Часть 1 Химическая и генетическая дискриминация Cistanches Herba на основе UPLC-QTOF/MS и ДНК-штрихкодирования

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Абстрактный

Цистанх Херба(Rou Cong Rong), известный как «Женьшень пустыни», оказывает поразительное целебное действие на силу и питание, особенно в укреплении почек для усиления Ян. Однако два растительных происхождения Cistanches Herba, Cistanche Deserticola и Cistanche tubulosa, различаются по фармакологическому действию и химическим компонентам. Чтобы различить растительное происхождение Cistanches Herba, в этом исследовании впервые была использована комбинированная система химических и генетических методов - технология UPLC-QTOF / MS и штрих-кодирование ДНК. Результаты показали, что три потенциальных маркерных соединения (изомер кампнеозида II, цистанозида С и цистанозида А) были получены для различения двух источников с помощью анализов PCA и OPLS-DA. Штрих-кодирование ДНК позволило точно различать два происхождения. Дерево Нью-Джерси показало, что два происхождения сгруппированы в две клады. Наши результаты показывают, что два происхождения Cistanches Herba обладают разным химическим составом и генетическими вариациями. Это первая зарегистрированная оценка двух источников Cistanches Herba, и это открытие облегчит контроль качества и его клиническое применение.

Цистанхе Херба

Введение

Цистанх Херба(Rou Cong Rong), известный как «женьшень пустыни», получают из высушенных сочных стеблейЦистанхе пустыннаяYC Ма иЦистанхе трубчатая(Шренк) Парик в соответствии с Китайской фармакопеей (издание 2010 г.) популярен за тонизирующий инь почек, благотворное влияние на жизненную сущность и расслабление кишечника. В настоящее время,Цистанх Хербав основном распространен в засушливых и теплых пустынях на северо-западе Китая, особенно в провинциях Синьцзян и Внутренняя Монголия. Однако два источникаЦистанх Хербаразличаются по фармакологической активности и химическим компонентам. Ту и др. исследовал отвар трех видов цистанхе (С. пустынный, С. тубулоза, Цистанче сальса) и обнаружил, чтоС. тубулозапоказал наименьший эффект в модели мышей с дефицитом Янга [1]. Чжан и др. сравнивали фармакологическую активность междуС. пустынный, С. тубулоза,а такжеС. сальса,и обнаружили, что эти виды обладают лечебными функциями, такими как снижение усталости и толерантность к гипоксии, но не в одинаковой степени [2]. Предыдущие исследования сообщали о химическом компоненте и указывали на разницу в химическом компоненте и содержании для растений растительного происхождения.Цистанх Херба[3]. Что касается клинического применения и обращения на рынке, в качестве тонизирующего средства,С. тубулозатрадиционно использовался в качестве средства, улучшающего кровообращение, а также при лечении импотенции, бесплодия, люмбаго, слабости тела в Японии [4–8]. Следовательно, очень важно различать два источникаЦистанх Хербадля контроля качества и клинического применения. Тем не менее, нет исследований, направленных на различение двух источников происхождения.Цистанх Херба. Многие исследованные методы, в том числе микроскопия, ультрафиолетовое и инфракрасное обнаружение, метод повторов между простыми последовательностями, использовались для идентификации рода.Цистанхи, но не только для двух начал особенно [9–20]. Здесь мы совместно использовали химические и молекулярные методы, чтобы различить два происхождения Cistanches Herba, UPLC QTOF/MS (ультраэффективная жидкостная хроматография в сочетании с квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрией) и штрих-кодирование ДНК. UPLC-QTOF/MS предоставляет информацию быстрее и эффективнее по сравнению с другими методами. Высокая селективность и чувствительность UPLC-QTOF/MS обусловили его применение как для количественного, так и для качественного анализа, а также для анализа метаболитов и идентификации комплексных соединений в традиционной китайской медицине [21–22]. Анализ главных компонентов (PCA) и ортогональная проекция на дискриминантный анализ скрытой структуры (OPLSDA) также разработаны для идентификации потенциальных маркерных соединений. Штрих-кодирование ДНК, более простая и универсальная технология молекулярных маркеров, использует фрагмент ДНК для идентификации видов или родов. Он объективен, более точен и проще в выполнении, чем традиционные методы идентификации и другие технологии молекулярных маркеров. Более того, ДНК-штрихкодирование успешно применяется для идентификации животных и растений, в том числе лекарственных растений [23–26]. Целью данного исследования является создание системы научных методов, сочетающих UPLC-QTOF/MS и штрих-кодирование ДНК, для различения двух растительных источников происхождения.Цистанх Херба.

Цистанхи цельные корни

Материалы и методы

Заявление об этике Мы подтверждаем, что в полевых исследованиях не участвовали исчезающие или охраняемые виды. GPS-координаты были включены в образец информации, см. таблицу 1».

Растительные материалы и реагенты

Сочные стебли Cistanches Herba были собраны в диких пустынных районах Внутренней Монголии, провинции Цинхай, Синьцзян-Уйгурского автономного района Китайской Народной Республики (таблица 1) в мае 2012 г. Все образцы для исследования были собраны в диких пустынных районах, а не в на частной земле, где не требовалось никаких специальных разрешений. Ботаническая идентичность стеблей была подтверждена доктором Линьфан Хуан. Ваучерные образцы были депонированы в Институте развития лекарственных растений. Для анализа ВЭЖХ использовали ацетонитрил класса высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Merck KGaA, Дармштадт, Германия) и муравьиную кислоту (Tedia, США). Деионизированную воду очищали с использованием системы Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Все остальные химические вещества были аналитической чистоты.

Базовые приготовления

Образцы Cistanches Herba (1,0 г, 65-меш) переносили в коническую колбу 50- мл и добавляли 50 мл 70-процентного метанола. После замачивания в течение 30 минут проводили обработку ультразвуком (35 кГц) при комнатной температуре в течение 30 минут. После центрифугирования при 10 000 об/мин в течение 10 мин супернатант хранили при 4 uC и фильтровали через 0,22- мм мембрану перед введением в систему UPLC-QTOF/MS для анализа.

UPLC-QTOF/МС

Для анализа UPLC использовались следующие системы/параметры: система Waters Acquity (Waters), оснащенная бинарным насосом для подачи растворителя, автоматическим пробоотборником и детектором PDA, подключенным к станции данных Waters Empower 2; ультразвуковая обработка (25{12}} Вт, 50 кГц, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Чжэцзян, Китай); и модель электронных аналитических весов AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Zurich, Switzerland). Использовали колонку Waters Acquity UPLC BEH C18 (1,7 мм, 2,161{42}}0 мм, Waters) и защитную колонку Waters C18 (тот же материал, вода) и поддерживали температуру 30 мкС. Подвижная фаза представляла собой 0,1% водный раствор муравьиной кислоты (А) и ацетонитрил (В) со следующей программой градиента: 0–3 мин, 10–22% В; 3–4 мин, 22–23% В; 4–6 мин, 23–35% В; 6–8 мин, 35–37% В; 8–11 мин, 37–42% В; 11–12 мин, 42–48% В; 12–15 мин, 48–50% В при скорости потока 0,3 мл/мин. Объем инъекции составлял 5 мл.

Анализ UPLC/MS проводили на системе QTOF Synapt G2 HDMS (Waters, Manchester, UK), оснащенной источником ионизации электрораспылением (ESI), работающим в режиме отрицательных ионов. В качестве десольватирующего газа использовали N2. Температура десольватации была установлена ​​на уровне 45{{1{0}}}uC при скорости потока 800 л/ч, а температура источника была установлена ​​на уровне 120uC. Капиллярное и конусное напряжения были установлены на 2500 и 40 В соответственно. Данные были собраны в диапазоне от 50 до 1200 Да с временем сканирования 0,1- с и задержкой между сканированиями 0,01- с в течение времени анализа 15- мин. В качестве газа для столкновения использовали аргон при давлении 7,06661023 Па. Все данные МС были собраны с использованием системы LockSpray для обеспечения точности и воспроизводимости массы. [MH]-ион лейцин-энкефалина с m/z 554,2615 использовали в качестве фиксирующей массы в отрицательном режиме ESI.

Анализ данных

Данные UPLC-QTOF/MS для образцов Cistanches Herba были проанализированы для выявления потенциальных дискриминантных переменных. Поиск пиков, выравнивание и фильтрацию необработанных данных ЭС проводили с помощью менеджера приложений Marker Lynx, версия 4.1 (Waters, Man Chester, UK). Использовались следующие параметры: время удерживания (tR) 0–15 мин, масса 50–1200 Да, допуск по времени удерживания 0,02 мин и допуск по массе. 0,02 Да. Были использованы три повторных образца, собранных в каждом географическом месте (n=3). Всего для создания модели использовалось 6 339 переменных.

Штрих-кодирование ДНК: выделение ДНК, ПЦР-амплификация и секвенирование

Образцы, взятые из высушенных мясистых стеблей C. Deserticola и C. Tubulosa (30 мг), растирали в течение 2 мин с частотой 30 р/с. ДНК экстрагировали в соответствии с инструкциями производителя (Tiangen). В частности, протокол был изменен таким образом, что хлороформ был заменен смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1 в том же объеме) и буферный раствор GP2 с изопропанолом (в том же объеме). Растертый порошок помещали в пробирки Эппендорфа на 1,5 мл, добавляли 700 мл предварительно нагретого до 65 мкС GP1 и 1 мл β-меркаптоэтанола, перемешивали на вортексе в течение 10–20 с и инкубировали в течение 60 минут при 65 мкС; Добавляют 700 мл смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин (134006 г); Перенесите супернатант в новую пробирку, добавив 700 мл изопропанола, перемешивая в течение 15–20 минут; Всю смесь перекачивают в спин-колонку CB3 и центрифугируют в течение 40 с при 12000 об/мин; Отбрасывая фильтрат и добавляя 500 мл ГД (добавляя количественный безводный этанол перед использованием), центрифугировать при 12000 об/мин в течение 40 с; удаление фильтрата и добавление 700 мл PW (добавление количества безводного этанола перед использованием) для промывки мембраны, центрифугирование в течение 40 с при 12000 об/мин; Отбрасывая фильтрат и добавляя 500 мл PW, центрифугировать в течение 40 с при 12000 об/мин; Фильтрат сливают и центрифугируют в течение 2 минут при 12000 об/мин для удаления остаточного промывочного буфера PW; Перенос спин-колонки СВ3 в чистую пробирку Эппендорф на 1,5 мл и сушка при комнатной температуре в течение 3–5 минут; Центрифугировать в течение 2 минут при 12000 об/мин для получения общей ДНК. Праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР) были основаны на последовательностях, о которых сообщалось ранее [4,5]. Реакционные смеси для ПЦР содержали 2-мл матрицы ДНК, 8,5- мл ddH2O, 12,5-мл 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Китай), 1/{{57 }}мл прямого/обратного (F/R) праймера (2,5 мМ) в конечном объеме 25 мл. Амплификацию ПЦР проводили, как описано Kress et al. [4]. Праймером реакции ПЦР были передний PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) и rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). Продукты ПЦР разделяли и детектировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Продукты ПЦР очищали в соответствии с протоколом производителя и непосредственно подвергали секвенированию.

Основное эффективное соединение цистанхе: Актеозид

Полученные результаты

Предварительное отнесение пиков с помощью UPLC-QTOF/MS Репрезентативные хроматограммы C. Deserticola и C. Tubulosa из разных районов выращивания показаны на рисунке 1. Хроматограмма отпечатков пальцев показала сходство между образцами Cistanches Herba. Всего было обнаружено 23 квалифицированных масс-пика, а 16 пиков были идентифицированы путем сопоставления времени удерживания и масс-спектров с теми, о которых сообщалось ранее (таблица 2) [29–35]. Пики 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 и 23 были предварительно идентифицированы как цистанозид F, мусаенозидная кислота, цистанбулозид C1/C2, камнеозид II. , изомер кампнеозида II, эхинакозида, цистанозида А, актеозида, изоактеозида, сирингалида А, -39-аль-рамнопиранозида, цистанозида С, 29-ацетилактеозида, османтусида В, цистанозида D, тубулозида В и цистанциненсида А соответственно. . Было определено, что химические составляющие представляют собой в основном фенилэтаноидные гликозиды (PhG), в то время как одно соединение, муссенозидная кислота, представляет собой иридоидный полисахарид. PhG являются основными активными соединениями с точки зрения лечения почечной недостаточности, антиоксидантного и нейропротекторного действия [36].

PCA C. Deserticola и C. Tubulosa

PCA использовали для различения образцов разных видов растений. PCA — это неконтролируемый многомерный метод анализа данных, целью которого является визуализация сходств и/или различий в многомерных данных о составе вторичных метаболитов [37]. На двухкомпонентную модель PCA в совокупности приходилось 46,04 процента вариации (PC1, 36,43 процента; PC2, 9,61 процента). На рисунке 2 показано, что 24 образца были сгруппированы в две группы в баллах PCA, построенных в соответствии с видовым происхождением, что указывает на то, что химический состав C. Deserticola и C. Tubulosa значительно различался.

Основное эффективное соединение цистанхе: Эхинакозид