Часть 1: Эффект актеозида как клеточного протектора для получения клонированной собаки

Джи Хе Ли1☯, Джу Лан Чун1☯, Гын Чон Ким1, Ын Ён Ким1, Дон Хи Ким1, Бо Мён Ли1, Кил У Хан1, Кан-Сон Пак1, Кён-Бон Ли2, Мин Гю Ким1*

1 Отделение животноводства и молочного животноводства, Колледж сельского хозяйства и наук о жизни, Национальный университет Чунгнам, Тэджон, Республика Корея,

2 Кафедра биологического образования, Педагогический колледж,Чоннамский национальный университет, Кванджу, Республика Корея

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 2

Абстрактный

Перенос ядер соматических клеток (SCNT) является хорошо известным лабораторным методом. Принцип SCNT включает перепрограммирование соматического ядра путем инъекции соматической клетки в реципиентный ооцит, ядро ​​которого было удалено. Таким образом, клетки-доноры ядра рассматриваются как решающий фактор в SCNT. Синхронизация клеточного цикла клеток-доноров ядра на стадии G0/G1 может быть вызвана контактным ингибированием или сывороточным голоданием. В этом исследовании,актеозид, соединение фенилпропаноидного гликозида, исследовали, чтобы определить, применимо ли оно для индукции синхронизации клеточного цикла, цитопротекции и повышения эффективности SCNT в фибробластах плода собаки. Первичные фетальные фибробласты собак обрабатывали с помощьюактеозид(10, 30, 50 мкМ) для различных периодов времени (24, 48 и 72 часа). Синхронизация клеточного цикла на стадии G0/G1 существенно не отличалась от метода индукции:актеозидлечение, контактное ингибирование или сывороточное голодание. Однако из этих трех видов лечения сывороточное голодание привело к значительному увеличению уровня активных форм кислорода (АФК) (99,5 ± 0,3 процента) и апоптозу. Результаты также показали, чтоактеозидснижение АФК и процессов апоптоза, включая некроз фетальных фибробластов собак, и улучшение выживаемости клеток. Эмбриональные фибробласты собак, обработанныеактеозидбыли успешно арестованы на стадии G0/G1. Более того, реконструированные эмбрионы с использованием клеток донора ядра, обработанных актеозидом, давали здоровую клонированную собаку, а не эмбрионы, полученные с использованием клеток донора ядра, подвергнутых контактному ингибированию. В заключение,актеозидиндуцированная синхронизация клеточного цикла донорских клеток ядра может быть альтернативным методом повышения эффективности собачьей SCNT из-за ее цитозащитного действия.

Цистанхе актеозид может повысить иммунитет

Введение

Метод SCNT использовался для получения генетически превосходных или манипулированных животных для сельскохозяйственных целей и в качестве биомедицинских ресурсов. С ростом потребности в животных моделях болезней, спасении животных, находящихся под угрозой исчезновения, стволовых клетках для регенеративной медицины, трансплантации органов и т. д. в последнее время возрастает интерес к клонированию животных с использованием SCNT [1–5]. Несмотря на то, что производство клонированных животных было успешным, эффективность SCNT все еще очень низка [6]. Причины низкой компетентности эмбриона SCNT включают множество факторов, связанных с качеством реципиентных ооцитов, качеством донорских клеток ядра и состоянием суррогатной матери [7–10].

Известно, что активные формы кислорода (АФК) и апоптоз участвуют в женских репродуктивных процессах, включая развитие ооцитов in vivo и in vitro [11–14]. АФК прерывают развитие эмбриона, вызывая конденсацию цитоплазмы, повреждение ДНК и апоптоз эмбрионов. В подтверждающих исследованиях сообщалось, что снижение АФК улучшает способность эмбриона SCNT к развитию во время культивирования in vitro [15–17]. Апоптоз представляет собой физиологический процесс, который происходит спонтанно во время нормального предимплантационного развития эмбриона для поддержания клеточного гомеостаза путем удаления ДНК поврежденных/неполноценно функционирующих клеток. АФК вызывают фрагментацию ДНК и увеличивают количество апоптотических бластомеров, что нарушает развитие эмбриона. Событие АФК и апоптоза чаще наблюдается после SCNT, чем после экстракорпорального оплодотворения [18, 19]. Во многих исследованиях сообщалось, что способность развития эмбриона SCNT восстанавливается за счет снижения уровня АФК и апоптоза с использованием антиоксидантов, таких как селен [20], инсулин-трансферрин-селен [17, 21], мелатонин [22] и глутатион [23].

В предыдущих исследованиях сообщалось, что использование донорских клеток, арестованных на стадии G{{0}}/G1, повышает эффективность SCNT [7, 9, 24–28]. Хроматин в донорских клетках на стадии G0/G1 считается наиболее эффективным для компетентности развития эмбриона SCNT. Для синхронизации донорского клеточного цикла часто используют контактное торможение, сывороточное голодание и химические обработки [7, 25, 29, 30]. Однако сывороточное голодание снижает выживаемость клеток и увеличивает фрагментацию ДНК, что приводит к апоптозу [31]. Химическое ингибирование является еще одной стратегией остановки клеточного цикла на стадии G0/G1 с использованием таких ингибиторов, как росковитин [29, 32], диметилсульфоксид (ДМСО) [33] и циклогексимид (ЦГХ) [34]. На эффективность метода, используемого для синхронизации, влияют типы и виды донорских клеток. Для оптимальной синхронизации донорских клеток необходимо тщательно оценить различные аспекты используемых методов.

актеозид(также известный как вербаскозид) [{{0}}(3, 4-дигидроксифенилэтил)-1-OaL-рамнопиранозил-(1/3)-bD-({{13} }O-кофеоил)-глюкопиранозид] выделяют из цветков фиалки Syringa vulgaris. Известно, что растения, содержащие актеозид, обладают антимикробной и противогрибковой активностью [35–37] и предотвращают воспаление. Действительно, актеозид проявляет различную биологическую активность in vitro и in vivo, такую ​​как антиоксидантная активность, антиапоптотическая активность, цитотоксичность в отношении различных опухолевых клеток и синхронизация клеточного цикла на стадии G0/G1 в качестве циклинзависимого ингибитор киназы (CDK) [38]. Например, Ли и др. [38]. сообщили, что лечение актеозидом может ингибировать пролиферацию клеток промиелоцитарного лейкоза HL-60 человека, вызывая остановку клеточного цикла на стадии G0/G1. Однако влияние донорских клеток, обработанных актеозидом, на эффективность собачьей SCNT еще предстоит изучить.

В этом исследовании эффектыактеозидна синхронизацию клеточного цикла, АФК иапоптозна собачьих эмбриональных фибробластах. Анализ синхронизации клеточного цикла, АФК и апоптоза проводили с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS). Чтобы продемонстрировать эффективность донорских клеток, обработанных актеозидом, эмбрионы SCNT были культивированы и перенесены собаке-реципиенту, и успешно получили здоровую клонированную собаку.

цистанхеможно лечитьпочкаболезнь улучшитьпочечныйфункция

Материалы и методы

Заявление об этике

В этом исследовании 44 самки беспородных собак (в возрасте 1–6 лет) использовались в качестве доноров ооцитов и суррогатных матерей для переноса эмбрионов, а самка бигля (в возрасте 2 лет) использовалась для создания клеточных линий эмбриональных фибробластов. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Национального университета Чунгнам (номер утверждения: CNU-00487) и проводились в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных», опубликованным IACUC. Чунгнамского национального университета. Собак выращивали в помещении в отдельных клетках с системой контроля температуры и вентиляции. Собак кормили коммерческим рационом один раз в день и давали воду вволю. Во всех экспериментах на животных собак вначале анестезировали кетамином и ксилазином в дозе 6 мг/кг и поддерживали в состоянии анестезии с помощью 2% изофлурана. В конце операции были назначены антибиотики (прокаин пенициллин G, бензатин пенициллин G и сульфат дигидрострептомицина) для предотвращения инфекции. После операции собак перевели в их индивидуальные клетки с пресной водой, за ними наблюдали и обеспечивали особый уход со стороны ответственного ветеринара, чтобы можно было назначить необходимое лечение, если животные в нем нуждаются.

Химикаты

Все химикаты были приобретены у Sigma-Aldrich Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США), если не указано иное. Актеозид был получен от Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. в Китае.

Выделение фибробластов плода собаки

Фибробласты плода собаки были получены из {{0}}дневных плодов. Вкратце, самка бигля была искусственно осеменена спермой самца бигля. Через 28 дней беременность у самки бигля была подтверждена, и путем целиогистерэктомии было получено 5 плодов. Плоды трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США). Голову, внутренние органы и конечности плодов удаляли хирургическим лезвием, а оставшиеся части тела измельчали ​​в PBS. Кусочки плодов дважды промывали центрифугированием при 400× в течение 5 минут и культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM; Gibco) с добавлением 1% пенициллин-стрептомицина (продукт № P4458) и 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco). при 39 градусах во влажной атмосфере с 5-процентным содержанием CO2 и 95-процентным содержанием воздуха. Когда клетки достигали слияния через 5–7 дней, их обрабатывали 0,25% раствором трипсин-ЭДТА (Gibco) в течение 2 мин и собирали. Две клеточные линии фетальных фибробластов собак были получены из двух отдельных плодов. Клетки замораживали в 10-процентном ДМСО в FBS и хранили в жидком азоте при температуре -196 градусов до использования.

Клеточная обработка

Замороженные собачьи фибробласты оттаивали и культивировали до 80% слияния. Клетки собирали и пассировали от 4 до 7 раз для последующих экспериментов. Клетки высевали в концентрации 106/мл в культуральные чашки диаметром 60 мм. Клетки культивировали в (1) DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина в течение пяти дней (контактное ингибирование), (2) DMEM с добавлением 0,5% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина в течение пяти дней (сывороточное голодание). или (3) DMEM с добавлением 10 % FBS и 1 % пенициллин-стрептомицина, содержащего актеозид в концентрации 10 мкМ, 30 мкМ или 50 мкМ в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч (обработка актеозидом).

Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии

Для анализа стадий клеточного цикла клетки собирали с использованием {{0}},25% трипсин-ЭДТА и промывали 3 раза PBS путем центрифугирования. После последней промывки супернатанты удаляли, а клетки ресуспендировали в 0,3 мл PBS. Для фиксации к клеточной суспензии по каплям добавляли {{10}},7 мл холодного абсолютного этанола, перемешивали осторожно встряхиванием и оставляли на ночь при 4°С. Фиксированные клетки центрифугировали и дважды промывали холодным PBS. Клетки ресуспендировали в 0,25 мл PBS с добавлением 5 мкл 10 мг/мл РНКазы и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем добавляли 10 мкл 1 мг/мл йодида пропидия (PI). Клеточный цикл анализировали путем количественного определения содержания ДНК в клеточных популяциях в фазах G0/G1 (2n), S (между 2n и 4n) и G2/M (4n) с использованием проточного цитометра FACS Calibur (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния). , США).

Обнаружение АФК с помощью проточной цитометрии

АФК в живых клетках оценивали с использованием набора для обнаружения активных форм кислорода Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Вкратце, клетки промывали в PBS после удаления культуральной среды и добавляли 2 мл 100 мкМ рабочего раствора трет-бутилгидропероксида (TBHP). После инкубации при 37° в течение 1 ч рабочий раствор TBHP удаляли, а клетки осторожно промывали 3 раза теплым фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS; Gibco). Затем клетки инкубировали в рабочем растворе 25 мкМ 5-(и-6)-карбокси-2,7-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетата (карбокси-H2DCFDA) при 37° в течение 30 мин в темноте. . При окислении карбокси-H2DCFDA испускает зеленую флуоресценцию, что облегчает оценку АФК с помощью проточной цитометрии. TBHP, который является индуктором продукции АФК, использовали в качестве положительного контроля. Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342. После 3-кратной промывки PBS клетки собирали путем трипсинизации, суспендировали в PBS и использовали для обнаружения АФК с помощью проточного цитометра FACS Calibur (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США). ). Скорость образования АФК рассчитывали путем деления количества АФК-положительных клеток на общее количество клеток и преобразования значений в проценты.

Анализ апоптоза методом проточной цитометрии

Анализ апоптоза проводили с использованием набора для анализа апоптоза Vybran1 № 2 (Molecular Probes, Юджин, штат Орегон, США). Вкратце, клетки собирали путем трипсинизации и дважды промывали холодным PBS. После этого к клеткам добавляли 100 мкл 1× буфера для связывания аннексина, 5 мкл Alexa Fluor 488 аннексина V и 1 мкл PI. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре добавляли 400 мкл 1× аннексин-связывающего буфера и осторожно перемешивали клеточную суспензию. Аннексин V, который является Са2+-зависимым фосфолипидсвязывающим белком, имеет высокое сродство к фосфатидилсерину (ФС). В живых клетках ФС располагается на внутренней цитоплазматической мембране, а в апоптотических клетках транслоцируется на наружную цитоплазматическую мембрану. Апоптотические клетки отличаются аннексином V, меченным Alexa Fluor 488, связывающимся с PS на внешней мембране. Кроме того, PI, краситель, связывающий нуклеиновые кислоты, окрашивает некротические клетки в красную флуоресценцию. Таким образом, апоптотические клетки с зеленой флуоресценцией, некротические клетки с красной флуоресценцией и живые клетки с незначительной флуоресценцией или без нее анализировали с использованием проточного цитометра FACS Calibur (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США). Показатели рассчитывали путем деления числа живых, некротических или апоптотических клеток на общее число клеток и преобразования рассчитанных значений в проценты.

Коллекция созревших in vivo ооцитов

Для определения овуляции у каждой собаки измеряли концентрацию прогестерона (P4) в сыворотке с использованием набора для радиоиммуноанализа DSL-3900ACTIVE progesterone Coated-tube с покрытием (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Техас, США). Как описано ранее [39, 40], днем ​​овуляции считали день, когда концентрация Р4 превышала 4 нг/мл. Через 72 часа после овуляции ооциты извлекали лапаротомией с использованием асептических хирургических процедур. К бахромке яйцевода подходили через бурсальную щель и канюлировали с помощью стальной иглы с перевернутым фланцем (калибр 18, 7,5 см). Катетер для внутривенного введения (IV) калибра 24 (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Сеул, Корея) вводили в перешеек яйцевода рядом с маточно-трубным соединением, а среду 199 (Gibco) добавляли 1% пенициллина-стрептомицина и Через внутривенный катетер в яйцевод вводили 5% FBS. Ооциты были немедленно доставлены в лабораторию. Всего было собрано 316 ооцитов от 31 собаки.

Перенос ядер соматических клеток и перенос эмбрионов SCNT выполняли, как описано ранее [39]. Вкратце, чтобы удалить клетки кумулюса из созревших in vivo ооцитов, комплексы кумулюс-ооцит (КОК) повторно пипетировали в 0,1% гиалуронидазы. Первое полярное тельце и хромосомы метафазы-II удаляли путем аспирации. Энуклеацию подтверждали окрашиванием Hoechst 33342 (бисбензимид). Фибробласты плода собаки обрабатывали 3{9}} мкМ актеозида в течение 48 часов, а затем собирали 0,25% трипсин-ЭДТА. Одну клетку с гладкой клеточной мембраной переносили в перивителлиновое пространство каждого энуклеированного ооцита. Куплеты были уравновешены инфузионной средой, которая представляет собой среду 0,26 М маннита, содержащую 0,1 мМ HEPES, 0,5 мМ MgSO4 и 0,05% BSA, и сплавлялись двумя импульсами. постоянного тока (69–75 В в течение 15 мкс) от аппарата Electro-Cell Fusion (NEPA Gene Co., Чиба, Япония). Эти пары инкубировали в среде 199 с добавлением 10% FBS в течение 1 ч 30 мин. Слитые эмбрионы SCNT проверяли и индуцировали химическую активацию путем инкубации их в 10 мкМ кальциевого ионофора (продукт № C7522, Sigma) в течение 4 мин. Эмбрионы SCNT промывали, а затем помещали в модифицированную синтетическую жидкую среду для яйцевода (mSOF) [41], содержащую 1,9 мМ 6-диметиламинопурина (6-DMAP), на 3 ч 30 мин. Сконструированные эмбрионы хирургическим путем переносили в яйцеводы суррогатных матерей, синхронизированных с эструсом, в течение 4 часов после SCNT. Беременность была подтверждена ультразвуковым исследованием через 26 дней (самое раннее) после переноса эмбрионов.

активный компонентактеозидвцистанхе

Культивирование клонированных эмбрионов in vitro

После SCNT клонированные эмбрионы культивировали в 40 мкл микрокапель модифицированной синтетической жидкой среды для яйцевода (mSOF) (10 клонированных эмбрионов на микрокаплю), покрытых минеральным маслом при температуре 38,5°С в 5% CO2 и 95% воздуха. Развитие эмбриона SCNT наблюдали со 2-х по 8-е сутки.

Анализ микросателлитной и митохондриальной ДНК клонированной собаки

Тотальную ДНК экстрагировали из ядерных донорских клеток и кожи собак-доноров ооцитов, суррогатных собак и клонированных собак с помощью набора для выделения геномной ДНК G-spin™ (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Соннам, Корея) в соответствии с рекомендациями производителя. затем элюировали 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Количество ДНК измеряли на спектрофотометре BioSpec-nano (Shimadzu Corp., Япония).

Для микросателлитного генотипирования были отобраны следующие 7 специфических генов: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 и FH2079. ПЦР проводили с начальной денатурацией в течение 10 мин при 95°, 20 циклов, состоящих из денатурации в течение 30 с при 95°, 30 с отжига при 58° ({15}}.1 град/цикл), 1 мин удлинения при 72 градуса и еще 15 циклов, состоящих из денатурации в течение 30 секунд при 95 градусах, 30 секунд отжига при 56 градусах, 1 минуты удлинения при 72 градусах и окончательного удлинения при 72 градусах в течение 10 минут.

Для секвенирования митохондриальной ДНК с использованием полных нуклеотидных последовательностей мтДНК собаки (инвентарный номер GenBank: U96639) были синтезированы следующие олигонуклеотидные праймеры: область цитохрома b (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG,R: AGTTCCGATATAAGGGATGGCAGAG; Субъединица II цитохром-с-оксидазы (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S рРНК (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT, R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Область D-петли (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Циклы ПЦР для этого анализа включали: начальную денатурацию при 95° в течение 5 мин, 5 циклов денатурации в течение 30 с при 95°, отжиг 40 с при 60° (-1 град/цикл), 1 мин удлинения при 72 градуса, и следующие 30 циклов денатурации по 30 секунд при 95 градусах, 40 секунд отжига при 55 градусах, 1 мин удлинения при 72 градусах и окончательного удлинения при 72 градусах в течение 10 мин. Фрагменты ПЦР из различных экспериментов анализировали с помощью генетического анализатора ABI Prism 3100 (Applied Biosystems Inc., США). Сборку последовательности, множественное выравнивание и обрезку выравнивания для контрольных областей выполняли с помощью программного обеспечения BioEdit (v.7.0.5.3).

актеозидвцистанхеможет повысить иммунную систему