ЧАСТЬ 1 Полисахарид Cistanche Deserticola ингибирует OVX-индуцированную потерю костной массы у мышей и RANKL-индуцированный остеокластогенез

1. Введение

Остеопороз — заболевание, характеризующееся снижением костной массы, аномальной микроструктурой костной ткани, повышенной ломкостью костей и переломами (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006) — в настоящее время поражает более 200 миллионов человек во всем мире и представляет значительную медицинскую и социально-экономическая нагрузка на современное общество (Strom et al., 2011). Клиническое лечение остеопороза в основном сосредоточено на заместительной гормональной терапии, терапии бисфосфонатами или деносумабом. Эти методы эффективны, но имеют долгосрочные побочные эффекты, такие как потенциальный риск рака молочной железы и атипичных переломов бедренной кости (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof-Bauer, 2011). Следовательно, существует острая необходимость в изучении препаратов, которые могут не только ингибироватьостеопорозно также обладают меньшим количеством нежелательных побочных эффектов.

Цистанхе пустынная(CD), тонизирующее и лекарственное средство, широко используемое в Китае, известное как «пустынный женьшень», представляет собой высушенный сочный стебель с чешуйчатым листомС. пустынныйYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) и имеет разнообразные и эффективныефармакологическийвиды деятельности, такие как иммунная регуляция, антиоксидантная и анти-остеопорозсвойств (Ху и др., 2020; Ли и др., 2012; Чжан и др., 2014). Предыдущие исследования активных веществ CD при лечении остеопороза в основном были сосредоточены нафенилэтаноидгликозиды(Ли, Цзян и Гу, 2018 г.; Сюй, Чжан, Ван, Яо и Ма, 2017 г.). Однако ЦД также содержит другие эффективные компоненты, такие как иридоиды, лигнаны,полисахариды(Ван, Чжан и Се, 2012 г.). Клиническое применение традиционной китайской медицины (ТКМ) в основном заключается в приготовлении отваров из воды.Полисахаридыявляются водорастворимыми компонентами и, скорее всего, являются основными фармакодинамическими компонентами ТКМ. Широко сообщалось, что полисахариды, извлеченные из ТКМ, обладают анти-остеопорозэффект и несколько нежелательных побочных эффектов, которые обычно используются в клинике (например, полисахариды, извлеченные из Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) и Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Поэтому мы предположили, чтоЦистанхе пустыннаяполисахарид(CDP), извлеченный из CD, может быть потенциально безопасным лекарственным средством для лечения остеопороза.

Как правило, резорбция кости и формирование кости поддерживают динамический баланс во время ремоделирования кости в координации с несколькими типами клеток, включая остеокласты, остеобласты, клетки костной выстилки и остеоциты (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Нарушение этого баланса может привести к различным метаболическим заболеваниям костей, таким какостеопороз(Zhu et al., 2018) и остеосклероз (Ihde et al., 2011). Остеокласты, как конечно дифференцированные клетки, происходящие из линии мононуклеаров/макрофагов, являются единственными клетками, обладающими функцией резорбции кости (Teitelbaum, 2000). В дифференцировке и созревании остеокластов участвуют два ключевых цитокина (Koga et al., 2004): макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и лиганд рецептора-активатора ядерного фактора κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF опосредует дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток в предшественники остеокластов и способствует дифференцировке остеокластов путем повышения экспрессии рецептора RANK (Takayanagi, 2007). Связывание RANKL и RANK на поверхности клеток остеокластов приводит к следующему: (1) рекрутированию сигнальных адапторных молекул, таких как фактор 6, ассоциированный с рецептором TNF (TRAF6); (2) активация множества нижестоящих мишеней, включая NF-κB и митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK); и (3) повышение уровня экспрессии ядерного фактора активированных Т-клеток, цитоплазматического 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Активация этих сигнальных путей напрямую регулирует экспрессию генов остеокластов, включая кислую фосфатазу 5 (Acp5) [кодирует устойчивую к тартрату кислую фосфатазу (TRAcP)], матриксную металлопротеиназу 9 (MMP9) и катепсин К (CTSK) (Boyle, Simonet и Лейси, 2003). Следовательно, ингибирование RANKL-индуцированных сигнальных путей, связанных с дифференцировкой остеокластов, является потенциальным терапевтическим методом при остеопорозе.

В этом исследовании мы стремились определить влияние лечения CDP на овариэктомию (OVX), индуцированнуюостеопорозмышиной модели in vivo и на RANKL-индуцированной активности остеокластов in vitro с акцентом на экспрессию генов, специфичных для остеокластов, и активацию сигнальных путей NFATc1 и NF-κB и MAPKs. Наши результаты могут дать новое представление о потенциале CDP как безопасного и эффективного препарата для лечения остеопороза.

Для получения более подробной информации, пожалуйста, свяжитесь с:Joanna.jia@wecistanche.com

Полисахарид цистанхе пустыни обладает многими эффектами при остеопорозе, нажмите здесь, чтобы узнать больше

2. Материалы и методы

2.1. Химические вещества и сбор образцов

Компакт-диск (№ 180801) был приобретен у Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Аньхой, Китай) и идентифицирован профессором Хайбо Хуангом из Школы фармацевтических наук Гуанчжоуского университета китайской медицины, Гуанчжоу, Китай. Таблетки эстрадиола валерата были приобретены у компании Bayer (Леверкузен, Северный Рейн-Вестфалия, Германия). Альфа-модифицированная минимальная необходимая среда

(-MEM) и эмбриональную бычью сыворотку (FBS) получали от Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Пенициллин/стрептомицин и набор для окрашивания TRAcP были приобретены у компании Solarbio (Пекин, Китай). Рекомбинантный мышиный M-CSF и рекомбинантный мышиный RANKL были приобретены у R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота, США). Пластины, покрытые гидроксиапатитом, были приобретены у Corning Life Sciences (Сент-Лоуэлл, Массачусетс, США). Первичные антитела к NFATc1 и CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США); IkB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK и P-JNK (Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс, США); и -актин (CWBIO, Пекин, Китай). Другие реагенты, использованные в этом исследовании, были аналитической чистоты, а вода очищалась с помощью системы очистки воды Milli-Q (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США).

2.2. Извлечение CDP

CD измельчали ​​до мелкого порошка и трижды смешивали с петролейным эфиром для его уничтожения. Твердый остаток собирали фильтрованием и затем сушили при комнатной температуре.полисахаридыэкстрагировали из предварительно обработанных образцов трижды водой в течение 2 ч, концентрировали, осаждали добавлением безводного этанола до конечной концентрации 80% (об./об.) и хранили при 4°С в течение 24 ч. Осадки собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, растворяли в дистиллированной воде и очищали (удаляя свободные белки) по методу Севага (Zhao et al., 2019). Восстановленныйполисахаридыподвергали диализу, сушили и хранили до дальнейшего использования. Кроме того, результаты химического состава показали, что общее содержание сахара, уроновой кислоты, сульфата и белка в CDP составляло 67,63 0,98 процента, 21,05 0,49 процента, 1,{{7 }},24 процента и 8,81 0,36 процента .

Состав моносахаридов и инфракрасный анализ ЦДФ с преобразованием Фурье были показаны на дополнительных рисунках 1 и 2.

2.3. Мышиная модель остеопороза, индуцированного OVX

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Гуанчжоуского университета китайской медицины (одобрено SYXK 2019-0202). Самки мышей C57BL/6 в возрасте тридцати 6-недель были предоставлены Центром экспериментальных животных Гуанчжоуского университета китайской медицины. После акклиматизации в течение 1 недели одной группе мышей была проведена имитация операции (группа имитации), а остальным мышам была проведена операция овариэктомии (группа OVX). После операции мышам давали восстановиться в течение 1-недели. Затем успешно смоделированные мыши были случайным образом разделены на 5 групп по 6 мышей в группе:

(1) Группа имитации: лечили дистиллированной водой, (2) группа OVX: лечили дистиллированной водой, (3) группа OVX E2 (E2): лечили таблетками 0,13 мг/кг эстрадиола валерата, (4 ) Группа низкой дозы OVX CDP (CDP-L): обработанная 300 мг/кг CDP, (5) группа высокой дозы OVX CDP (CDP-H): обработанная 600 мг/кг CDP. Дистиллированную воду, E2 или CDP вводили через зонд один раз в день. Всех мышей умерщвляли после 12- недельного периода лечения (рис. 1А). Матки были собраны и взвешены, а левая большеберцовая кость была собрана для последующего исследования. Образцы цельной крови отбирали и центрифугировали при 5000 об/мин в течение

15 мин при 4 ◦C. Супернатанты сыворотки отсасывали и хранили при

-80 ◦C до дальнейшего анализа.

2.4. Микрокомпьютерная томография (микро-КТ) и гистоморфометрия костей

Левые голени фиксировали 4-процентным параформальдегидом в течение 48 часов, а затем помещали в центрифужные пробирки, содержащие физиологический раствор. Фиксированные образцы сканировали с помощью прибора Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Бельгия) со следующими настройками: напряжение 80 кВ; ток источника 100 мкА; Al, фильтр 0,5 мм; пиксель

размер 9,76 мкм; шаг вращения 0.6◦. Несколько параметров

трабекулярной кости, включая минеральную плотность кости (BMD), объемную долю кости (BV/TV), площадь кости в расчете на общий объем (BS/TV), трабекулярное число (Tb. N) и трабекулярное расстояние (Tb. Sp) измеряли с помощью Программное обеспечение CT-Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Трехмерные изображения были созданы с использованием программного обеспечения CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).

После анализа микро-КТ левая большеберцовая кость была декальцинирована в 14-процентном растворе ЭДТА и помещена в парафин для изготовления срезов. Образцы были нарезаны на срезы толщиной 5 мкм с использованием микротома перед экспериментами по окрашиванию гематоксилином и эозином (H&E) и TRAcP. Окрашенные срезы исследовали и документировали с помощью микроскопа Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Токио, Япония).

Цистанхеможет повысить плотность костей и уменьшить остеопороз

2.5. Анализ сыворотки

Концентрации кальция (Ca) и фосфора (P) определяли в соответствии с инструкциями к набору, разработанными Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Нанкин, Китай). Уровни TRAcP-5b и RANKL в сыворотке анализировали с использованием набора ELISA TRAcP-5b (CUSABIO, Ухань, Китай) и набора RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Ухань, Китай) соответственно.

2.6. Анализ остеокластогенеза in vitro

BMM были выделены из голени и бедра 6-самок мышей C57BL/6 недельного возраста. Выделенные клетки культивировали в среде -MEM, содержащей 25 нг/мл M-CSF, 10 процентов FBS и 1 процент пенициллина/стрептомицина. После достижения слияния BMM ({9}} клеток/лунку) высевали в 96-луночные планшеты и обрабатывали CDP в присутствии 50 нг/мл RANKL. Среду и CDP заменяли каждые 2 дня. Через 7 дней клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали на наличие TRAcP. Количество остеокластов, определенных как TRAcP-положительные клетки с тремя или более ядрами, подсчитывали и документировали с использованием светового микроскопа.

2.7. Анализ пролиферации клеток

BMM (1 × 104 клеток/лунку) высевали в 96-луночный планшет и инкубировали в течение ночи. После этого клетки обрабатывали различными концентрациями CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 и 40 мкг/мл) в течение 48 часов. Слияние клеток обнаруживали и анализировали с помощью IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Анн-Арбор, Мичиган, США), долговременной динамической системы визуализации живых клеток в реальном времени.

2.8. Анализ резорбции гидроксиапатита

BMM ({{0}} клеток/лунка) высевали на планшет, покрытый гидроксиапатитом, обрабатывали CDP в указанных концентрациях (0, 5 и 10 мкг/мл) и культивировали в полной -MEM. содержащий 25 нг/мл M-CSF и 50 нг/мл RANKL. Через 7 дней клетки промывали 10-процентным раствором хлорной извести для удаления компонентов клеток. Изображения областей резорбции гидроксиапатита были получены с помощью IncuCyte ZOOM® и проанализированы с использованием программного обеспечения ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).

2.9. Выделение РНК и количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-qPCR)

BMM ({{0}} клеток/лунку) высевали в 6-луночный планшет и стимулировали RANKL и M-CSF в присутствии CDP в различных концентрациях (0, 5 и 10 мкг/мл) в течение 5 дней. Суммарную РНК выделяли из клеток или костной ткани мышей с использованием реагента ТРИзол (Sigma-Aldrich). Комплементарную ДНК синтезировали из 2 мкг тотальной РНК с использованием набора для обратной транскриптазы (TransGen Biotech, Пекин, Китай). Реакции RT-qPCR готовили с использованием PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) и определяли с помощью системы ABI 7500 (Applied

Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США). Параметры циклирования для ПЦР были установлены следующим образом: 95°С в течение 5 мин, затем 40 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 30 с. Используемые специфические праймеры показаны в таблице 1, а количество каждого гена-мишени нормализовали по GAPDH (внутренний контроль).

2.10. Вестерн-блот анализ

BMM ({{0}} клеток/лунку) высевали в 6-луночный планшет. Для краткосрочных экспериментов клетки предварительно инкубировали с различными концентрациями CDP (0, 5 и 10 мкг/мл) в течение 1 ч, а затем обрабатывали 50 нг/мл RANKL в течение 30 мин. . В течение длительного времени клетки стимулировали 50 нг/мл RANKL на 3, 5 и 7-е сутки в присутствии ЦДФ (0, 5 и 10 мкг/мл). Суммарные белки экстрагировали с использованием лизирующего буфера RIPA (CWBIO). Белки разделяли с помощью 10-процентного SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF. Мембраны блокировали 5-процентным обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 2 ч, инкубировали с первичным

антитела в течение ночи при 4 ◦C, а затем с соответствующей вторичной

антитела в течение 1,5 часов. Мембраны были разработаны с использованием реагентов ECL (Millipore Corp., Биллерика, Массачусетс, США), а изображения были получены с использованием системы хемилюминесцентной визуализации Tanon 5200 (Tanon Science and Technology, Шанхай, Китай).

Цистанхеможет повысить плотность костей

2.11. Обнаружение транслокации NFATc1 с помощью иммунофлуоресцентного теста

BMM высевали на {{0}}луночные покровные стекла, стимулировали RANKL и M-CSF и обрабатывали 10 мкг/мл CDP в течение 5 дней. Клетки фиксировали 4-процентным параформальдегидом в течение 15 мин, трижды промывали PBS и пермеабилизировали 0,1-процентным раствором тритона X-100 в течение 10 мин. Клетки смешивали с 10-процентной козьей сывороткой (CWBIO) и инкубировали в течение 2 часов. Затем клетки инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4°С, а затем с козьим антимышиным вторичным антителом Alexa Fluor 488 (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) в темноте в течение 1 часа. Покровные стекла промывали PBS, помещали в реагент Prolong Gold Antifade Reagent с 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Solar) и

осмотр с использованием Zeiss LSM 800 с конфокальным микроскопом Airyscan (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия).

2.12. статистический анализ

Все экспериментальные данные были проанализированы с использованием статистического программного обеспечения SPSS 25.0 (IBM Corporation, Армонк, штат Нью-Йорк, США). Данные для исследований на животных и клетках выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и среднее значение ± стандартное отклонение соответственно. Результаты используют однофакторный дисперсионный анализ или критерий Стьюдента. Значения p < 0.05="" считались="" статистически="">

Цистанхеможет уменьшитьапоптози укрепить костиплотность