Пинпинг Цзоу

Пинпинг Зуа, †, Юэлин Сунб, †, Вэй Лейя, Цзюнь Либ, Пэнфэй Туа, б,

Юн Цзян,⁎

Ключевая лаборатория натуральных и биомиметических препаратов ацетата, Школа фармацевтических наук, Пекинский университет, Пекин, 100191, Китай Центр современных исследований традиционной китайской медицины, Школа китайской медицины, Пекинский университет китайской медицины, Пекин, 100029, Китай

Поступила в редакцию 17 мая 2017 г.; пересмотрено 20 июня 2017 г.; принято 17 июля 2017 г.

Абстрактный: Цистанхе пустынная(CD) является одним из двух авторитетных заводов-источниковЦистанх Херба, известное лекарственное растение. В данном случае спектроскопия ЯМР 1Н использовалась для характеристики химического профиля и различения различных частей, а также для предложения нового рабочего процесса обработки ЦД. Отнесение сигнала было достигнуто с помощью нескольких методов одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии в сочетании с доступными базами данных и аутентичными соединениями. Верхние части растения отличали от нижних путем объединения набора данных спектроскопии ЯМР 1H с многомерным статистическим анализом. Было продемонстрировано, что новый метод обработки, в котором обработка паром сочетается с сушкой вымораживанием, превосходит обработку паром в сочетании с сушкой в ​​печи или прямую сушку вымораживанием с помощью целостной метаболической характеристики на основе 1H ЯМР. Фенилэтаноидные гликозиды, в основном эхинакозид иактеозид, были отобраны и подтверждены как химические маркеры, ответственные за демонстрацию превосходства нового рабочего процесса обработки, тогда как последовательные первичные метаболиты, особенно углеводы и метаболиты цикла трикарбоновых кислот, были обнаружены как первичные молекулы, управляющие различением между верхней и нижней частями растение. В совокупности 1H ЯМР-спектроскопия была продемонстрирована как универсальный аналитический инструмент для характеристики химического профиля и для руководства углубленным использованием CD, предоставляя исчерпывающую качественную и количественную информацию.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА:Цистанхепустыня; метаболомика на основе 1H ЯМР; Рабочий процесс обработки; Различные части;Фенилэтаноидный гликозид; Метаболиты цикла трикарбоновых кислот;Эхинакозид; актеозид

Для получения более подробной информации, пожалуйста, свяжитесь с:Joanna.jia@wecistanche.com

Цистанхе пустынная имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

1. Введение

Цистанх Херба(CH, китайское название: Roucongrong), первоначально заархивировано вКитайская Материа Медика Шэнь Нуна, широко известен как одно из самых известных съедобных тонизирующих и лекарственных растений и почитается как «женьшень пустынь».^1,2. Как одно из двух официальных растений-источников CH,Цистанхе пустынная(CD, Orobanchaceae) — голопаразитическое растение, в основном распространенное на севере и северо-западе Китая.^2,3. Он широко использовался для лечения почечной недостаточности, характеризующейся импотенцией, болями в пояснице и коленях, женским бесплодием и запорами, в традиционной китайской медицинской практике на протяжении веков.^3–5. Однако в последние годы дикие источники CD находятся на грани исчезновения из-за чрезмерного сбора урожая, и он был внесен в список растений класса II, нуждающихся в защите в Китае.¹. Кроме того, CD предлагает важный вклад в борьбу с пустыней. Поэтому очень важно, но сложно использовать этот растительный материал более эффективно.

Научные исследования поЦистанхезаводы, начатые в 1980-х годах⁶. Фитохимические исследования выявили существование различных химических типов,e.g., фенилэтаноидные гликозиды (PhG), иридоиды, лигнаны, жирные кислоты, альдиты и углеводы в пределах CD⁷. Среди них наиболее часто упоминаются PhG из-за их широкого спектра биологической активности, включая антиоксидантную, антивозрастную, антиусталостную, противовоспалительную, повышающую иммунитет организма, улучшающую обучение и память мышей с болезнью Альцгеймера и т. д.¹. В последнее время PhG привлекают все большее внимание как потенциальные кандидаты в новые лекарственные средства для лечения нейродегенеративных заболеваний. В частности, смесь всех PhG, обнаруженных в CH, была разработана как новый препарат, зарегистрированный как общий.Цистанхегликозидкапсула (Memoregain^®) для лечения сосудистой деменции⁸. Эхинакозид, наиболее распространенный и эффективный компонент всех PhG, оказывает антиапоптотическое действие на нейрональные клетки SHSY5Y после апоптоза, индуцированного TNF, и устраняет дефицит у мышей с болезнью Паркинсона.⁹. Более того, другое основное активное соединение, актеозид (также известный как вербаскозид), способно противодействовать апоптозу в нейронах.¹⁰для защиты от нейротоксичности в клетках PC12, индуцированной 1-метил-4-фенилпиридием или глутаматом¹¹, а также для улучшения дефицита памяти, вызванного скополамином².

Похожий наКордицепса такжеЖеньшень, компакт-диск был экстенсивно съеден и оценен как здоровая пища. Фактические и предполагаемые преимущества CD, вероятно, будут играть определяющую роль в цене необработанного лекарства. Учитывая большое количество неочищенных препаратов CD, ломтики более популярны на рынке. В целом, ферментативная инактивация и обезвоживание являются двумя ключевыми этапами обработки лекарственных срезов. Обычные методы сушки CD включают изоляцию, сушку в печи, соление и хранение в подвале. Однако продукты этих процессов обычно имеют некрасивый вид и низкое содержание ФГ, что препятствует широкому применению и потреблению ЦД. В 2007 году наша группа предложила новый метод обработки ЦД, который значительно сохранил содержание эхинакозида иактеозидв ломтиках¹⁴. Однако, поскольку продукты, полученные в результате этого процесса, по-прежнему имеют неприятный внешний вид, мы сейчас описываем методологию обработки для улучшения внешнего вида и дальнейшего сохранения содержания PhG в перерабатываемых материалах.

До сих пор для химического анализа CD применялись серийные аналитические инструменты, включая тонкослойную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в сочетании с различными детекторами, такими как детектор с диодной матрицей (DAD), испарительный детектор по рассеянию света (ELSD), детектор электронного захвата (ECD) и тандемный масс-спектрометр (MS/MS). PhG, в частности эхинакозид и актеозид, чаще всего используются в качестве маркеров качества.¹. Отпечаток пальца этого растительного лекарственного средства также был разработан с использованием ВЭЖХ-DAD и ВЭЖХ-DAD-MS/MS.^15,16. Тем не менее, оценка качества CD остается сложной задачей из-за его чрезвычайно сложного химического профиля. Вообще говоря, подходы, нацеленные на несколько аналитов, не могут дать целостного химического представления о сырых экстрактах, хотя можно получить обширную качественную и количественную информацию с помощью ЖХ-МС/МС. Кроме того, аналитические стратегии, связанные с ВЭЖХ, могут быть ограничены большим количеством растворителей, утомительной подготовкой проб и/или длительными процедурами. Таким образом, для оптимального химического анализа требуется новый аналитический инструмент, способный давать исчерпывающую информацию о пуле соединений. К счастью,¹Спектроскопия H ЯМР была точно продемонстрирована как привлекательный инструмент «все в одном», способный предложить не только набор качественных данных, но и количественную информацию для широкого спектра как первичных, так и вторичных метаболитов с простой подготовкой образца и быстрым получением.^17–20. До сих пор широкое применение¹Спектроскопия H ЯМР была запущена для одновременного определения, химического профилирования и метаболомики сложных матриц.

Хотя было проведено несколько исследований этого драгоценного растительного лекарственного средства, его глобальный химический профиль в значительной степени неизвестен. Поскольку CD является паразитическим растением, нижние части должны нести ответственность за передачу питательных веществ, в основном первичных метаболитов, от хозяина к верхним частям, тогда как активный энергетический обмен, такой как цветение, обычно происходит в верхних частях. Поэтому разумно предположить, что существуют различия в метаболоме разных частей. Поэтому в текущем исследовании мы стремимся 1) всесторонне охарактеризовать химический профиль CD с использованием¹спектроскопия H ЯМР в сочетании с различными двумерными (2D) ЯМР измерениями; 2) прояснить различия между верхней и нижней частями и 3) предложить новый рабочий процесс обработки через¹Метаболомическое исследование на основе H ЯМР. Ожидается, что полученные результаты дадут надежные рекомендации по дальнейшему использованию этого лекарственного растения лучшим образом, в частности, для использования различных частей и методов обработки.

2. Экспериментальный

2.1. Растительные материалы

Двенадцать партий свежих материалов (CD1–CD12, таблица S1, дополнительная информация) были собраны в автономных районах Внутренней Монголии, Синьцзяна и Нинся в Китае. Ботаническое происхождение всех сырых материалов было подтверждено как

Метаболомика на основе ЯМР 1HЦистанхе пустынная 649С. пустынныйодним из авторов, профессором Пэнфэй Ту. Все ваучеры хранятся в гербарии Центра современных исследований традиционной китайской медицины Пекинского университета (Пекин, Китай).

2.2. Химия и реагенты

Метанол-d4 (CD3OD, содержание дейтерия, 99,8 атомных процента D), дейтерированная вода (D2O, содержание дейтерия, 99,8 атомных процента D) и 3-триметилсилил натрия [2,2,3,3-d4 ] пропионат (TSP-d4) были получены от Cambridge Isotope Laboratories (Андовер, Массачусетс, США). Метанол марки «ч. д. а.» был приобретен в компании «Beijing Chemical Works» (Пекин, Китай).

Аутентичные соединения, в том числе эхинакозид, актеозид и маннит, были очищены от CD в нашей лаборатории ранее14, а сахароза, -галактоза и -глюкоза были поставлены Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Согласно анализам ВЭЖХ-УФ и 1H ЯМР, чистота всех эталонов превышает 98 процентов.

2.3. Базовые приготовления

Все сырые материалы (CD1–CD11), кроме CD12, разрезали на верхнюю часть (GU) и нижнюю часть (GD) посередине всех стеблей, и все части разрезали на тонкие ломтики (примерно 6- мм -толстый каждый). Затем все срезы CD1-CD12 последовательно обрабатывали паром в течение 1{35}} мин и сушили в печи при 6{{40}} градусах в течение 48 ч с получением образцов а-типа. Для некоторых выбранных образцов, включая CD1-GU, CD4-GU, CD4-GD, CD11-GD и CD12, чтобы получить два дополнительных набора обработанных образцов (образцы b- и c-типа). Подробные описания всех образцов приведены в Таблице S1. Перед экстракцией все обработанные ломтики измельчали ​​в порошок с помощью мельницы для образцов (модель YF102, Ruian Yongli Pharmacy Machinery, Китай) и просеивали через сито 80 меш. Затем измельченные растительные материалы были точно взвешены (приблизительно по 200 мг каждого) и экстрагированы 50-кратно 50-процентным водным раствором метанола (масса/объем) в ультразвуковой водяной бане (25 градусов) в течение 40 минут. Затем добавляли 50-процентный водный раствор метанола, чтобы компенсировать потерю массы во время экстракции. Каждый экстракт центрифугировали при 10 000×g при 10 градусах в течение 10 минут и фильтровали через мембрану 0,22 мкм. Затем аликвоты (2 мл) супернатанта выпаривали и дополнительно высушивали, используя вакуумную сушку при 30°С в течение 30 мин. Высушенные остатки каждого образца восстанавливали с использованием 0,5 мл смеси (1:1, по объему) CD3OD и фосфатного буфера в D2O, содержащей 0,05% TSP-d4 (pH 7,4), а затем раствор переносили в 5 мм (id) ЯМР-пробирка (Norell ST500-7) для анализа ЯМР. Каждый образец анализировали в трех повторностях.

2.4. ЯМР измерения

Все спектры ЯМР 1Н, ЯМР 13С и 2D ЯМР были записаны на спектрометре Varian Unity Plus 500 МГц (Varian Inc., Пало-Альто, Калифорния, США) при частоте протонов 499,91 МГц, оснащенном Криозонд TCI и система Z-градиентов. Идентичные параметры применяли как для экстрактов, так и для эталонных соединений, чтобы получить сопоставимые спектры. Для измерений 1H ЯМР было получено 256 сканов со следующими параметрами: ширина спектра 8012,6 Гц (16 м.д.); длительность импульса 11,05 мкс (угол поворота 90 градусов); время сбора данных 2,04 с; задержка релаксации (d1), 2 с; температура 298 К. Для фиксации частоты поля использовали CD3OD, а химические сдвиги всех спектров выравнивали по сигналу от TSP-d4 при δ 0,00. Влажная процедура была принята для подавления интенсивности сигнала H2O, который находился около δ 3,3021. Была применена экспоненциальная функция с коэффициентом расширения линии (LB) равным 0,3 Гц, и данные были заполнены нулями, чтобы получить по крайней мере пять точек данных выше полуширины для каждого резонанса, чтобы гарантировать точное и надежное интегрирование. Сигналы затухания свободной индукции (FID) были преобразованы Фурье (FT), и все спектры были вручную сфазированы и скорректированы с использованием автоматической полиномиальной базовой программы.

Чтобы помочь в химической характеристике и присвоении сигналов,

13C ЯМР и различные анализы 2D ЯМР, такие как 1H–1H

корреляционная спектроскопия (1H–1H COSY), спектроскопия гетероядерной одиночной квантовой когерентности (HSQC) и корреляционная спектроскопия множественных гетероядерных связей (HMBC) также были получены для репрезентативного образца (CD1-GUI) с использованием этих программ по умолчанию. Спектральная ширина для COSY составляла δ 0,5–10,0 в обоих измерениях и 128 приращений t1 для каждого t1. Шестнадцать переходных процессов с задержкой релаксации 1,00 с были добавлены к 822 комплексным данным.

Оптимальные односвязные и n-связные константы гетероядерного взаимодействия для HSQC и HMBC составляют 146 и 8 Гц соответственно. Диапазоны были установлены как –0.5–10.0 ppm в измерении F2 и 0–200 ppm в измерении F1 соответственно.

2.5. Многомерный статистический анализ набора данных ЯМР-спектроскопии

Спектры ЯМР 1Н обрабатывали с помощью программы MestReNova (версия 5.2.5, Mestrelab Research, Сантьяго-де-Компостелла, Испания). Каждый спектр масштабировался до общей интенсивности и сводился к интегрированным областям одинаковой ширины (0.02 м.д.) среди области δ 0,50–9,50 после исключения областей δ 4,70–

5.02 и δ 3,26–3,36, чтобы исключить остаточные сигналы воды и метанола соответственно. Анализ главных компонентов (PCA) с масштабированием Парето (Par), а также ортогональный частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (OPLS-DA) с масштабированием единичной дисперсии (UV) выполняли с помощью программного обеспечения SIMCA-P 12.0 (Umetrics, Умео, Швеция).

2.6. Одновременное определение эхинакозида и актеозида с помощью УФ-ВЭЖХ

Для перекрестной проверки результатов трех методов обработки использовалась система ВЭЖХ Agilent серии 1260, состоящая из дегазатора, четырехкомпонентного насоса, автоматического пробоотборника, колоночной печи и детектора с диодной матрицей (Agilent Technologies, Санта-Клара). , Калифорния, США) использовали для одновременного определения эхинакозида и актеозида во всех образцах а-, b- и с-типа. Колонка Agilent Zorbax SB-C18 (250 мм × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, Agilent Technologies), защищенная соответствующей защитной колонкой (10 мм × 4,6 мм, размер частиц 5 мкм), была выбрана для проведения хроматографического разделения. Протокол подготовки образцов, подвижная фаза и программа элюирования соответствовали описаниям, заархивированным в Китайской фармакопее (издание 2010 г.)3 с небольшими изменениями. Вкратце, ультразвуковую экстракцию проводили в течение 30 минут с использованием 50-процентного водного метанола; В качестве подвижной фазы для изократической элюции использовали 30-процентный водный раствор метанола при скорости потока 1,0 мл/мин, а термостат колонки поддерживали при

30 градусов. Длина волны обнаружения была установлена ​​на 330 нм, а объем инъекции был установлен на 10 мкл.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Оптимизация экстракционных и спектроскопических параметров

Чтобы получить высококачественные спектры ЯМР 1H для всех образцов, различные параметры были тщательно оптимизированы с использованием репрезентативного образца (CD1-GUI). Во-первых, экстракционный растворитель был выбран из 30-процентного водного метанола, 50-процентного водного метанола и метанола. Результаты показали, что 50-процентный водный раствор метанола давал больший общий ответ по сравнению с двумя другими, что хорошо согласуется с протоколом экстракции, аутентифицированным в Китайской фармакопее (издание 2015 г.)3. Экстракция с использованием ультразвука была выбрана из-за ее удобной работы с выходами, сравнимыми с экстракцией с обратным холодильником и экстракцией по Сокслету (данные не показаны). После этого продолжительность воздействия ультразвука сравнивалась между 40 и 60 минутами, и 60-минутное ультразвуковое купание в воде не показало большей эффективности экстракции, чем 40-минутное; следовательно, для экономии времени для ультразвукового аппарата было установлено 40 минут.

С другой стороны, {{0}},5 мл CD3OD-фосфатного буфера в D2O (1:1, pH 7,4) сравнивали с 0,5 мл CD3OD-D2O (1: 1), и результаты показали, что обогащение фосфатным буфером может предотвратить изменение и миграцию спектрального профиля. Аликвоту экстракта объемом 2,0 мл последовательно концентрировали, восстанавливали и подвергали ЯМР-анализу, чтобы получить соответствующий ответ для большинства сигналов. Кроме того, было замечено, что мокрый метод лучше, чем программа предварительного насыщения, для снижения пиковой интенсивности остаточной воды (около δ 4,8) в спектре. Мы также обнаружили, что приращение числа сканирований было полезным для улучшения отношения сигнал-шум (S/N), что весьма полезно для чувствительного обнаружения (в частности, для следов компонентов). Однако, поскольку этот подход мешал быстрому измерению, для достижения приемлемой чувствительности в конечном итоге применяли 256 сканирований для каждого анализа 1H ЯМР.

3.2. Отнесение сигналов спектра ЯМР 1H

Идентификацию химических компонентов в КД осуществляли совместным анализом спектров ЯМР 1Н, ЯМР 13С и 2D ЯМР (рис. 1 и дополнительная информация, рис. S1–S10) и сравнением с образцами аутентичных соединений, а также обращением к доступным базы данных, такие как MMCD. Вероятные отнесения сигналов в 1H ЯМР приведены на рис. 1. Значения химического сдвига для предполагаемых тождеств приведены в таблице S2 (дополнительная информация).

Структурные характеристики PhG рода Cistanche описаны в литературе1. Из-за большого структурного сходства среди PhG, например, эхинакозида по сравнению с актеозидом, сигналы протонов фенилэтаноидных фрагментов сильно перекрывают друг друга в спектре 1H ЯМР. Это перекрытие создало сложную аналитическую проблему для надежного различения этих сигналов. В текущем исследовании сигналы, принадлежащие эхинакозиду и актеозиду, которые являются основными ингредиентами исходного растения, были однозначно отнесены с помощью эталонных соединений и различных спектров ЯМР (таблица S2, рис. 1 и рис. S1–S6). Диагностический сигнал при δ 7,73 (д, J 16,0 Гц) указывал на распределение Кастано-

сторона B/D или другие ферулоилзамещенные PhG (таблица S2 и рис. 1)22. Кроме того, PhG цис-типа (цис-тип кумароил или кофеилзамещенные PhG) также наблюдались в экстракте на основании наличия δ 6,95 (d, J 12,0 Гц) в спектре (таблица S2 и рис. 1).

Несколько очевидных сигналов были обнаружены в области δ 8.0–9.5. Сигналы при δ 9,15, 8,88 и 8,09 были предварительно отнесены к никотинамиду (таблица S2 и рис. 1), а 13C ЯМР, а также 2D

Спектры ЯМР (рис. S4–S6) также подтверждают это отнесение. Сигнал при δ 8,48 был правдоподобно отнесен к муравьиной кислоте, тогда как сигналы при δ 8,13 и 8,11 были получены от аденозина и аденина соответственно (таблица S2 и рис. 1). Сигналы углеводов обычно располагаются в области между δ 3,00 и 5,50. Очевидно, сахароза была наиболее распространенным дисахаридом в CD, демонстрируя значительные резонансы при δ 4,04, 4,18 и 5,41 (таблица S2 и рис. 1 и S7). Очевидные сигналы, принадлежащие аномерным протонам -галактозы, -глюкозы и -глюкозы, резонировали при δ 5,24, 5,20 и 4,60 соответственно (таблица S2, рис. 1 и S8, S9). Присутствие маннита было обнаружено по наблюдению за сигналом при δ 4,00, а также по сравнению с эталонным соединением (таблица S2, рис. 1 и S10). Диагностический сигнал 1-O-этилглюкозида наблюдали при 1,16 м.д. по HMDB. Аминокислоты, в том числе лейцин (0,93 м.д.), изолейцин/валин (0,98 м.д.), треонин (1,27 м.д.), аланин (1,49 м.д.), лизин (1,71 м.д.), глутамин (2,30 м.д.), аспарагиновая кислота (2,96 м.д.), пролин (4,09 частей на миллион), тирозин (7,12 частей на миллион) и фенилаланин (7,33 частей на миллион) были предварительно назначены путем сравнения их соответствующих диагностических спектроскопических характеристик с данными, заархивированными в HMDB (таблица S2 и рис. 1). Иридоиды и лигнаны были упомянуты выше как важные химические гомологи CD. В репрезентативном спектре 1 H ЯМР (рис. 1) сигналы сирингарезинола (производное лигнана) и 8-эпилогановой кислоты (производное иридоида) наблюдались при δ 7,02 и 0,98 соответственно. Более того, мультиплетные сигналы в диапазоне δ 6,56–6,64 можно условно отнести к цитрусовым А, аласканиозиду А или глюкозиду дегидеодикониферилового спирта (все производные лигнана), в то время как сигналы в диапазоне δ 6,18–6,33 также могут генерироваться иридоидами (таблица S2 и Рисунок 1). Более того, присутствие в ЦД некоторых алифатических карбоновых кислот, в том числе фумаровой, малеиновой, яблочной, изолимонной, лимонной, кетоглутаровой, пировиноградной, янтарной, уксусной и других жирных кислот, было предварительно охарактеризовано наблюдение диагностических сигналов при δ 6,54, 6,02, 4,27, 3,04, 2,73, 2,52, 2,49, 2,42, 1,97 и 1,33 последовательно (таблица S2 и рис. 1). Кроме того, некоторые сигналы, такие как мультиплетный сигнал около 3,80 м.д. и синглетный сигнал при 1,97 м.д.22, рассматривались как характеристики метокси- и ацетильной групп соответственно (таблица S2 и рис. 1), которые являются обычными заместителями фенильных производных. , особенно PhG в данном случае. Между тем сигнал при 1,06 м.д. можно условно отнести к остатку рамнозы. Хорошо известно, что спектроскопия 1 H ЯМР может предоставить прямую количественную информацию, поскольку интенсивность сигнала протона пропорциональна молярной концентрации аналита19. Следовательно, предварительное количественное сравнение может быть выполнено для ингредиентов CD. Очевидно, что углеводы, в частности сахароза, давали самые высокие ответы в репрезентативном спектре (рис. 1). Как голопаразитическое растение, которое растет под землей в течение почти всего жизненного цикла, фотосинтез не нужен и недоступен для CD; поэтому неудивительно, что в спектре не было обнаружено первичных метаболитов, участвующих в фотосинтезе, таких как участник цикла Кельвина (также известного как цикл С3)23. Напротив, было обнаружено множество молекул, участвующих в цикле трикарбоновых кислот (цикл трикарбоновых кислот, также известный как цикл лимонной кислоты и цикл Кребса), таких как лимонная кислота, кетоглутаровая кислота, пировиноградная кислота и янтарная кислота, что указывает на то, что активная центральная углеродный обмен (УУМ) происходит в исходном растении. С другой стороны, PhG наблюдались как доминирующее химическое семейство среди различных вторичных метаболитов, в то время как лигнаны и иридоиды лишь вносили незначительный вклад во весь спектральный профиль.

3.3. Прецизионный анализ спектроскопии ЯМР 1H

Спектроскопическая точность играет ключевую роль в надежности метаболомных характеристик. В текущем исследовании точность всей методологии оценивалась путем подготовки репрезентативной выборки (CD{0}}GUI) в пяти экземплярах и последующего ее анализа в течение двух дней подряд. Полученные спектры продемонстрировали большое общее сходство за счет наложения всех спектров, что позволяет предположить, что протокол подготовки образца и измерение 1H ЯМР были воспроизводимы, и образец мог оставаться стабильным по крайней мере в течение двух дней.

3.4. Различение верхней и нижней частей растения

До сих пор не было доказательств того, что верхние части CD эквивалентны нижним частям в отношении химического профиля и фармакологических свойств. Чтобы выяснить, происходит ли накопление первичных или вторичных метаболитов в определенных частях CD, целые сочные стебли разрезали на верхнюю и нижнюю части, обе из которых впоследствии обрабатывались, экстрагировались и измерялись с помощью спектроскопии 1 H ЯМР. На рис. 2 представлены репрезентативные спектры обеих частей. В целом, большинство сигналов в нижних частях были выше, чем в верхних частях. В диапазоне δ 6.0–9.5 ни в одном из участков не удалось обнаружить ни одного уникального сигнала; однако общая интенсивность этих сигналов в нижних частях была немного выше, чем в верхних частях, что позволяет предположить, что ароматические производные могут быть обогащены в области вблизи паразитной точки23. Нижние части также были богаты жирными кислотами, некоторыми аминокислотами и некоторыми другими веществами, накапливающими энергию, из-за общего отклика сигнала алифатической области (δ 0,5–3,{{10}. }) в нижних отделах была выше, чем в верхних. Более того, некоторые очевидные различия можно было наблюдать в пределах сахарной области (δ 3.0–5.0), и большинство сигналов располагалось в диапазоне δ 3.0– 5.0 для верхних частей были выше, чем для нижних, что указывает на то, что углеводы, известные олигосахариды, могут накапливаться в верхних частях. Чтобы выделить различия между верхними и нижними частями, а также определить основных участников, ответственных за их различение, для обработки набора спектроскопических данных различных частей был применен многомерный анализ данных. Неконтролируемый подход, называемый PCA, который использует информацию только из одной матрицы, первоначально применялся для классификации всех образцов в соответствии с характеристическими спектрами 1 H ЯМР. Однако для этих двух разных частей произошло обширное перекрытие (данные не показаны). После этого был запущен контролируемый подход OPLS-DA, чтобы усилить разделение между различными группами, а также понять переменные, несущие информацию о разделении классов. OPLS-DA добился хорошего разделения различных частей компакт-диска. На рис. 3A и B показаны график оценки и S-график OPLS-DA соответственно. Как общее качество соответствия (R2Y={{30}},910), так и общий коэффициент перекрестной проверки (Q2Y=0,981) были близки к 1,0. Таким образом, исходная модель разделения была статистически достоверной с высокой предсказуемостью. Очевидно, что верхние части можно было отличить от нижних, когда образцы были помечены двумя группами, а S-график давал сигналы, которые потенциально способствовали дифференциации. В целом, больше точек было распределено в области, соответствующей нижним частям S-графика, где было распределено более высокое содержание жирных кислот (δ 1,32–1,35) и факторов цикла трикарбоновых кислот (таких как янтарная кислота при δ 2,42); однако верхняя часть (правый кластер на рис. 3А) была богата некоторыми углеводами (в основном δ 3,70–4,10, рис. 3Б). Потенциальные биомаркеры, представленные на S-графике, строго согласовывались со сравнением спектров двух частей при прямом наблюдении и наложении. Хорошо известно, что метаболиты синтезируются специфическими для тканей, органов и развития путями с помощью специфических ферментов биосинтеза, а затем сохраняются, иногда в больших количествах, в продуцирующих доменах, что соответствует их разнообразным функциям для всего растения. Например, как типы, так и содержание гинсенозидов демонстрируют значительные различия среди корневищ, корней, листьев и последователей Panax notoginseng24. Что касается CD, с качественной точки зрения профили вторичных метаболитов показали высокое сходство между верхними и нижними частями. Поскольку нижние части всего растения играют роль переносчика питательных веществ, большинство из которых представляют собой первичные метаболиты, например углеводы, от хозяина, Haloxylon ammodendron к местам активного метаболизма указывает на то, что более обильные первичные метаболиты должны происходить в нижние части. Кроме того, в верхних частях должен широко происходить экстенсивный гидролиз полисахаридов до олигосахаридов, а затем до моносахаридов, которые могут быть в конечном итоге биотрансформированы в некоторые алифатические карбоновые кислоты. Поскольку в этом исследовании для экстракции использовался 50-процентный водный раствор метанола, и он был способен экстрагировать гидрофильные низкомолекулярные соединения вместо макромолекул (например, полисахариды), неудивительно, что накопление факторов цикла ТСА и жирных кислот было продемонстрировано в более низких концентрациях. части. Однако было обнаружено, что некоторые олигосахариды, продукты гидролиза полисахаридов, обогащены верхними частями. С другой стороны, незначительные различия наблюдались для PhG между разными частями с количественной точки зрения, и в целом небольшое накопление PhG наблюдалось в нижних частях23,25. Сообщалось, что флоэма гаусториума, вероятно, является вторичным синтетическим органом для PhG в CD23; следовательно, нижние части, близкие к паразитной точке, должны быть богаты ФГ.

3.5. Предложение нового метода обработки компакт-дисков

Очевидно, что лекарственные ломтики, принадлежащие образцам с-типа, были лучше с точки зрения хорошего внешнего вида, не совсем белого цвета, светлой и хрустящей текстуры. На рис. 4 показаны репрезентативные спектры 1 H ЯМР для этих трех типов образцов. Однако после параллельных измерений для этих обработанных лекарственных срезов были получены разные спектральные профили. При непосредственном наблюдении и наложении можно было наблюдать очевидные различия. Во-первых, в области ? значительно выше, чем у двух других типов. Во-вторых, ответы большинства участников, принимавших углеводы и ТСА, в образцах b-типа (рис. 4B) были почти эквивалентны таковым в образцах c-типа (рис. 4C), но намного выше, чем в образцах a-типа (рис. 4A). . В-третьих, содержание глюкозы (δ 5,20 для -глюкозы и δ 4,60 для -глюкозы) в образцах b-типа (рис. 4B) было несколько выше, чем в образцах c-типа (рис. 4C). Наконец, в образцах а- и с-типа было обнаружено больше жирных кислот, чем в образцах б-типа (рис. 4). Прежде всего, в образцах, обработанных новым методом (образцы с-типа), в сравнении с образцами а- и б- типовые образцы. Кроме того, в образцах с-типа также были обнаружены обильные первичные метаболиты, такие как углеводы, участники ТСА и жирные кислоты. Впоследствии было проведено сравнение всех образцов с помощью многовариантного анализа данных с целью выявить сходства, а также различия между этими тремя типами лекарственных ломтиков. PCA с Par-масштабированием и OPLS-DA с UV-масштабированием последовательно выполняли для обработки набора данных ЯМР-спектроскопии (данные не показаны). Значительное разделение не было достигнуто с использованием PCA; однако графики показателей OPLS-DA для этих трех групп (зеленые, синие и красные точки на рис. 5А) показали четкую классификацию, указывающую на то, что эти три группы образцов значительно различались в отношении их метаболических профилей.

разложение PhG, инициированное либо ферментами в исходном растении, либо высокотемпературным хранением. Как следствие, обработанные срезы (образцы с-типа) с использованием нового метода имели преимущества как по приятному внешнему виду, так и по более высокому содержанию эффективных соединений. Для перекрестной проверки результатов, упомянутых выше для трех методов обработки, был использован метод ВЭЖХ-УФ, который был хорошо разработан и аутентифицирован в Китайской фармакопее (издание 2015 г.)3 для одновременного определения содержания эхинакозида и актеозида, которые играли важную роль в различают вышеперечисленные три вида продуктов переработки. Среднее содержание эхинакозида в образцах а-, б- и с-типа составило 8,33, 4,10 и 16,19 мг/г соответственно, а содержание актеозида — 1,57, 1,14 и 3,66 мг/г соответственно. Очевидно, содержание ФГ в материалах с-типа было в 2–4 раза выше, чем в образцах а- и b-типа, что хорошо согласуется с результатами метаболомики по данным ЯМР 1Н. Среди доступных аналитических методов, обычно используемых в метаболомных исследованиях, методы, основанные на ЯМР и МС, обычно считаются благоприятными альтернативами. Спектроскопия ЯМР, в частности 1 H ЯМР, обладает непревзойденными преимуществами по сравнению с другими методами, такими как неселективность, удобство пробоподготовки и простота одновременного обнаружения различных групп метаболитов за относительно короткое время измерения. До сих пор метаболомика на основе 1 H ЯМР использовалась для аутентификации растений17, для сравнения аналогов трав18, для дифференциации среды обитания26 и для характеристики деградации трав26. Здесь 1 H ЯМР был применен для различения различных частей CD, а также для предложения нового рабочего процесса, указывающего на то, что спектроскопия 1 H ЯМР является гибким и надежным аналитическим инструментом, предлагающим содержательные рекомендации для использования CD, а также некоторые другие растительные лекарственные средства, предоставляя исчерпывающую качественную и количественную информацию о сложных матрицах экстрактов.