ЧАСТЬ 1: Экстракты цистанхе уменьшают нейротоксичность, вызванную перекисью водорода, в новых мутантных клеточных моделях нейробластомы, трансфицированных DJ-1

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com

1. ВВЕДЕНИЕ

К основным нейродегенеративным заболеваниям относятсяболезнь Альцгеймераболезнь, болезнь Паркинсона (БП), болезнь Гентингтона и другие. Среди этих заболеваний частота заболеваемости БП (болезнь Паркинсона) занимает второе место в мире и достигает 1-2% у людей старше 60 лет (Burke & O'Malley, 2013; Mullard, 2017; Shen & Ji, 2013). Основной неврологической характеристикой БП является прогрессирующая дегенерация дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции (Glizer & MacDonald, 2016), которая сопровождается появлением включений -синуклеина, называемых тельцами Леви (Zhang, An, Zhang, & Pu). , 2010). В патогенезе БП в качестве основных симптомов БП в клинике диагностируют тремор покоя, ригидность, брадикинезию и постуральные нарушения. Хотя точные механизмы прогрессирующей дегенерации дофаминергических нейронов непонятны, это могут быть либо экологические причины, включая воздействие инсектицидов, нейротоксических агентов и тяжелых металлов, либо генетические причины, такие как мутации паркина (Kitada et al., 1998), -синуклеина (Polymeropoulos et al., 1997) и DJ-1 (Biosa et al., 2017; Bonifati et al., 2003), как полагают, приводят к возникновению БП. На сегодняшний день количество миссенс-мутаций, мутаций сдвига рамки считывания и делеций больших фрагментов, вызванных мутациями гена DJ-1, превышает 10 (Andres-Mateos et al., 2007; Bonifati et al., 2003; Hague et al., 2003). В белке DJ-1 важна замена лейцина 166 пролина (L166P). Кроме того, также было показано, что окислительный стресс возникает при БП (Dexter et al., 1989, 1994; Nikam, Nikam, Ahaley, & Sontakke, 2009) и участвует в его патогенезе (Hague et al., 2003).

Ген DJ-1, содержащий восемь экзонов, распределенных по 24 т.п.н., расположен на хромосоме 1p36 у человека (Bonifati et al., 2003) и кодирует высококонсервативный белок, содержащий 189 аминокислот. Белок относится к семейству ThiJ/PfpI, существует в гомодимерной форме. Глиальные клетки в коре, черной субстанции и полосатом теле в основном обнаруживаются в областях белка DJ-1 (Olzmann et al., 2007). В этих клетках DJ-1 играет следующие роли, такие как онкоген (Nagakubo et al., 1997), регуляция транскрипции (Kim et al., 2005; Niki, Takahashi-Niki, Taira, Iguchi-Ariga, & Agria, 2003). ), антиоксидантный стресс (Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), шаперон (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete, & Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko, & Fink, 2006) и протеаза. (Абоу-Слейман, Хили, Куинн, Лис и Вуд, 2003 г.).

Лечение нейродегенеративных заболеваний: экстракт цистанхе

ЦистанхеЭто традиционная китайская медицина, которая на протяжении веков в основном использовалась для лечения андрологических заболеваний. Основные действующие вещества вЦистанхепредставляют собой фенилгликозиды, включающие 34 соединения, такие как актеозид, эхинакозид и др. Фармакологические эффектыЭкстракты цистанхевключают улучшение сексуальной функции, замедление старения, повышение способности к обучению и памяти, нейропротекцию, иммуномодуляцию, антиусталость, антиишемию и защиту печени (Tu et al., 2011). Кофеиновая кислота является одним из основных метаболитов цистанхе (Yan, 2018).

Обычно используемые клеточные модели БП включают клетки PC12, индуцированные ионами 1-метил-4-фенилпиридиния (Abou-Sleiman et al., 2003), и клетки нейробластомы, индуцированные перекисью водорода (H2O2) (SH-SY5Y) (Zhang et al. ., 2009). Однако в этих моделях отсутствуют типичные патологические признаки БП. Чтобы разработать более физиологически значимую клеточную модель БП, в этом исследовании мы установили индуцированные H2O2 клетки L166P и C106S DJ-1, трансфицированные SH-SY5Y, и исследовали эффектыЭкстракты цистанхеи ключевые биологически активные соединения, включая актеозид, эхинакозид, кофейную кислоту иЦистанхе общие гликозидына этих двух моделях впервые.

Экстракт цистанхе против нейродегенеративных заболеваний

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1|Плазмиды, лекарства, химические вещества и клетки

Плазмиды FLAG-L166P DJ-1, FLAG-C106S DJ-1 и поликлональные антитела против DJ-1 были любезно предоставлены доктором Хироёси Аригой из Высшей школы фармацевтических наук Университета Хоккайдо. Обезвоженная минимальная основная среда (MEM) и среда F-12 были приобретены у Gibco. Липофектин был от Invitrogen. FastDigest Xho I и FastDigest EcoR I были произведены Fermentas. Набор для подготовки плазмид, не содержащих эндотоксин, был получен от biotech. Клеточная линия SH-SY5Y была получена из банка клеток Китайской академии медицинских наук. Набор реагентов для анализа белка BCA был от Pierce. Мембраны PVDF были от Millipore. Поликлональные антитела против FLAG были получены от GeneTex.Экстракты цистанхе, включая актеозид, эхинакозид, кофейную кислоту и общие гликозиды Cistanche, были предоставлены Департаментом натуральных лекарственных средств Школы фармацевтических наук Пекинского университета.

2.2|Амплификация, экстракция и очистка плазмид

После культивирования клеток Escherichia coli JM109 в жидкой среде LB до OD600=0.5 получали компетентные клетки с использованием хлоридно-кальциевого метода. Затем компетентные E. coli трансформировали плазмидной ДНК методом теплового шока, после чего трансформанты культивировали на чашках LB, содержащих ампициллин, в течение 16–24 часов при 37°С. Затем отбирали успешно трансформированную моноклональную колонию и культивировали в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение дополнительных 12 часов при 37°С. Плазмиды экстрагировали и очищали с использованием набора для приготовления плазмид, не содержащего эндотоксин, в соответствии с инструкциями производителя.

2.3|Идентификация плазмиды

Экстрагированные плазмиды подвергали ферментативному расщеплению, после чего плазмиды и расщепленные фрагменты исследовали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Полученный гель окрашивали в растворе ЭБ в течение 20–25 мин при комнатной температуре и фотографировали.

2.4|Трансфекция плазмиды в клетки SH-SY5Y

Очищенную плазмидную ДНК трансфицировали в клетки SH-SY5Y, культивированные в среде MEM/F-12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Затем трансфицированные клетки отбирали в среде, содержащей 400 мкг/мл G418, после чего использовали 200 мкг/мл G418 для поддержания стабильно трансфицированной клеточной линии.

2,5|Идентификация трансфицированных клеток вестерн-блоттингом

Трансфицированные клетки SH-SY5Y лизировали в буфере RIPA. После центрифугирования лизата определяли концентрацию общего белка в супернатанте с использованием набора реагентов для анализа белка ВСА. Затем равные количества белкового экстракта подвергали электрофорезу в 12,5% SDS-полиакриламидном геле и переносили на мембрану PVDF. Мембрану PVDF блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в растворе TBST и обрабатывали для иммунодетекции. Анти-FLAG и анти-DJ-1 использовались в качестве первичных антител, а конъюгированные с пероксидазой хрена IgG были вторичными антителами. Для обнаружения белков-мишеней применяли улучшенную систему обнаружения хемилюминесценции.

2,6|Иммуноцитохимическая идентификация трансфицированных клеток

Трансфицированные клетки SH-SY5Y фиксировали 4-процентным раствором параформальдегида, пермеабилизировали 0,3-процентным раствором Triton X-100 и блокировали 10-процентной козьей сывороткой. Затем заблокированные клетки инкубировали сначала с поликлональными антителами анти-FLAG и анти-DJ-1, а затем с конъюгированными с FITC козьими антикроличьими вторичными антителами. Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342 и визуализировали клетки под инвертированным флуоресцентным микроскопом (IX-71, Olympus).

2,7|Анализ жизнеспособности клеток

Нетрансфицированные и трансфицированные клетки SH-SY5Y высевали в 96-экстракты, включая актеозид, эхинакозид, кофейную кислоту и общие гликозиды Cistanche (все 10, 20 и 40 мкг/мл соответственно), добавляли и клетки инкубировали в течение 6 часов перед обработкой 0,2 мМ H2O2 в течение дополнительного 1 часа. Среду удаляли и анализировали жизнеспособность клеток с использованием МТТ, как описано выше.

2,8|Влияние экстрактов цистанхе на жизнеспособность клеток

экстракты, включая актеозид, эхинакозид, кофейную кислоту и общие гликозиды цистанхе (все 10, 20 и 40 мкг/мл соответственно), и клетки инкубировали в течение 6 часов перед обработкой 0,2 мМ H2O2. еще на 1 час. Среду удаляли и анализировали жизнеспособность клеток с использованием МТТ, как описано выше.

2.9|статистический анализ

Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Различия между группами были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа и метода LSD с помощью программного обеспечения SPSS 22.0. Значения р < 0,05="" считались="">

Цистанхетрава

3|ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1|Плазмиды были успешно трансформированы и очищены. После раздельной экспрессии в E. coli JM109 плазмиды экстрагировали и исследовали с помощью электрофореза в 1-процентном агарозном геле после расщепления рестрикционным ферментом (рис. 1). Плазмиды размером 6,2 т.п.н. были расщеплены на линейные фрагменты ДНК размером 5,4 и 0,8 т.п.н., что подтвердило, что плазмиды L166P и C106S DJ-1 были успешно экспрессированы и очищены.

3.2|Идентификация трансфицированных клеток методом вестерн-блоттинга. Как показано на рисунке 2, мы обнаружили полосы FLAG-L166P DJ-1 и FLAG-C106S DJ-1 с молекулярной массой около 70 кДа. Высокие уровни белка с меткой FLAG в трансфицированных клетках SH-SY5Y указывают на то, что мутанты L166P и C106S DJ-1 сильно экспрессировались в соответствующих трансфектантах.

3.3|Иммуноцитохимическая идентификация трансфицированных клеток. Он показывает сильные флуоресцентные сигналы от трансфицированных клеток SH-SY5Y после инкубации с антителами анти-DJ-1 или анти-FLAG. Это подтверждает высокие уровни экспрессии L166P и C106S DJ-1 в трансфектантах.

3.4|Трансфицированные клетки были более чувствительны к Н2О2, чем нетрансфицированные. После инкубации в течение 1 часа в присутствии H2O2 различной концентрации (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} },5 и 1 мМ соответственно), жизнеспособность клеток SH-SY5Y, трансфицированных L166P или C106S DJ-1, дозозависимо снижалась по сравнению с нетрансфицированными клетками.

3,5|Экстракты цистанхе ингибируют индуцированное H2O2 снижение жизнеспособности клеток SH-SY5Y, дозозависимое ингибирование при лечении с помощьюЭкстракты цистанхе, включая актеозид, эхинакозид, кофейную кислоту и общие гликозиды Cistanche (все 10, 20 и 40 мкг/мл соответственно).

Цистанхе