Часть 1: Ингибитор NF-kB и агонист AMPK: сетевое прогнозирование и интеграция мультиомики для получения сигнальных путей для актеозида против болезни Альцгеймера

Контакт: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Ин-Ци Ли1†, И Чэнь1†, Си-Ци Цзян1, Юань-Юань Ши2, Сяо-Ли Цзян1, Шань-Шань Ву1,Пин Чжоу1, Хуэй-Ин Ван1, Пин Ли1*и Фэй Ли1,2*

¹ Государство Ключ Лаборатория из Естественный Лекарства Китай Фармацевтический Университет Нанкин, Китай ² Колледж из АптекаСиньцзянский медицинский университет, Урумчи, Китай

ЗНАКОМСТВО

С возрастом и быстрым ростом населения число случаев деменции в мире показало тенденцию к росту.Болезнь Альцгеймера(AD) является распространенным нейродегенеративным заболеванием, сопровождающимся когнитивными нарушениями и дискинезией (Perea et al., 2020), которое является наиболее частым типом деменции. Он характеризуется тяжелой потерей нейронов, старческими бляшками и нейрофибриллярными клубками (Shiao et al., 2017). Патогенез БА(Болезнь Альцгеймера)является многомерным и связан с нейровоспалением. Нейровоспаление обусловлено активацией глиальных клеток, что тесно связано с возникновением и развитием БА.(Болезнь Альцгеймера)(Ханслик и Улланд, 2020; Линнербауэр и Ротхаммер, 2020). Во время прогрессирования и обострения нейровоспаления микроглия рассматривается как ключевой фактор.

Микроглии являются первичными иммунными клетками в центральной нервной системе, которые тесно связаны с каскадом процессов, таких как развитие мозга, поддержание нервной среды, а также реакции на травмы и восстановление (Perea et al., 2020). Кроме того, микроглия может стимулироваться к фенотипу M1 и увеличивать экспрессию провоспалительных цитокинов при заболеваниях, связанных с нейровоспалением, таких как AD.(Болезнь Альцгеймера)происходит (Tsukahara et al., 2020). Исследования также показывают, что поляризация фенотипа М1 часто сопровождается метаболическими нарушениями (Li L. et al., 2020), что приводит к дисбалансу энергетического обмена и митохондриальной дисфункции (Agrawal and Jha, 2020). Эти неблагоприятные изменения обусловлены нейродегенерацией, даже БА.(Болезнь Альцгеймера).

Актеозид(ACT), фенилетаноидный гликозид, в основном получен изЦистанхе тубулоза. Все больше доказательств свидетельствуют о том, что ACT обладает многочисленными фармакологическими действиями, включая нейропротекторные (Wei et al., 2019), противовоспалительные (Lai et al., 2019) и антиоксидантные (Ji et al., 2019) эффекты. В частности, было доказано, что ACT может улучшить обучение и ухудшение памяти, а также повысить энергетический метаболизм у крыс, индуцированных стрептозотоцином (Chen J. et al., 2020). Кроме того, он также может ингибировать гибель нейрональных апоптотических клеток и повреждение митохондрий у экспериментальных мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом (Li W. et al., 2020). Однако о влиянии ACT на поляризацию микроглии M1/M2 и ее механизм сообщается редко. До сих пор такие механизмы, как восстановление функции митохондрий и регуляция клеточного метаболизма, неясны, и необходимы дальнейшие научные исследования для уточнения точного механизма.

Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы исследовать терапевтическую эффективность ACT, а также лежащий в основе молекулярный механизм ACT на AD(Болезнь Альцгеймера). При этом на основе консолидированных баз данных установлен систематический in silico метод идентификации лекарственной мишени. Далее мы исследуем возможные механизмы ACT на молекулярно-биологическом уровне путем интеграции РНК-секвенирования (RNA-seq) с методом метаболомики и методами молекулярной биологии. Сочетание стратегии систематического скрининга in silico, in vivo и in vitro обеспечивает новый протокол объективного обнаружения многоцелевых соединений традиционной китайской медицины.

Цистанхе тубулоза можно лечитьБолезнь Альцгеймера

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Моделирование сети

Четыре онлайн-платформы были объединены для прогнозирования и обнаружения целей ACT, а именно: GeneCards1, подход ансамбля подобия (SEA2), SwissTargetPrediction3 и PharmMapper4. Все генные ассоциации AD(Болезнь Альцгеймера)были независимо собраны из DisGeNET5 и GeneCards. После анализа взаимодействия цель-цель, проведенного String database6, сеть была дополнительно интегрирована программным обеспечением Cytoscape (версия 3.8.2). Анализ обогащения GO и KEGG был проведен в базе данных DAVID7 для аннотирования и добычи сети.

Группировка животных и моделей

Дикие рыбки данио (штамм AB, 4 месяца) были выбраны в этом исследовании (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Они поддерживались в цикле 14/10-ч свет/темнота при 28oC, следуя предыдущему методу (Li Y. Q. et al., 2020). Все эксперименты с рыбками данио проводились под наблюдением Комитета по этике животных Китайского фармацевтического университета.

Личинки рыбок данио были разделены на шесть групп и обработаны от 3 дней после оплодотворения (dpf) до 7 dpf: контрольная группа, модельная группа, модель + донепезил гидрохлорид (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) группа и модель + ACT (чистота ВЭЖХ 98%, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.). Контрольную группу поддерживали в среде с 0,2% ДМСО, а модельную группу обрабатывали 150 мкМ AlCl3 (рН 5,8). Модель + DPZ группу проводили совместно с AlCl3 и 8 мкМ DPZ. Группы модели + ACT совместно обрабатывали AlCl3 и различными концентрациями ACT (200, 100 и 50 мкМ).

Поведенческий анализ

Движения личинок рыбок данио были зафиксированы поведенческим анализатором ViewPoint (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) при 28oC. Вкратце, поведенческие параметры и обработка результатов соответствовали методу, который мы установили ранее (Li Y. Q. et al., 2020). При этом для оценки восстановления дискинезии у рыбок данио были выбраны средняя скорость (AS), изменение скорости (AS), скорость восстановления дискинезии (DRR) и эффективность реакции (RE, %).

Определение активности ацетилхолинэстеразы и холина ацетилтрансферазы

После обработки от 3 до 7 dpf личинок рыбок данио собирали для измерения активности ацетилхолинэстеразы (AChE) и холина ацетилтрансферазы (ChAT). Основываясь на протоколе производителя, активность была обнаружена наборами иммуноферментного анализа (ELISA) (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай).

Клеточные культуры и методы лечения

Клеточная линия BV-2 была приобретена у American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, UNITED). Они культивировались в DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Нанкин, Китай). Среда была дополнена 10% FBS (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США),

100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина, сопровождаемые 95% воздуха/5% CO2 при 37oC. Клетки BV-2 инкубировали с ACT (50, 25 и 12,5 мкМ) или стимулировали липополисахаридом (ЛПС, 1 мкг/мл; Sigma- Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 24 ч. Клетки наблюдались под инвертированным микроскопом (Nikon ECLIPSE Ti2, Япония).

Анализ жизнеспособности клеток

Для оценки жизнеспособности клеток использовался анализ Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Институт биоинженерии JianCheng, Нанкин, Китай). Вкратце, поглощение измерялось при 450 нм с помощью считывателя микропластин (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, США).

Анализ производства оксида азота

Оксид азота (NO) определяли путем измерения уровней нитритов в супернатанте культуры BV-2 с использованием реагента Грисса. Кратко среду (100 ul) перенесли на новую 96-луночную пластину, в каждую лунку добавляли такой же объем реагента Грисса и реагировали в течение 15 мин в темноте. Поглощение при 540 нм определяли с помощью Microplate Reader.

Уровни воспалительных цитокинов в супернатанте

Концентрации TNF-a, IL-1β и IL-10 в клеточном супернатанте BV-2 определяли с помощью наборов ИФА в соответствии с инструкциями производителя.

Определение клеточного метаболизма с помощью анализа ВЭЖХ-Q-TOF-MS

Клетки BV-2 сеяли в шестилуночной чашке отдельно (n = 6/группа). После обработки среду удаляли, а клетки трижды промывали холодным ПБС. Затем они немедленно подвергались воздействию жидкого азота для подавления клеточного метаболизма. Клетки были собраны с 80% холодным метанолом. Чтобы облегчить осаждение белка, клетки энергично вращались в течение 1 мин и центрифугировали при 13 000 об/мин (15 мин, 4oC). Клеточную суспензию сушили под струей азота. Высушенный остаток восстанавливали в 150 ul предварительно охлажденного 25% ацетонитрила. Для обеспечения стабильности и точности анализа последовательности каждый образец ячейки с равным объемом (10 ul) комбинировали в качестве образцов контроля качества. Во время обнаружения метаболитов эти образцы вводили после каждых шести образцов, чтобы подтвердить их стабильность. 1-уль-аликвота вводили для ВЭЖХ-Q-TOF-MS.

Анализ проводился на ВЭЖХ-системе Agilent 1290

связан с масс-спектрометром Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Отделение проводилось на колонне ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 мин 100 мм, 1,7 мкм). Подвижная фаза состояла из 0,1% муравьиной кислоты – воды (v/v; А) и ацетонитрил (В).

Скорость потока устанавливали на уровне 0,4 мл/мин при следующем оптимальном условии градиентного элюирования: от 0 до 2 мин, 5% В; от 2 до 20 мин, от 5 до 95% B (режим положительных ионов); от 0 до 2 мин, 5% В; от 2 до 20 мин,5 до 95% В (отрицательный ионный режим). Рабочие параметры масс-спектрометра были установлены следующим образом: температура газа, 320oC; сухий газ, 10 л/мин; небулайзер, 35 фунтов на кв. дюйм; VCap, 4 000 В; фрагментор, 120 В.

данные проводились с помощью MetaboAnalyst8. В сочетании с литературой дифференциальные метаболиты (VIP > 1, t-тест p< 0.05)="" were="" identified="" on="" hmdb9="" .="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">

Измерение потенциала митохондриальной мембраны

Митохондриальный мембранный потенциал (MMP) был обнаружен с помощью флуоресцентного зонда JC-1 (Beyotime, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки из разных групп промывали PBS и инкубировали с раствором для окрашивания JC-1 в течение 20 мин при 37oC. После окрашивания клетки промывали дважды с помощью окрашивающего буфера. Затем флуоресцентные сигналы были обнаружены с помощью проточной цитометрии (BD Accuri C6).

Измерение митохондриального аденозина 5f-трифосфата

Концентрация аденозина 5/-трифосфата (АТФ) в митохондриях была обнаружена с помощью набора для анализа АТФ (Beyotime, Китай). Вкратце, культуральная среда клеток BV-2 из разных групп была выброшена, и клетки гомогенизировались с буфером лизиса на льду. Супернатант, полученный после центрифугирования (12 000 г,

5 мин) использовали для определения концентрации АТФ. Люминесценция была обнаружена EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Управление(Болезнь Альцгеймера)

Измерение уровня внутриклеточных активных форм кислорода

Для измерения уровня АФК использовался набор для анализа активных форм кислорода (АФК) (Бейотиме, Китай). Клетки из разных групп инкубировали с DCFH-DA (10 мкМ) в течение 20 мин при 37oC. После пробной нагрузки ячейки трижды промывались DMEM. Затем флуоресцентные сигналы были обнаружены с помощью проточной цитометрии (BD Accuri C6).

Просвечивающая электронная микроскопия

Клетки BV-2 были посеяны в блюдо из шести лунок. Среду удаляли и быстро добавляли в каждую лунку 1 мл 2,5% глутаральдегида. Затем клетки собирали и фиксировали новым 2,5% глутаровым альдегидом при 4oC в течение ночи. После фиксации, обезвоживания и встраивания клетки наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа HT7800 (Hitachi, Токио, Япония).

Анализ РНК-Seq и биоинформационных данных

Общая РНК из клеток BV-2 была извлечена с использованием реагента тризол (Vazyme Biotech, Китай). Все аналитические образцы были отправлены в Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) для анализа последовательности РНК. Данные были проанализированы на онлайн-платформе Majorbio Cloud Platform10. RSEM11 использовался для количественной оценки обилия генов. По сути, дифференциальное выражение Необработанные данные обрабатывались под управлением MassHunter Workstation Software версии B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, United States). Необработанные данные были предварительно обработаны платформой XCMS. Анализ главных компонентов (PCA) и частичный дискриминантный анализ наименьших квадратов (PLS-DA) нормализованного анализа проводили с использованием DESeq2/DEGseq/EdgeR со значением Q 0,05; DEG с | log2FC| > 1 и значение Q 0,05 (DESeq2 или EdgeR)/значение Q 0,001 (DEGseq) считались значительно отличающимися экспрессированными генами. Кроме того, был проведен анализ функционального обогащения, включая GO и KEGG, чтобы определить, какие DEG были значительно обогащены в терминах GO и путях при скорректированном Бонферрони p-значении 0,05 по сравнению с фоном всего транскриптома. Исходные данные последовательности были отправлены в базу данных NCBI Sequence Read Archive.

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

Общая РНК клеток BV-2 была собрана с использованием реагента изоляции RNA-easyTM (Vazyme Biotech, Китай), а реакция обратной транскрипции проводилась с помощью FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Китай). Реакции проводились по протоколу производителя. кДНК подвергали количественным анализам полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) со специфическими праймерами и TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Китай). Грунтовки перечислены в Дополнительной таблице 1 и β-актин использовался в качестве внутреннего контроля. Для количественного анализа использовался метод 2-А КТ.

Вестерн Блот Анализ

Клетки BV-2 были лизированы буфером лизиса RIPA (KeyGen Biotech Co., Ltd., Нанкин, Китай), содержащим 1% коктейль ингибитора протеазы (Thermo Fisher) для получения общего белка. Белки были разделены 10% SDS-PAGE и перенесены на мембраны NC. После блокирования 5% обезжиренным молоком / BSA мембраны инкубировали с антителами AMPKa (Proteintech), p-AMPKa (Affinity Biosciences), PGC-1a (Proteintech), NF-kB (Proteintech), p-NF-kB (ABclonal) или GAPDH (ABclonal) в 5% TBST при 4oC в течение ночи. Мембраны инкубировали со вторичным пероксидазо-конъюгированным антителом к хрену (ABclonal) при комнатной температуре в течение 1 ч. Для визуализации и количественного определения использовались высокоразмерная вестерн-блоттинговая подложка ECL (Танон, Китай), система визуализации Gel (Танон, Китай) и программное обеспечение ImageJ.

Молекулярная стыковка

Анализ молекулярной стыковки проводился с помощью программного обеспечения Autodock (версия 4.2). Сродство между ACT и белками наблюдалось программным обеспечением AutodockTools. Трехмерные (3D) белковые структуры AMPKa (PDB ID: 5g5j) и NF-kB (PDB ID: 4q3j) были извлечены из Банка белковых данных12.

Статистический анализ

Все данные выражаются как среднее стандартное отклонение и анализируются программным обеспечением GraphPad Prism (версия 8.0.1). Различия между группами были проанализированы с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым последовал множественный сравнительный тест Туки. p< 0.05="" was="" considered="" statistically="">

Добавка цистанча при болезни Альцгеймера

РЕЗУЛЬТАТЫ

ACT-AD нацелен на прогнозирование сети взаимодействия и путей

Благодаря объединению нескольких баз данных было получено 253 цели ACT, в то время как в общей сложности было собрано 1 697 целей, связанных с AD. После сопоставления целевой сети в общей сложности 70 целей были поглощены сетью взаимодействия целей ACT-AD (рисунок 1A). Анализ обогащения KEGG подразумевал, что ACT может иметь широкий спектр и множественный целевой эффект (рисунок 1B). Он также предположил, что ACT имеет несколько путей, целевых точек и элементов в AD.(Болезнь Альцгеймера)лечение. Классифицируйте эти пути, чтобы получить точную интерпретацию механизмов. ACT может в основном коррелировать с сигнальной трансдукцией, эндокринной системой, иммунной системой, а также ростом и гибелью клеток, чтобы играть конфронтационную роль против AD.(Болезнь Альцгеймера)(Рисунок 1С). Стоит отметить, что подавляющее большинство этих путей связано с воспалительной реакцией. Предполагается, что противовоспалительное действие ACT может быть неотъемлемой частью его конфронтационной роли против БА.(Болезнь Альцгеймера).

ACT облегчил дискинезию и улучшил функцию холинергической системы при БА(Болезнь Альцгеймера)Личинки рыбок данио

Чтобы проверить сетевую модель, AlCl3-индуцированная AD(Болезнь Альцгеймера)Модель у личинок рыбок данио была использована для демонстрации эффекта ACT. Наблюдалось движение личинок рыбок данио в рамках светло-темных циклов, и регистрировались их плавательные тропы (рисунок 1D). Результаты показали, что ACT эффективно увеличивал AS и AS рыбок данио, а синергетический эффект увеличивался с увеличением доз (рисунок 1E). DRR и RE обнаружили более интуитивное сравнение ACT и DPZ (рисунок 1F). Соответственно, ACT облегчал дискинезию, проявляя эффекты, аналогичные DPZ.

Общепризнано, что холинергическая система играет важную роль в процессах обучения и памяти. Таким образом, активность AChE и ChAT была использована для выявления эффекта ACT. Воздействие AlCl3 у рыбок данио было получено с холинергическим изменением мозга (рисунок 1G). Было показательно, что лечение ACT подавляло активность AChE. Кроме того, активность ХАТ проявляла снижение после лечения АКТ. Таким образом, ACT показал глубокое влияние на AlCl3-индуцированную AD.(Болезнь Альцгеймера)личинки рыбок данио.

ACT подавлял поляризацию M1 и способствовал поляризации M2 в клетках BV-2, индуцированных LPS

Для дальнейшего подтверждения сети противовоспалительное действие ACT изучали in vitro с использованием клеток микроглии BV-2. После лечения ЛПС в течение 24 ч жизнеспособность клеток BV-2 значительно снижалась. К счастью, ACT увеличил жизнеспособность клеток, индуцированных LPS-индуцированных BV-2 (рисунок 2A). Кроме того, наблюдалась морфология клеток BV-2. После 24 ч стимуляции LPS было показано, что клетки BV-2 подверглись поляризационному состоянию M1. Морфологические изменения были предотвращены совместным лечением ACT (рисунок 2B).

Более того, результаты показали, что, в отличие от клеток BV-2, стимулируемых LPS, клетки BV-2, совместно обработанные ACT, значительно подавляли экспрессии TNF-a, IL-1β и NO (рисунок 2C) в клеточном супернатанте. Это классические провоспалительные цитокины как индикаторы поляризации микроглии М1. Подобно результатам ИФА, результаты qPCR обнаружили, что TNF-a, синтаза оксида азота (iNOS),

Экспрессия IL-1β и CD86 мРНК были значительно ингибированы при лечении ACT по сравнению с группой LPS (рисунок 2D).

Кроме того, мы измерили уровень поляризации микроглии M2 с помощью ИФА (рисунок 2C) и qPCR (рисунок 2E), и результаты показали, что ACT значительно увеличил уровни экспрессии маркеров, связанных с микроглией M2 (IL-10, CD206, TGF-β и Arg-1). Одним словом, эти результаты показали, что ACT подавляет поляризацию микроглии M1 и способствует фенотипу M2.

Поляризация M1/M2, регулируемая ACT через ингибирование пути NF-kB

Транскриптомный анализ был выполнен RNA-seq для изучения механизма ACT в клетках BV-2 с общего уровня. PCA показал, что группы контроля, LPS и ACT могут быть хорошо различимы (рисунок 3A). Он выявил 899 дифференциально экспрессированных генов (DEG) между контрольной группой и группой LPS и 49 DEG между группой LPS и ACT.

группа (рисунок 3В). Последовательно анализ обогащения GO (рисунок 3C) и KEGG (рисунок 3D) показали, что эффект ACT был вовлечен в путь NF-kB. Набор генов, связанных с путем NF-kB, был дополнительно подтвержден, и их гомеостаз, безусловно, был затронут ЛПС. Как и ожидалось, ACT существенно повлиял на их выражения (рисунок 3E).

Путь NF-kB является классическим путем для регулирования прогрессирования воспаления, что в конечном итоге приводит к высвобождению провоспалительных факторов. Чтобы получить механистическую поддержку, ключевой белок пути NF-kB был оценен с помощью вестерн-блоттинга. Стимуляция ЛПС приводила к активации NF-kB, связанной с продвижением поляризации M1. В соответствии с анализом РНК-seq ACT ингибировал фосфорилирование NF-kB, стимулируемое LPS (рисунок 3F). Таким образом, ACT может облегчить поляризацию M1, вызванную LPS, через путь NF-kB в клетках BV-2.

ACT нарушает биосинтез аргинина, а также биосинтез пантотената и КоА

Сетевое предсказание ACT показало, что он был связан с метаболизмом аргинина (Arg) и пролина (рисунок 1B). RNA-seq продемонстрировал, что пути, затронутые ACT, также включали биосинтез Arg, а также биосинтез пантотената и CoA (рисунок 3D). Было высказано предположение, что нарушения метаболизма клеток BV-2, индуцированные стимуляцией LPS, связаны с поляризацией M1 (Orihuela et al., 2016). Таким образом

нецелевой клеточный метаболом методом ВЭЖХ-Q-TOF-MS был использован для выявления влияния ACT на клеточный метаболизм. PCA и PLS-DA (Рисунок 3G) показали, что контрольные, LPS и ACT группы могут быть хорошо различены на основе внутриклеточных метаболитов. Уровни различных метаболитов в lpS-индуцированных клетках BV-2 были изменены после лечения ACT (рисунок 3H). По сравнению с контрольной группой было обнаружено 11 метаболитов, которые значительно изменились в группе ЛПС (Дополнительная таблица 2), тогда как 14 метаболитов были отчетливо изменены после лечения ACT (Дополнительная таблица 3), включая 11 метаболических путей (Рисунок 3I). Эффект ACT в основном заключался в регулировании метаболизма аминокислот, нуклеотидного обмена, энергетического обмена и метаболизма кофакторов и витаминов. Интересно, что метаболические пути, полученные метаболомом, соответствовали сетевому прогнозированию и РНК-seq, включая биосинтез Arg, а также биосинтез пантотената и CoA. Вышесказанное показало, что ACT может регулировать биосинтез Arg, а также биосинтез пантотената и CoA в клетках BV-2, стимулируемых LPS.

Экстракт цистанче анти-Болезнь Альцгеймера

Pls нажмите здесь на Часть 2