результатах указано, что ОА может уменьшать индуцированную PM активацию NF-kB, чтобы ингибировать экспрессию воспалительного белка ЦОГ-2[25]. Более того, активация передачи сигналов MAPK может усиливать экспрессию AP-1 и приводит к регуляции транскрипции MPs[18]. В этом исследовании ОА смог подавить экспрессию белка MP-1, вызывающего старение кожи, и увеличить экспрессию белка TIMP-1, замедляющего старение кожи, для предотвращения старения кератиноцитов, вызванного РМ. Наши результаты также продемонстрировали, что ОА эффективно ингибирует фосфорилирование JNK. Таким образом, ОА может ингибировать вызванное PM воспаление кожи и старение путем подавления сигнального пути ROS/JNK при повреждении кератиноцитов, вызванном PM.

Насколько нам известно, плохая растворимость активных соединений в воде связана с низкой биодоступностью, что ограничивает их применение в медицине, пищевой и косметической промышленности [26,27]. Хорошо известно, что соединения с плохой растворимостью в воде имеют ряд общих физико-химических свойств, таких как чрезмерно большой размер частиц, меньшая площадь поверхности, липофильная структура и кристаллическая форма [28]. Наши результаты также показали, что необработанный OA обладает такими физико-химическими свойствами, включая большой размер частиц (5079,50±384,87 нм), гранулированный порошок неправильной формы 3-60 мкм с меньшей площадью поверхности (рис. 2C) и очевидная кристаллическая форма. Эти результаты показали, что растворимость ОА в воде была ниже 0,01 мкг/мл и его можно было классифицировать как практически нерастворимое активное соединение в соответствии с классификацией растворимости в воде Фармакопеи США (USP) [29]. Если эти недостатки не будут устранены, действие ОА на кожу будет сильно ограничено. В настоящем исследовании успешно использовались PVPK90 и HPBCD в качестве носителей с использованием процесса электропрядения для получения OAnf. Улучшение растворимости в воде является основным показателем, используемым для подтверждения оптимальной фармацевтической композиции, и наши результаты показали, что OA:PVPK90:HPBCD в соотношении 1:8:20 имеет наилучшую растворимость в воде. OA в зависимости от отношения HPBCD. Аналогичным образом, предыдущие исследования также показали, что более высокое соотношение циклодекстрина повышает способность препарата к инкапсуляции и приводит к значительному увеличению растворимости в воде и биологической активности куркумина [30], ресвератрола [12], тимола [31]. , и дифеноконазол [32]. Кроме того, в настоящем исследовании также сравнивались физико-химические свойства необработанного OA и его нановолокон, чтобы выяснить механизмы улучшения растворимости OA в воде. Нановолокна OA, полученные в этом исследовании, представляли собой нити с однородным наноразмером. Результаты анализа размера частиц также показали, что OAnf, восстановленный в воде, имеет наноразмерные частицы с превосходной однородностью распределения. Эти результаты показали, что OAnf имеет большую площадь поверхности, чем необработанный OA. Кроме того, образование межмолекулярных водородных связей между активными соединениями и носителями также может способствовать улучшению растворимости в воде. Спектр FTIR и HNMR OAnf продемонстрировал, что необработанный OA был эффективно инкапсулирован в HPBCD и образовывал стабилизированную структуру нановолокна с PVPK90 за счет образования межмолекулярной водородной связи между OA и HPBCD/PVPK90. Кристаллическая форма, преобразованная в аморфную форму активного соединения, также является показателем улучшения растворимости в воде. Рентгенограмма OAnf показала, что кристаллиновая структура необработанного OA трансформировалась в аморфную структуру после образования нановолокон. Подобный результат также наблюдался для нескольких активных соединений, загруженных в нановолокна [12,30]. В совокупности состав нановолокна эффективно улучшает растворимость в воде необработанного ОА за счет улучшения физико-химических свойств, включая уменьшение размера частиц, увеличение площади поверхности, образование водородных связей с носителями и аморфное превращение.

Препараты для местного применения, содержащие антиоксиданты, эффективны для доставки в эпидермис и дерму для противодействия окислительному стрессу, воспалению и старению кожи, вызванному ТЧ [33]. Основываясь на знаниях о абсорбции через кожу, можно сказать, что роговой слой является лимитирующим фактором, ограничивающим проникновение через кожу и абсорбцию активных соединений, что приводит к снижению биологической активности [34]. Результат проникновения через кожу in vitro показал, что OAnf проходит через роговой слой легче и быстрее, чем необработанный OA, и остается в эпидермисе и дерме в больших количествах. Этот результат подтвердил, что OAnf может эффективно улучшать абсорбцию кожей необработанного OA. Затем, чтобы определить, обладает ли OAnf более высокой активностью против загрязнений, чем необработанный OA, в этом исследовании для сравнения их биологической активности использовалась модель повреждения кератиноцитов, индуцированного РМ. Наши результаты показали, что OAnf в PBS обладает лучшими эффектами против загрязнения, чем необработанный OA, включая снижение перепроизводства ROS, снижение экспрессии воспалительного белка (COX-2 и NF-kB) и белка, вызывающего старение кожи (MP-1), повышенная экспрессия белка против старения кожи (TIMP-1) и подавление фосфорилирования JNK. Следовательно, OAnf может быть составом для местного применения в качестве антиоксидантного агента для предотвращения повреждения кератиноцитов, вызванного PM.

Таким образом, OAnf улучшил свои физико-химические свойства, чтобы решить проблему плохой растворимости сырого OA в воде, а также значительно улучшил абсорбцию сырого OA кожей. OAnf обладал лучшей антиоксидантной, противовоспалительной и антивозрастной активностью при повреждении кератиноцитов, вызванном PM. Следовательно, мы предполагаем, что OAnf можно использовать в качестве продукта по уходу за кожей или в качестве фармацевтического препарата для предотвращения повреждения кожи, вызванного PM, в будущем.

Эта статья взята из Antioxidants 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants.