Часть 1: Эхинакозид защищает от апоптоза нейронов, индуцированного MPP plus, посредством регуляции пути ROS/ATF3/CHOP

Цин Чжао1 • Сяоянь Ян2 • Динфан Цай3,4 • Лин Е5,6 • Юйцин Хоу1 •

Лицзюнь Чжан1 • Цзивэй Чэн1 • Юань Шэнь1 • Кайчжэ Ван5 • Ю Бай1

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 2

видов (АФК) также способствуют его развитию [3]. Характеристики, сходные с БП, могут быть вызваны несколькими токсинами окружающей среды, включая 1-метил-4-фенил- 1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP), цианид, сероуглерод, и толуол. MPTP широко используется для индукции животных моделей БП, а его активный метаболит, ион 1-метил-4- фенилпиридиния (MPP?), используется в клеточных моделях БП [4, 5]. МПП? избирательно ингибирует электрон-транспортную цепь и приводит к избыточной продукции АФК, тем самым вызывая гибель нейронов и синдром, напоминающий БП [6]. Недавние исследования показали, что MPP? индуцирует несколько путей в модели БП in vitro, включая повышенное фосфорилирование GSK3B (pY206) и накопление а-синуклеина [5], активацию оси гемоксигеназы -1/ниникотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидазы/АФК [7, 8], повышенная экспрессия активного фактора транскрипции 3 (ATF3) и остановка роста с помощью индуцируемого повреждением ДНК 153 (GADD153)/C/EBP-гомологичного белка (CHOP) [9]. В клиническом лечении подавление продукции АФК является одной из важнейших стратегий выживания нейронов и лечения БП [1].

Эхинакозид(ЭХ, рис. 1А), природныйфенилэтаноидсодержится во многих лекарственных растениях, является основным компонентомфенилэтаноидгликозидывыделен из традиционной китайской травы,Цистанхесальса [10]. Интересно, что недавние исследования показали, чтоЭХоказывает защитное действие на мышиной модели БП, индуцированной МФТП [10, 11].ЭХтакже ослабляет апоптоз клеток нейробластомы, индуцированный фактором некроза опухоли-а или 6-гидроксидопамином in vitro [12, 13]. Однако механизмы, с помощью которыхЭХспособствует выживанию нейронов в модели клеток PD, индуцированных MPP?, остаются неясными.

Мы показали, чтоЭХзаметно уменьшили продукты ROS, индуцированные MPP? в клетках SH-SY5Y.ЭХтакже ингибировал MPP?-индуцированную экспрессию ATF3, CHOP и α-синуклеина, а также подавлял активацию проапоптозных белков каспазы-3 и поли(АДФ-рибозо)полимеразы (PARP).

Цистанхеэхинакозидимеетнейропротекторныйпоследствия

Материалы и методы

Реагенты

Минимальная основная среда Дульбекко (DMEM), эмбриональная бычья сыворотка, 0,25% трипсин, 1% пенициллин/стрептомицин и реагент TRIzol были получены от Life Technologies (Гранд-Айленд, Нью-Йорк). Хроматиновый краситель бисбензимид (Hoechst 33342), поли-L-лизин, MPP? йодид и MPTP были получены от Sigma (Сент-Луис, Миссури). Набор для анализа малонового диальдегида (MDA) перекисного окисления липидов и диацетат дихлорфлуоресцеина (DCFH-DA) были получены от Beyotime Biotech (Haimen, Китай). ЭХГ чистоты C98% был получен от Push Biotechnology (Чэнду, Китай).

Животные и лечение

Содержание и лечение животных были такими же, как описано ранее [14]. Мы использовали самцов мышей C57BL/6 (Shanghai Laboratory Animal Co., Шанхай, Китай) массой 24–26 г в возрасте 10 недель. Животных содержали в стандартных условиях (цикл 12:12 свет:темнота, 21±2°С и относительная влажность 40%) и давали им свободный доступ к пище и воде. Все процедуры были одобрены Комитетом по этике животных больницы Чжуншань Университета Фудань и проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию животных.

Лабораторные животные.

Мышей случайным образом разделили на четыре группы (по 10 мышей в группе): группа А, контрольная группа с носителем, получавшая равный объем (500 мкл) физиологического раствора (НС); группа В, контрольная группа ЭХГ, получавшая 20 мг/кг ЭХГ; группа C, модельная группа MPTP, предварительно обработанная равным объемом NS; и группа D, группа, получавшая ЭХГ, предварительно получавшая 20 мг/кгЭХ. ЭХрастворяли в NS и вводили внутрижелудочно каждые 24 часа в течение 15 дней подряд. Модель БП у мышей для групп C и D создавали путем пяти последовательных внутрибрюшинных инъекций 30 мг/кг МРТР каждые 24 часа с 11-го по 15-й день. кг) внутрибрюшинно через 24 ч после последней обработки.

Перфузию и обработку тканей проводили, как описано ранее [14]. После внутрисердечной перфузии образцы головного мозга собирали и фиксировали в 4-процентном параформальдегиде в течение 24 часов при 4°С, заливали в парафин и делали коронарные срезы, охватывающие всю ЧНС (стереотаксические координаты переднезаднего направления -3.64 до -2.92. мм относительно брегмы) обрезали на 5 мкм.

Еще 5 животных из каждой группы умерщвляли смещением шейных позвонков, а вентральную часть среднего мозга быстро лизировали в 1% буфере для лизиса SDS на льду. Уровни белков CHOP и ATF3 в лизате анализировали с помощью вестерн-блоттинга.

Цистанхеэхинакозидоказывает бодрящее действиепочка

Культура вентрального среднего мозга крысы (VM)

Дофаминергические нейроны

Беременных крыс Wistar приобретали у Shanghai Laboratory Animal Co. (Шанхай, Китай). DA-нейроны в VM выделяли на 14-й день эмбрионального развития. VM препарировали и обрабатывали для создания первичных культур DA-нейронов VM, как описано ранее [15, 16]. Вкратце, кусочки ткани собирали в охлажденном льдом сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) и центрифугировали при 1{8}}00 об/мин при 4°C в течение 5 мин. Осадок ткани инкубировали в 750 мкл 0,1% трипсин-HBSS в течение 15 мин при 37°С с 5% СО2. Фетальную телячью сыворотку (FCS; 750 мкл) использовали для инактивации трипсина, и ткани диссоциировали путем осторожного растирания.

с помощью стерилизованной пипетки Пастера. Суспензии клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 4 мин при 4°С и ресуспендировали в среде для дифференцировки (среда Игла, модифицированная Дульбекко/F12, 33 ммоль/л D-глюкозы, 1% L-глутамина и 1% FCS, дополненная 2% В27). Клетки высевали на покрытые поли-D-лизином (Sigma) 24-луночные планшеты для тканевых культур в количестве 5 9 104 клеток на лунку в 500 мкл среды для дифференцировки при 37°C с 5% CO2 в течение 10 дней для развития в

зрелые ДА-нейроны. Нейроны VM DA характеризовались иммунофлуоресценцией с антителами против b-тубулина изотипа III и антителами к тирозингидроксилазе (TH) (рис. S1). Клетки обрабатывали 1 ммоль/л MPP?, 40 мкг/мл ECH, комбинацией MPP? и только ЭХГ или PBS в качестве контроля. Жизнеспособность клеток анализировали с помощью реагента CCK-8 после 96 ч обработки.

и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n {{0}}; **P \0.01 по сравнению с контролем, #P \ 0,05, ## P <0,01 по="" сравнению="" с="" mpp="" лечение).="" c="" световые="" микроскопические="" изображения="" морфологических="" изменений,="" вызванных="" mpp?="" или="" мпп?="" и="" эч.="" а,="" контроль="" pbs;="" б="" —="" 40="" мкг/мл="" эхг;="" в="" —="" 1="" ммоль/л="" мфп?;="" г,="" 1="" ммоль/л="" мфп?="" и="" 10="" мкг/мл="" эхг;="" д,="" 1="" ммоль/л="" мфп?="" и="" 20="" мкг/мл="" эхг;="" f,="" 1="" ммоль/л="" мфп?="" и="" 40="" мкг/мл="" эхг="" (шкала,="" 200="">

Цистанхе эхинакозид ингибирует апоптоз.

Культура клеток SH-SY5Y

Клетки SH-SY5Y были получены из Банка клеток Шанхайского института клеточной биологии (Китайская академия наук, Шанхай, Китай) и культивированы в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина. Клетки содержали во влажном инкубаторе при 37°С, снабженном 5% СО2. МПП? растворяли в стерильной воде и сразу использовали. ЭХГ растворяли в PBS. Чтобы изучить экспрессию генов, связанных с АФК, и уровни белка, клетки высевали в 6-луночные планшеты и культивировали в течение 24 часов. Затем клетки подпитывали свежей средой, содержащей MPP?, ECH, комбинацию MPP? и только ЭХГ или PBS в качестве контроля. Через 24 часа после обработки клетки лизировали 1-процентным буфером для лизиса SDS (1-процентный SDS, 25 ммоль/л ЭДТА, 45 ммоль/л Трис-HCl, pH 6,5) для вестерн-блоттинга, а тотальную РНК выделяли непосредственно с помощью Реактив ТРИЗОЛ.

Для анализа распределения ATF3 и CHOP после обработки использовали наборы реагентов для выделения ядер и цитоплазмы (Thermo Fisher, Waltham, MA) для выделения фракций цитоплазмы и ядер из обработанных лекарственным средством и контрольных клеток.

Анализ жизнеспособности клеток

Клетки SH-SY5Y высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи. Клетки подпитывали каждые 24 ч свежей полной средой, содержащей различные препараты, и выдерживали в течение 3 сут. Затем оценивали жизнеспособность с помощью набора счетчиков клеток CCK8 (Dojindo, Япония). Данные были нормализованы к результатам контроля PBS и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Для анализа жизнеспособности клеток SH-SY5Y с 3-нокдауном ATF (кшРНК ATF3) и контрольных клеток (кшРНК GFP) клетки добавляли в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 14–16 часов. Плазмиды кшРНК ATF3 или кшРНК GFP трансфицировали в клетки SH-SY5Y с использованием липофектамина 2000 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Клетки обрабатывали 1 ммоль/л MPP? или равный объем PBS через 24 часа после трансфекции, а затем инкубировали в течение 3 дней. Количество клеток подсчитывали каждый день. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Конструкции кшРНК и олигопраймеры

Конструкции кшРНК pGV298-ATF3 (ATF3shRNA) и контрольные конструкции кшРНК GFP были получены от GeneChem Co. (Шанхай, Китай). Целевой последовательностью ATF3 была 50-GCAAAGT G!CCGAAACAAGA-30 из ранее описанных методов [17, 18]. Для обнаружения экспрессии генов, индуцированной MPP?, гены, связанные со стрессом и болезнью АФК, были выбраны для qRT-PCR, а GAPDH использовали в качестве контроля. Все праймеры были синтезированы Sangon Biotech Co. (Шанхай, Китай), последовательности праймеров перечислены в таблице 1.

ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали реагентом TRizol в соответствии с инструкциями производителя. Обратную транскрипцию и количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводили, как описано ранее. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора для синтеза кДНК RevertAid First Strand (Thermo Scientific, Waltham, MA) в соответствии с инструкциями производителя. Набор SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa, Далянь, Китай) использовали для количественной ОТ-ПЦР: реакционные системы 20-lL использовали с ABI (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Параметры ПЦР включали следующие этапы: 95°С 3 мин, 1 цикл; 95°С в течение 5 с и 60°С в течение 40 с, 40 циклов. Окончательные данные не были

морализируются по отношению к GAPDH и представлены как отношение к контролю. Праймеры, использованные для амплификации, перечислены в таблице 1.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блот анализ проводили, как описано ранее [19]. Первичными антителами были антитела против расщепленной каспазы 3 и p53 (Cell Signaling Technology, Дэнверс, Массачусетс), антитела против GAPDH (Proteintech Group, Чикаго, Иллинойс), антитела против GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Шэньян, Китай) и против ATF3, анти-PARP, анти-PUMA и анти-гистон 3 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния). Вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена, были получены от Jackson Immune Research Laboratories (Western Grove, PA). Мембраны PVDF были от EMD Millipore (Billerica, MA), а субстрат ECL был от CWBio (Сучжоу, Китай). Относительные уровни белка, основанные на уровнях серого на изображении, были проанализированы с помощью программного обеспечения Tanon GIS (Tanon Biotech, Шанхай, Китай), и данные представлены как отношение целевого белка к GAPDH.

Цистанхеэхинакозидимеет эффект защиты печени