Оптогенетическое скремблирование частот тета-колебаний гиппокампа отделяет поиск рабочей памяти от пространственно-временных кодов гиппокампа. Часть 3

Оптогенетическая стимуляция нейронов рассеянного склероза приводит к нефизиологической тета-синхронности

Удивительно, но оптогенетическая стимуляция частотой 8 Гц, связанная с темпом тета-колебаний, привела к снижению производительности при применении во время кодирования или извлечения эпизодической памяти в задаче NPOR, а также при извлечении пространственной рабочей памяти в задаче DNMTS. Чтобы лучше понять влияние тета-стимуляции на физиологию гиппокампа, мы проанализировали фазовую блокировку тета-колебаний до и во время оптогенетической стимуляции частотой 8 Гц (дополнительный рисунок 7a) и обнаружили, что такая стимуляция приводит к увеличению фазовой синхронности в разные эпохи стимуляции (дополнительный рисунок 7b). Кроме того, мы проанализировали взаимную корреляцию тета-колебаний через дорсальный CA1 (расстояние ~ 1 мм между электродами вдоль септовисочной оси (дополнительный рисунок 7c) и обнаружили, что кардиостимуляция тета-ритмов с частотой 8 Гц приводила к усилению взаимной корреляции между этими двумя электродами ( Дополнительный рисунок 7d).

Генетика — это наука, изучающая генетическую наследственность и изменчивость, а память — аспект, вызывающий серьезную озабоченность. Итак, какое отношение генетика имеет к памяти? В этой статье будут рассмотрены вопросы, связанные с памятью, с генетической точки зрения.

Прежде всего, мы знаем, что генетические гены являются основой физического и интеллектуального развития человека, и превосходство этих генов повлияет на память людей. Последние исследования показывают, что на IQ и память людей влияют генетические факторы. Исследования показывают, что генетические гены играют решающую роль в интеллекте и памяти. Поэтому некоторые люди рождаются с более сильной памятью, а другим приходится много работать и тренироваться, чтобы улучшить свою память.

Во-вторых, факторы окружающей среды также являются важными факторами развития памяти. Нам нужна не только поддержка генетических генов, но также необходимо улучшить нашу память посредством научной подготовки и хороших жизненных привычек. Например, мы можем настаивать на ежедневных физических упражнениях, достаточном сне, соблюдении принципов правильного питания и т. д., что может помочь улучшить работу нашего мозга и память.

Наконец, обычные люди не переоценивают влияние генетических факторов на развитие памяти. Поскольку генетические факторы не являются абсолютными, память и интеллект людей все же могут улучшиться за счет улучшения их усилий и тренировок. Мы всегда должны сохранять позитивный и постоянный настрой на обучение, а также постоянно исследовать и развивать потенциал нашей памяти. Я считаю, что только так мы сможем стать умнее и обрести большее чувство выполненного долга. Подводя итог, можно сказать, что связь между генетикой и памятью очень тесная, но нам не следует переоценивать генетические факторы, а следует постоянно улучшать нашу память и интеллект посредством самосовершенствования и тренировок.

Видно, что нам необходимо улучшить нашу память. Cistanche Deserticola может значительно улучшить память, поскольку Cistanche Deserticola — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффективность мясного фарша обусловлена различными содержащимися в нем активными ингредиентами, включая кислоты, полисахариды, флавоноиды и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными способами.

boost memory

Нажмите «Знайте 10 способов улучшить память»

Обсуждение

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 нейронов при проведении оптогенетической стимуляции нейронов рассеянного склероза с разрешением менее секунды для контроля тета-ритмов и оценки их роли в физиологии и памяти гиппокампа. Важно отметить, что, используя возбуждающий опсин и стимуляцию скремблированной или 8 Гц, мы смогли последовательно и надежно отменить или стимулировать тету гиппокампа соответственно.

По сравнению с ингибированием рассеянного склероза с использованием либо ингибирующего опсина, либо фармакологических соединений (например, мусцимола), наш подход позволяет внутри субъекта сравнивать два противоположных состояния (стимулированное и отмененное тета) при сохранении уровней активности в клетках MS-PV. Мы объединили задачу линейного отслеживания с тональной подсказкой, которая вместе с теоретико-информационными подходами позволила нам распутать пространственные и временные коды гиппокампа. Этот метод устраняет необходимость в произвольных пороговых значениях, обеспечивая стандартизированный подход к анализу визуализации кальция. Хотя большая часть пирамидных нейронов CA1 экспрессирует смесь пространственно-временных кодов, мы сосредоточили наш анализ на нейронах, специально настроенных на место, время или пройденное расстояние.

Хотя пространственное кодирование широко исследовалось в CA1, в последнее время больший интерес вызывают временные и дистанционные коды. Временные28,35–37 и дистанционные коды37 извлекаются путем фиксации зрительно-пространственных сигналов или извлекаются аналитически с использованием обобщенных линейных моделей в парадигмах виртуальной реальности26,27,38. Здесь мы предлагаем подход к распутыванию пространственных, временных и дистанционных кодов с использованием теоретико-информационного подхода, который вместе с нашей задачей по изменению сигналов позволяет анализировать реальные пространственно-временные и мультиплексированные коды у свободно движущихся животных. Большое количество пирамидных нейронов CA1 кодирует мультиплексированную информацию о местоположении, расстоянии и времени, как сообщалось ранее26,27,38, в дополнение к сигналам собственного движения, таким как ускорение, скорость и ориентация60.

Мы обнаружили, что скремблирование частоты и оптогенетическая стимуляция частотой 8 Гц резко подавляли или стимулировали тета-ритмы соответственно и приводили к снижению общей активности в субпопуляции пирамидных клеток CA1, не вызывая при этом существенных изменений в активности клеток места, аналогично предыдущим отчетам с использованием фармакологического ингибирования36, 46,47 или оптогенетическая 9,48 стимуляция MS или перегородочные входы в гиппокамп. Поскольку известно, что нейроны рассеянного склероза являются основным драйвером колебаний гиппокампа, мы ожидали, что стимуляция рассеянного склероза будет связана с нарушением активности клеток времени или расстояния в условиях сниженных тета-ритмов, но никаких изменений не произошло, когда тета была отменена или подвергнута кардиостимуляции. Кроме того, увеличение частоты колебаний гиппокампа до 8 Гц не приводило к изменениям качества пространственных кодов, как сообщалось ранее9, и не изменяло временные коды, как это наблюдалось в нашей поведенческой парадигме.

Хотя сообщалось, что клетки времени (но не места) могут напрямую зависеть от входных сигналов медиальной энторинальной коры (MEC)61, недавние экспериментальные данные свидетельствуют о том, что повреждения MEC не приводят к каким-либо изменениям в физиологии клеток времени гиппокампа62. Примечательно, что более недавнее исследование показало, что оптогенетическая стимуляция МС не нарушала пространственные коды ячеек сетки в энторинальной коре63, что дополнительно указывает на то, что активность РС не участвует напрямую в пространственных кодах внутри формирования гиппокампа. Вместе с нашими результатами это указывает на то, что временные коды могут быть либо результатом MS-зависимых вычислений в энторинальной коре63 (1), либо генерироваться внутри самого гиппокампа (2).

ways to improve memory

Хотя ранние исследования показали, что МС играет важную роль в поддержании клеток времени и поддержке рабочей памяти36, недавние экспериментальные данные показывают, что точный вклад клеток времени в работу рабочей памяти может быть меньше, чем считалось ранее62. Поскольку нейроны MS-PV, вероятно, сохраняют значительные уровни активности во время оптогенетической стимуляции с скремблированием частоты (в отличие от подходов с ингибированием), наши результаты убедительно подтверждают роль точно рассчитанной перегородочной активности в поддержке рабочей памяти, как предполагалось ранее. Хотя мы наблюдали снижение производительности памяти при использовании оптогенетической стимуляции во время извлечения информации, стимуляция во время фазы кодирования задач DNMTS не была связана со снижением памяти в задаче DNMTS. Стимулирование тетаосцилляций с частотой 8 Гц во время фазы кодирования или извлечения задачи NOPR приводило к нарушению восстановления памяти. Наш электрофизиологический анализ далее показывает, что такая стимуляция приводит к вовлечению отдаленных областей дорсального СА1 в одну и ту же фазу с нефизиологической блокировкой фазы. Хотя мы непосредственно не исследовали причинно-следственную связь между фазовыми изменениями и производительностью памяти, было также обнаружено, что синхронизация пиков и фазовая прецессия связаны с измененной функцией рабочей памяти, несмотря на то, что кодирование места остается нетронутым64. Более того, ранее было показано, что фазовая синхронизация пирамидных нейронов с тетаосцилляциями является предиктором качества памяти65.

Примечательно, что одним из ограничений нашего подхода к установлению свойств настройки времени и расстояния является то, что он требует в четыре раза больше выборок, чем обычный линейный трек, что увеличивает вероятность фотообесцвечивания при добавлении условий стимуляции к экспериментальной временной шкале. Хотя мы обнаружили, что оптогенетические стимуляции не влияют на пространственные коды в течение одного и того же сеанса, более современное оборудование для визуализации, включающее датчики с повышенной чувствительностью, может помочь предотвратить фотообесцвечивание и обеспечить более длительные сеансы записи, таким образом, отбирая временные и дистанционные клетки вместе со стимуляцией. Мы также обнаружили, что пул нейронов, которые значимо и специфически кодируют только одну переменную, невелик по сравнению с количеством конъюнктивных нейронов, что делает требования к выборке для этих высокоспецифичных нейронов намного выше.

Мы предоставляем экспериментальные доказательства того, что манипуляции с МС не изменяют скорость движения и, наоборот, скорость движения диктует тета-частоту. Несмотря на то, что коды места и времени сохранялись во время наших стимуляций MS, часть (~6%) клеток подвергалась прямой модуляции и могла объяснять нарушения памяти, наблюдаемые в наших поведенческих анализах. Ранее сообщалось, что интернейроны PV в гиппокампе являются частью микросхемы, необходимой для регуляции консолидации памяти66,67, и наши оптогенетические манипуляции могут быть связаны с подавлением активности части этих клеток. Более того, хотя мы не наблюдали изменений в других частотных диапазонах, кроме тета, мы не можем исключить, что время спайков пирамидных нейронов CA1 может быть радикально изменено при скремблировании тета-колебаний, в то время как было показано, что стимуляция частотой 8 Гц не приводит к увеличению активности гиппокампа18, что может объяснить дифференциальные эффекты эти модели стимуляции производительности рабочей памяти. Наблюдаемые нами нарушения памяти, вероятно, были нехолинергическими: во-первых, в наших иммуногистологических экспериментах мы практически не обнаружили экспрессии ChrimsonR в ChAT-нейронах РС. Нейроны ChAT связаны со снижением частоты пульсаций45,57. Трансфекция ChrimsonR нейронов MS VGLUT2 также маловероятна, поскольку активация этих нейронов связана с прямым увеличением двигательной активности 68, чего мы не наблюдали.

Хотя точное временное расположение пирамидных спайков CA1 может объяснить, по крайней мере частично, влияние стимуляции рассеянного склероза на память, следует принимать во внимание альтернативные механизмы. Примечательно, что помимо гиппокампа и энторинальной коры, PV-нейроны MS проецируются в ретросплениальную кору3 и могут быть ответственны за некоторые наблюдаемые здесь нарушения памяти.

Таким образом, используя визуализацию кальция, оптогенетику и электрофизиологию, мы обнаружили, что тета-ритмы можно стимулировать или устранять с помощью стимуляции МС. Такая стимуляция нарушала как эпизодическую, так и рабочую память. Эти эффекты не были холинергическими и не нарушали пульсационную активность гиппокампа. Наконец, хотя небольшая часть нейронов гиппокампа реагировала непосредственно на оптогенетическую стимуляцию МС, клетки места, времени и расстояния не были нарушены манипуляциями с тета-колебаниями. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что, хотя вход MS в гиппокамп играет важную роль в памяти, мультиплексированные коды в пирамидных нейронах CA1 не могут быть прямым субстратом для таких функций.

Методы

Животные

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Макгилла и Канадским советом по уходу за животными (протокол 2015-7650). Всего n=41 самцов (n=20) и самок (n=21) мышей B6;129P2 PV-Cre в возрасте 8–16 недель (Лаборатория Джексона, RRID: IMSR{{) 10}}JAX:017320) использовались в этом исследовании. n мышей=5 использовали для совмещения оптогенетики с визуализацией кальция; n мышам=3 имплантировали для визуализации кальция, оптогенетики и электрофизиологического контроля; n=4 мышей использовали в электрофизиологических исследованиях; n=29 мышей трансфицировали и имплантировали для поведенческих анализов. Мышей содержали индивидуально с 12-часовым циклом света/темноты при 22 градусах и влажности 40% с пищей и водой в неограниченном количестве. Все эксперименты проводились во время светлой части цикла свет/темнота.

Аденоассоциированные вирусные векторы

Аденоассоциированный вирус AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene # 100834, полученный из Vector Core Пенсильванского университета) использовался во всех экспериментах по визуализации кальция. Аденоассоциированный вирус (AAV) серотипа dj (гибридный капсид, созданный из восьми различных серотипов AAV) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato был получен из лаборатории Vector Core в Университете здравоохранения и науки штата Орегон в Портленде, штат Орегон. Хотя он является геном домашнего хозяйства, мы не наблюдали трансфекцию в холинергических клетках (см. «Результаты» и рис. 2b–e). В качестве контроля использовали конструкцию eYFP без последовательности ChrimsonR (в этой рукописи называемую контролем YFP).

Хирургические процедуры

Мышей анестезировали изофлюраном (индукция 5%, поддержание 0,5–1%) и помещали в стереотаксическую рамку (David Kopf Instruments). Температуру тела поддерживали с помощью грелки, глаза увлажняли гелем (Optixcare). и карпрофен (10 мл/кг) вводили подкожно. Череп полностью очищали от всей соединительной ткани и выполняли небольшую трепанацию черепа с использованием стоматологической бормашины для последующей инъекции или имплантации.

Вирусные инъекции. Все вирусные инъекции выполнялись с использованием стеклянной пипетки, соединенной с инжектором Nanoject III (Drummond). 500 нл AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (или контрольный eYFP) доставляли в MS со скоростью 1 нл/с в следующих координатах, основанных на стереотаксическом атласе эталонной мыши69 (расстояние от Брегмы в мм): переднезадний (AP) 0,85, медиолатеральный (ML) 0, дорсовентральный (DV) -4,50 с использованием угла 5 градусов в плоскости ML. После операции за животными наблюдали до выздоровления.

Оптоволоконный имплантат. Через две недели после инъекции мышам вводили анестезию для имплантации после той же хирургической процедуры. В те же координаты имплантировали оптоволокно диаметром 200 мкм с керамическим наконечником (Thorlabs). Имплантаты были зафиксированы с помощью C&B-Metabond® (Patterson Dental). Поверх зубного цемента наносили черный лак для ногтей, чтобы блокировать излучение света во время оптогенетической стимуляции.

Электродные имплантаты. Массив из 7 вольфрамовых микроэлектродов (импеданс ~ 1 МОм) был опущен в дорсальную часть CA1, охватывая пирамидально-слоевую структуру (pyr), лучистый слой (rad) и лакуносуммолекулярный слой (lm). Винты, помещенные в кость над лобной корой и мозжечком, служили заземлением и эталоном соответственно. После установки электрода, заземления и эталонного размещения был нанесен стоматологический цемент для постоянной фиксации имплантата к черепу.

Имплантат для визуализации кальция. Мы инъецировали вирус AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 нл при 1 нл с-1) в гиппокамп CA1, используя следующие координаты: переднезадний (AP) - 1,86 мм от брегмы, медиолатеральный (ML) 1,5 мм, дорсовентральный. (ДВ) 1,5 мм. Через две недели после инъекции мышей анестезировали изофлураном и череп очищали. А<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

memory enhancement

Одновременная визуализация кальция и электрофизиологические записи. Чтобы контролировать влияние имплантатов GRIN на тету гиппокампа, а также перекрестные помехи между мини-скопом и светом оптогенетического возбуждения, мы прикрепили к линзам GRIN вольфрамовые микроэлектроды. Для этого мы поместили линзы GRIN горизонтально под микроскопом малого увеличения в беспыльной среде. Вольфрамовый микроэлектрод осторожно помещали на верхний край линзы GRIN с помощью микроманипулятора. Мы использовали известный диаметр линзы GRIN в качестве эталонной единицы для оценки желаемого выступания электрода (~ 50 мкм, дополнительно оцениваемого в цифровом виде после микрофотографии препарата) по нашим запланированным координатам имплантации. Небольшое количество (~50 мкл) суперклея было нанесено на верхний край линзы GRIN с установленным электродом и оставлено для высыхания на ~10 минут перед нанесением следующего слоя клея. Для фиксации электрода на линзе GRIN использовались пять тонких слоев. После имплантации этих сборок GRIN-электродов по описанному выше протоколу выступающие проволоки аккуратно сгибались и прятались под защитным колпачком (высотой 1–1,5 см), извлеченным из груши ручной аспирационной пипетки в качестве замены Квик-Сила.

Поведенческие процедуры in vivo

Привыкание. С мышами осторожно обращались в течение ~5 минут в течение одной недели с постепенным привыканием к процедуре подключения (оптоволокно, минископ и электрофизиологические предварительно усиленные привязи). Затем животным давали воду по расписанию (2-часовой доступ в день).

Записи с минископа. Минископы (V3) собирались с использованием инструкций с открытым исходным кодом (miniscope.org). Данные изображения были получены с помощью датчика изображения CMOS (Aptina, MT9V032) и мультиплексированы через легкий коаксиальный кабель. Данные были получены с помощью блока сбора данных (DAQ), подключенного через хост-контроллер USB (Cypress, CYUSB3013). Поведение животных записывалось с помощью веб-камеры потребительского уровня (Logitech), установленной над окружающей средой. Данные о кальции и поведении были записаны с использованием miniscope.org, исходного программного обеспечения для сбора данных DAQ. Система сбора данных одновременно получала потоки поведенческих и клеточных изображений с частотой 30 Гц в виде несжатых файлов .avi по 1000 кадров для 15-минутных сеансов записи, а также соответствующие временные метки, чтобы обеспечить точное временное выравнивание данных визуализации поведения и кальция.

Электрофизиологические записи in vivo. Через 1 неделю послеоперационного восстановления и одну неделю привыкания к привязной установке регистрировали LFP у имплантированных мышей. Все записанные сигналы с имплантированных электродов усиливались тросовым предусилителем, а затем оцифровывались на частоте 22 кГц с использованием системы цифровой записи (Neuralynx, США). Записи сигналов каждого канала сохранялись вместе с видеозаписями и TTL-сигналами лазерного диода для последующего анализа.

Оптогенетическая стимуляция. Лазерная стимуляция осуществлялась через оптоволоконный шнур (диаметром 200 мкм) с использованием волоконного источника света на лазерном диоде (дорические линзы). Интенсивность света была откалибрована, а длина волны скорректирована с использованием комплекта измерителей мощности с консолью PM100D и тонким фотодиодным сенсорным фонарем S130C (Thorlabs). Каждая электростимуляция (включая частоту 8 Гц) выполнялась прямоугольными импульсами длительностью 5 мс. Чтобы применить стимуляцию скремблированного света, мы использовали микроконтроллер Arduino для генерации сигнала колебаний белого шума, который напрямую подавался на аналоговый вход драйвера лазерного диода. Для выполнения случайно выбранной частотной стимуляции мы использовали стандартный протокол 5 с ВКЛ, 5 с ВЫКЛ, но для каждой эпохи стимуляции мы использовали микроконтроллер Arduino для случайного выбора частоты стимуляции в тета-диапазоне. При применении оптогенетической стимуляции во время поведения вокруг места соединения между патчкордом и имплантатом наконечника мыши надевался свободный кусок термоусадочной трубки, чтобы ограничить излучение видимого света. Интенсивность света выражается как номинальная мощность, измеренная на кончике оптоволоконного имплантата в сборе с шнуром (до хирургической установки) и скорректированная на соответствующую длину волны.

Поведенческие анализы

Последовательный тональный линейный трек. У мышей был водный график, и они могли получать доступ к воде только в течение 2 часов в день с 18:00 до 20:00. Чтобы распутать пространственные, временные и дистанционные коды, мы построили линейную дорожку длиной 134 см из кирпичиков Lego® среднего серого цвета, которую можно легко модифицировать и реализовать без необходимости использования воды. необходимо навсегда изменить структуру лабиринта. Пироэлектрические датчики были размещены на каждом конце линейной дорожки и подключены к микроконтроллеру Arduino. Каждое обнаружение последовательно вызывало новый звуковой сигнал, указывая на ход доставки награды. Следующие тональные сигналы использовались и воспроизводились с помощью акустического динамика: звуковой сигнал длительностью 1 с при частоте 2000 Гц, звуковой сигнал длительностью 250 мс при частоте 3000 Гц и непрерывный тональный сигнал при частоте 4000 Гц. Когда прозвучал последний непрерывный звуковой сигнал, награда (10% сахарозы в воде) была доставлена в начальный конец линейной дорожки в крышке пробирки Falcon емкостью 15 мл. Изменения направления бега до срабатывания следующего сигнала считались ошибками и не приводили к вручению награды. Результативность измерялась как количество правильных попыток (без ошибок), деленное на общее количество попыток.

Распознавание места нового объекта. В первый день мышам давали возможность свободно исследовать темно-серое открытое поле размером 45 × 45 см, на стенках которого находились визуальные сигналы (большие белые горизонтальные и вертикальные решетки) в течение 10 мин. На второй день в течение 10 мин предъявлялись два одинаковых предмета (основание руки помощи). На третий день мышам разрешили исследовать то же открытое поле, при этом местоположение одного из двух объектов было смещено. Чтобы контролировать потенциальные смещения пространственных предпочтений, как исходное, так и смещенное положение объектов были рандомизированы. Мыши приписали случайный порядок тестирования, который оставался неизменным на протяжении трех дней тестирования. Поведение записывалось на видеокамеру (Logitech) и анализировалось в автономном режиме. Поведенческий анализ проводился без учета генотипа и лечения. Исследование объекта определялось как периоды, когда нос мыши находился в пределах 1 см от объекта. RI рассчитывался следующим образом:

supplements to improve memory

Автоматизированное отложенное несоответствие образцу задачи. Мышам давали воду по расписанию и обучали их непрерывному Т-образному лабиринту выполнять отложенную задачу, не соответствующую выборке. Вкратце, каждое испытание было разделено на две фазы: выборка и тестирование. На этапе отбора проб одно плечо было заблокировано, и мышей заставляли исследовать противоположное плечо, где они получали в награду 50 мкл воды с 10% сахарозы. После завершения фазы выборки мышей подвергали задержке (10 с) в стартовом отсеке. Затем, во время фазы тестирования, можно было исследовать обе ветви, но приманкой подвергалась только противоположная (неисследованная) рука, так что мышам приходилось менять места между фазами выборки и тестирования. Мышей подвергали 10 испытаниям (образец + тест) в день в течение 10 дней подряд, и ежедневный показатель успеха рассчитывали как количество правильных испытаний, деленное на общее количество испытаний.

Посмертные гистологические анализы

После завершения поведенческого тестирования мышей подвергали глубокому наркозу смесью кетамин/ксилазин/ацепромазин (100, 16, 3 мг/кг соответственно, внутрибрюшинная инъекция) и транскардиально перфузировали 4% параформальдегидом (PFA) в PBS. Мозг экстрагировали и постфиксировали в течение ночи в PFA при 4 градусах, а затем промывали в PBS в течение дополнительных 24 часов при 4 градусах. Мозг и срезы до использования подвергали криозащите в растворе 30% этиленгликоля, 30% глицерина и 40% PBS. Затем каждый мозг делал срезы толщиной 50 мкм с помощью вибратома: каждый срез последовательно собирали в 4 разные пробирки по 1,5 мл для проведения различных анализов. (расположение электродов, иммуногистохимия).

Иммуногистология. Используя одну пробирку с собранными срезами мозга (25% выборки) для каждого анализа, срезы промывали в течение 3 × 5 мин в PBS для удаления криозащитного раствора. Срезы инкубировали в течение ночи с PGT (0,45% желатина и 0,25% тритона в PBS) при 4 градусах. Затем срезы инкубировали с первичными антителами: либо 1:200 козий антихолин-ацетил. -трансферазы из Millipore или 1:500 мышиного анти-PVмоноклонального IgG1 от Sigma-Aldrich в PGT при комнатной температуре в течение 48 часов или 2 часов соответственно. После промывания в течение 10, 20 и 30 минут срезы инкубировали со вторичными антителами [1:2000 ослиных анти-козьих антител в сочетании с Alexa 488 или 1:500 козлиных антимышиных IgG1 в сочетании с Alexa 488 (Life Technologies)] в PGT для 45 мин. После 10, 20 и 30-минутной промывки в PBS срезы затем монтировали на предметные стекла и постоянно покрывали монтажной средой Fluoromount, содержащей DAPI. В это исследование были включены только мыши с гистологически подтвержденным размещением имплантатов. Для линз GRIN поверхность линзы должна была быть<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Анализ данных

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 см/с на линейной трассе).

Автоматизированное отслеживание поведения. Чтобы извлечь информацию о положении, скорости и направлении головы мышей, мы использовали DeepLabCut70,71. Вкратце, мы обучили модель обнаруживать у мышей уши, нос, тело и основание хвоста. Направление головы оценивалось с использованием угла между каждым ухом или носом и телом, в зависимости от возможности измерения. Данные о местоположении были интерполированы с учетом частоты выборки изображений кальция с использованием линейной интерполяции. Скорость была получена путем вычисления Δd/Δt, где d — расстояние и время t, а затем сглаженный результат путем применения фильтра Гаусса с сигмой=33 мс для удаления артефактов обнаружения. Сигналы скорости использовались для определения периодов двигательной активности и расчета места, времени и модуляции активности на расстоянии специально для этих периодов.

Визуализирующий анализ кальция. Анализ данных визуализации кальция проводился с использованием MATLAB 2020a и Python 3.8.4. Видеозаписи были проанализированы с помощью конвейера Miniscope Analysis (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Вкратце, с помощью NoRMCorre72 применялась жесткая коррекция движения (вращение и перемещение), а перед объединением видео подвергалось пространственной субдискретизации (3×). Следы кальция были извлечены с использованием CNMFe51 с использованием следующих параметров: gSig=3 пикселей (ширина ядра Гаусса), gSiz=20 пикселей (приблизительный диаметр нейрона), фоновая _модель='кольцо', пространственный_алгоритм='hals', мин_корр=0.8 (минимальный порог корреляции пикселей), мин_PNR {{17 }} (минимальный порог отношения пика к шуму).

Необработанные следы кальция были отфильтрованы для удаления высокочастотных колебаний и преобразованы в бинарную форму: Коротко говоря, нейроны считались активными, когда нормализованная амплитуда сигнала кальция превышала два стандартных отклонения, а производная первого порядка была выше 0 (дополнительную информацию см. в ссылке 52). по методике52). Для извлечения нейронов, настраивающихся на конкретные переменные, местоположение, время и расстояние были объединены в ячейки (местоположение: ячейки 3 см; время: ячейки 1 с; расстояние: ячейки 3 см). На основе бинаризованных сигналов мы рассчитали предельную вероятность активности клеток P Að Þ, которую мы используем в качестве показателя активности нейронов. Что еще более важно, мы затем выводим вероятность активности или «вероятность быть активным с учетом состояния переменной» PA j Si, используя разделенные переменные:

ways to improve your memory

где M — общее количество возможных поведенческих состояний, а P(Si∩Aj) — совместная вероятность того, что животное находится в ячейке I одновременно с уровнем активности j (0 или 1). Чтобы оценить значимость полученного значения MI, мы затем сгенерировали 1000 перетасованных суррогатов, используя случайные круговые перестановки. Мы выбрали циклические перестановки, потому что они устраняют временную связь между активностью и поведением нейронов, сохраняя при этом временную структуру переходных процессов кальция и, таким образом, приводят к более консервативным результатам (в отличие от полной рандомизации каждой точки данных, которая увеличивает значимость результатов). Поскольку перетасованные суррогаты не были систематически нормально распределены, мы использовали непараметрический подход, где значение p (pN) соответствует количеству точек данных из перетасованного распределения, которое больше, чем фактические данные для каждого интервала, разделенное на количество перестановок52. 73.

Чтобы определить модуляцию клеток посредством оптогенетической стимуляции, мы использовали аналогичный подход, но вычислили ИМ между активностью нейронов и бинаризованными сигналами стимуляции (таким образом, рассматриваемыми как поведенческое состояние). Затем для извлечения статистической значимости использовали ту же самую процедуру кругового перетасовывания.

improve brain

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 см/с, набор обучающих данных был создан с использованием 90% данных. Оставшиеся 10% данных были использованы для тестирования. Ошибка декодирования была рассчитана с использованием 50 загрузочных суррогатов и пула из 160 ячеек с использованием случайно выбранных точек данных с заменой. Предполагается, что каждый нейрон не зависит друг от друга, что на практике не так и приводит к большим ошибкам реконструкции, но уменьшает время вычислений. Апостериорная вероятность популяции была получена из следующего уравнения:

improve memory

Отслеживание клеток в течение нескольких дней. Нейроны отслеживались в течение нескольких дней с помощью CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Коротко говоря, пространственные следы были выровнены с использованием жесткого выравнивания для корректировки вращений и перемещений. После выравнивания мы считали наборы кандидатов одним и тем же нейроном, если их максимальное расстояние было<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Электрофизиологический анализ. Анализ электрофизиологических данных проводился с использованием MATLAB 2020a с использованием как обработки сигналов, так и набора инструментов вейвлетов. Вейвлет-свертка применялась к сигналам LFP с использованием сложных вейвлетов Морле («cmor1–1,5» в MATLAB), когда требовалась точность как во временной, так и в частотной области. Свертка Фурье в скользящем окне (2-секундное окно в тета-диапазоне, 5-секундное окно в гамма-диапазоне, шаг перемещения 10 мс) использовалась, когда точность частотной области имела преимущество над точностью временной области (например, доминирующая частота топ-графика при стимуляции с использованием оптогенетики). Анализ спектральных плотностей мощности проводили, когда мыши бегали со скоростью 5 см/с или выше, если не указано иное.

Сила колебаний. ОС рассчитывалась как отношение совокупной спектральной плотности мощности вокруг пиковой частоты колебаний ±1 Гц к совокупной мощности полосы в тета-диапазоне (4–12 Гц). Этот показатель становится равным 1, когда вся спектральная плотность мощности попадает в пределы пиковой частоты колебаний (например, 8 Гц при стимуляции на этой частоте).

increase brain power

Обнаружение и анализ КСВ. Для мониторинга КСВ мышам разрешали свободно исследовать открытое поле в течение 1 0 минут во время записи. Стимуляции (зашифрованные или 8 Гц) выполнялись по схеме 5 с ВКЛ, 5 с ВЫКЛ. Для анализа рассматривались только периоды тихого покоя. С этой целью мы вычислили соотношение z-показателей мощности тета/дельта после фильтрации для каждой полосы частот, выполнения преобразования Гильберта и рассматривали только периоды, когда результирующее значение было ниже 0. Чтобы обнаружить КСВ, мы фильтровали сигналы LFP в диапазоне 150–250. Полоса частот Гц и впоследствии z-оценка. Пульсации были обнаружены с использованием функции findpeaks в MATLAB со следующими параметрами: порог=4 sd, минимальная ширина пика=0 с, минимальное расстояние=0,03 с.

Оптогенетическое скремблирование частот тета-колебаний гиппокампа отделяет поиск рабочей памяти от пространственно-временных кодов гиппокампа. Часть 3