Часть 2: Противовоспалительное, антиоксидантное, увлажняющее и антимеланогенное действие кверцетина 3-O- -D-глюкуронида в кератиноцитах человека и клетках меланомы посредством активации путей NF-κB и AP-1

Для получения более подробной информации свяжитесь сtina.xiang@wecistanche.com

Нажмите на ссылку, чтобы узнать часть 1:https://www.xjcistanche.com/news/part-1-противовоспалительное-антиоксидантное-увлажняющее-55118257.html

3. Обсуждение

В ранее опубликованных исследованиях Q-3-G использовался для подавления отека уха, перитонеальной проницаемости и отека легких [50], действуя как сильнодействующее средство.антиоксидантв плазме крови с липопротеинами низкой плотности [42], уменьшая индуцированную пероксинитритом окислительную модификацию [51], оказываяпротивовоспалительное средствоэффект путем ингибирования сигнальных путей JNK и ERK при провокации LPS [52] и обладает противоопухолевыми свойствами в отношении клеток рака молочной железы [56]. Однако, в отличие от его широко изученного исходного соединения,кверцетин, фармакологические преимущества и механизмы Q-3-G еще предстоит изучить. Насколько нам известно, роль Q-3-G в защитном воздействии на кожу до конца не выяснена. В этом исследовании, используя различные оценки in vitro, мы сосредоточились на характеристике защитного действия Q-3-G на кожу против UVB или H2O2, индуцированного окислительного стресса и воспаления, гидратации кожи в HaCaT (клеточная линия кератиноцитов человека) иантимеланогенезактивность в B16F10 (клеточная линия мышиной меланомы).

Жизнеспособность клеток HaCaT, B16F10 и HEK293T определяли после обработки Q-3-G в диапазоне нецитотоксических концентраций. Результаты показали, что не было значительного ингибирования жизнеспособности клеток HaCaT, B16F10 и HEK293T при концентрациях Q-3-Gup до 20 мкМ (рис. 2a, 3a и 4f). Было обнаружено, что жизнеспособность клеток в клетках HaCaT, B16F10 и HEK293T при концентрациях O-3-G до 20 мкМ ниже, чем концентрация кверцетина при его использовании для исследования цитотоксических эффектов при SCC{{18} } и клетки HSC-6 (50 мкМ)【57】или жизнеспособность сперматозоидов (50-100мкМ)【58】. Однако было показано, что Q-3-G гораздо менее токсичен по сравнению с его агликоном [59]. Отсутствие свободной группы ОН в третьем положении может способствовать менее токсичному действию Q-3-G [29].

Лучи UVB с длиной волны 280-315 нм проникают в верхний слой кожи и более эффективны, чем UVA и UVC[60]. Лучи UVB являются причиной большинства видов рака кожи и гибели клеток. Кроме того, было показано, что повреждение клеток в клетках HaCaT индуцируется облучением UVB [61]. Следовательно, мы исследовали жизнеспособность клеток HaCaT после облучения UVB по сравнению с обработкой Q-3-G. Как показано в предыдущих отчетах, одним из основных факторов, приводящих к повреждению клеток, тканей и органов, является воздействие УФ-В [62,63]. Q-3-G восстанавливал сниженную жизнеспособность клеток, вызванную УФ-излучением (рис. 2b-d). Показано, что результаты аналогичны предыдущему исследованию влияния и механизма УФ-индуцированной цитотоксичности в HaCaT кверцетина [64].

Нажмите на нее, чтобы получить больше информации о продуктах

Несколько исследований показали, что УФ-В может вызывать тяжелые воспалительные реакции, приводящие к проблемам с кожей [1, 2, 4, 27]. УФ-В активирует важные провоспалительные ферменты, такие как ЦОГ-2, и цитокины, такие как ФНО-. ЦОГ-2 представляет собой фермент, связанный с воспалением, который запускается провоспалительными цитокинами и медиаторами [65] и стимулирует воспалительную реакцию. Поскольку ЦОГ-2 продуцирует медиатор воспаления PGE-2, он вызывает воспалительную реакцию [66,67], а TNF- является основным провоспалительным цитокином [68] в воспалительных реакциях. Эти воспалительные реакции вызывают повреждение кожи, что приводит к ее старению [69]. Уровни экспрессии мРНК воспалительного фермента COX-2 и провоспалительных цитокинов TNF- ингибировались Q-3-G (рис. 2e). Согласно ранее опубликованным результатам, кверцетин также снижал экспрессию генов и продукцию TNF- [70]. Что касается антиоксидантных свойств, анализы удаления радикалов DPPH и ABTS являются быстрыми, надежными и воспроизводимыми методами оценки активности in vitro.антиоксидантная активностьчистых соединений и растительных экстрактов [54] и широко использовались в обычных методах для исследования очищающей активности природных соединений или экстрактов [1,46,71,72]. Было обнаружено, что Q-3-G снижает реактивность радикалов как в анализах, так и в проточной цитометрии в зависимости от концентрации. Эти результаты согласуются с ранее опубликованным исследованием, в котором Q-3-G значительно ингибировал образование АФК в клетках феохромоцитомы PC-12 [34]. Помимо химического антиоксидантного действия, мы показали, что Q-3-G увеличивает уровень Nrf2, одного из важных регуляторов окислительного стресса в клетках. Сообщалось, что несколько соединений или природных экстрактов обладают антиоксидантными свойствами посредством Nrf2-зависимой передачи сигналов ARE [46,73,74]. В совокупности эти данные указывают на то, что Q-3-G обладает антиоксидантной активностью (рис. 2g-j). Меланосома из синтеза меланина возникает во внутриклеточных органеллах [75-77]. Перепроизводство меланина может повлиять на внешний вид кожи и кожные заболевания, связанные с гиперпигментацией. Мы обнаружили, что обработка O-3-G клеток B16F10, индуцированных c-MSH, подавляла секрецию меланина. Как и в предыдущих работах, внутриклеточный меланогенез также контролируется метаболитами кверцетина и некоторыми кверцетин-3-O- -D-глюкопиранозидами [24,78,79].

Поддержание здоровой кожи требует адекватной гидратации кожи, и НМФ и ГК играют важную роль в этом процессе [12]. FLG является составной частью кожного барьера, поэтому повышенный уровень экспрессии FLG может быть связан с увлажнением [80]. В нашем исследовании было обнаружено, что Q-3-G влияет на активность удержания влаги в коже за счет увеличения FLG и TGM-1 (рис. 3c, d). Уровни экспрессии FLG и TGM-1 блокировались ингибиторами JNK, IKK и IkBa (SP600125 и Bay11-7082 соответственно). Мы сосредоточились на ферментах, связанных с MAPK, поскольку наши исследования были направлены на определение молекулярных механизмов, с помощью которых Q-3-G оказывает защитное действие на кожу. JNK играет важную роль в апоптозе кератиноцитов, вызванном окислительным стрессом [81]. Фосфорилирование c-Jun, TAK1, MKK4 и INK увеличивалось под действием Q-3-G. Кроме того, ретинол не вызывал значительного увеличения фосфорилирования c-Jun, TAK1, MKK4 или JNK, что свидетельствует о некоторых различиях в ингибирующих характеристиках между Q-3-G и ретинолом в передаче сигналов AP-1. путь. Как и в ранее опубликованных результатах, путь JNK-c-Jun/AP-1 коррелирует с антиапоптотическим эффектомкверцетин[82]. По сравнению с предыдущим исследованием [83], было обнаружено, что путем регуляции сигнальных путей NF-kB и AP-1 эти пути также участвуют в основном механизме кверцетина. В соответствии с механизмом его исходного соединения, наши результаты показывают, что путь NF-kB также был включен в защитный эффект Q-3-Ga за счет активации p50, p65, IKK, IkB, Akt и Src. после обработки Q-3-G в клетках HaCaT. Кроме того, Q-3-G активировал AP-1-опосредованную активность Luc и NF-B-Luc (рис. 4). Эти данные свидетельствуют о том, что MAPK-опосредованная передача сигналов AP-1 и NF-kB способствует Q-3-G-опосредованным защитным свойствам кожи.

4. Материалы и методы

4.1. Материалы

Q-3-G был получен от Sigma Aldrich Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Клетки HaCaT, HEK293T и B16F10 были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд, США). Диаммониевая соль ABTS, DPPH, аскорбиновую кислоту (АК), ABTS и ретинол приобретали у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Фетальную бычью сыворотку (FBS), модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) и фосфатно-солевой буфер (PBS) приобретали у Gibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США).3-(4-5-Диметилтиазол{{ 7}}ил)-25-дифенилтетранатрийбромид (МТТ) был приобретен у Amresco (Брисбен, Австралия). TRILzol и премикс для ПЦР были приобретены у Bio-D Inc. (Сеул, Корея). Наборы для синтеза кДНК были приобретены у Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Прямые и обратные праймеры для ПЦР (полимеразной цепной реакции) были синтезированы компанией Macrogen, Inc. (Сеул, Корея). Все антитела, относящиеся к фосфорилированной или тотальной формам целевого белка, были приобретены у компании Cell Signaling Technology (Беверли, Массачусетс, США).

4.2. Клеточные культуры

Клетки HaCaT и B16F10 культивировали в DMEM с 10% FBS и 1% антибиотиков (стрептомицин и пенициллин). Клетки HEK293T культивировали в среде DMEM с 5% FBS и 1% антибиотиков. Эти клеточные линии инкубировали в 5% СО при 37°С.

4.3. Тесты на жизнеспособность клеток

Клетки B16F10 высевали по 2×10 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в течение 24 ч, к ним добавляли различные концентрации Q-3-G (0-20 мкМ) и затем их инкубировали в течение 48 часов. Клетки HaCaT высевали в 96-луночные планшеты и высевали при концентрации 6×10 градусных клеток/мл. После ночной инкубации клетки инкубировали с различными концентрациями Q-3-G (0-20 мкМ) в течение 24 часов. Клетки HEK293T высевали при 6×10 градусных клеток/мл в 96-луночные планшеты в течение 24 часов, а затем обрабатывали Q-3-G (0-20 мкМ). Инкубированные клетки обрабатывали 10 мкл/лунку раствора МТТ, а через 3 часа обрабатывали 100 мкл останавливающего раствора МТТ. Используя обычный МТТ-анализ для измерения жизнеспособности клеток [84], измеряли оптическую плотность при 570 нм с помощью ридера (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA).

4.4. Анализ мРНК с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени

Клетки HaCaT обрабатывали Q-3-G (5-30 мкМ) или ретинолом (10 мкг/мл) в течение 12 часов. РНК осаждали с использованием реагента TRI, как сообщалось ранее [85]. Для синтеза комплементарной ДНК использовали набор для синтеза кДНК. ОТ-ПЦР проводили с использованием специфических обратного и прямого праймеров. Праймеры для ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени перечислены в таблице 1.

4.5. Анализ DPPH

Для оценки способности Q-3-G поглощать радикалы использовали анализ DPPH. Метанол использовали для растворения DPPH до конечной концентрации 250 мкМ. Затем было добавлено 475 мл DPPH.

реагировал с 5 мл Q-3-G (0-40 мкМ) или AA (500 мМ) при 37 градусах в течение 30 мин. Положительным контролем был АА. Определение эффекта удаления DPPH и расчет выполняли, как описано ранее [86].

4.6. Анализ ABTS

Анализ ABTS был выполнен, как сообщалось ранее [72]. Вкратце, равные объемы 7,4 мМ раствора ABTS и 2,4 мМ раствора персульфата калия смешивали и выдерживали при комнатной температуре в течение ночи для образования катион-радикалов ABTS. Растворы ABTS добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов с добавлением Q-3-G (0-40 мкМ) или АК (500 мМ) на лунку. Смеси инкубировали при 37°С в течение 30 мин, а затем измеряли их оптическую плотность при 730 нм.

4.7. Анализ клеточных АФК с помощью проточной цитометрии

Для проверки образования внутриклеточных АФК использовали чувствительный к окислению краситель 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (DCFDA). Клетки HaCaT подвергали воздействию УФ-излучения, а затем клетки собирали и ресуспендировали с 300 мкл PBS с 20 мкМ DCFDA в течение 30 минут при 37 градусах в темноте. Затем клетки промывали PBS и измеряли флуоресценцию при 485/535 нм с помощью проточного цитометра Beckman CytoFLEX (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США).

4.8. Вестерн-блот анализ

Клетки HaCaT высевали при плотности 6×10 градусных клеток/мл. После инкубации в течение ночи добавляли различные концентрации Q-3-G (0-10 мкМ) или ретинола (10 мкг/мл) и дополнительно инкубировали в течение 24 часов. Приготовление белков и лизатов цельных клеток проводили, как описано ранее [87]. Специфические антитела использовали для выявления тотальной формы и фосфорилированной формы Jun, JNK, MKK4, TAK1, p50, p65, IKK, IkB, Src и Akt, которые визуализировали с помощью хемилюминесцентных реагентов [88].

4.9. Содержание меланина и анализ секреции

Клетки B16F10 высевали при плотности 2×10 градусных клеток/мл в 12-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи. Культуральную среду заменяли на свежую среду с добавлением Q-3-G (10-20 мкМ) или арбутина (1 мМ). Продукцию меланина стимулировали альфа-МСГ (100 нМ) в течение 48 часов. Для анализа секреции меланина измеряли оптическую плотность при 475 нм. После этого клетки собирали для определения содержания внутриклеточного меланина с использованием лизирующего буфера для лизиса клеток и осаждения их центрифугированием (12, 000 об/мин, 5 мин). Концентрированные осадки клеток растворяли в 100 мл растворяющего буфера (1 М NaOH, 10% ДМСО) и плавили при 55°С. Поглощение измеряли при 405 нм с помощью считывателя оптической плотности [89].

4.10.УФ-излучение

Клетки HaCaT высевали при плотности 1×105 клеток/мл в 6-луночные планшеты с использованием МЕМ без сыворотки и подвергали 24-часовому голоданию. Клетки HaCaT предварительно обрабатывали G-3-Q в течение 30 мин, а затем облучали УФ-В. Затем клетки HaCaT промывали PBS и подвергали УФ-облучению (UVBLamp BLX-312, Vilber Lourmat, Франция). Энергия УФВ облучения составила 30 мДж/см2²【90】.

4.11.Обработка H2O2

Клетки HaCaT высевали в 6-луночные планшеты и подвергали 24-часовому голоданию с использованием MEM без сыворотки. Клетки предварительно обрабатывали различными концентрациями Q-3-G（5-10 мкМ и через 30 мин инкубировали с H2O2 （500 мкМ） в течение 12 ч.

4.12. Анализ репортерного гена люциферазы

Клетки HEK293T высевали при плотности 3×10 градусных клеток/мл в 24-луночные планшеты. Клетки HEK293T переносили 2 мкг плазмид, содержащих AP-1-Luc или NF-kB-Luc и b-галактозидазу, используя полиэтиленимин[91]. Через 24 часа инкубации клетки обрабатывали Q-3-G (5-10 мкМ) или ретинолом (10 мкг/мл) в течение еще 24 часов. Анализ люциферазы проводили с помощью люминометра при измерении оптической плотности каждого образца при 475 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов Spectramax 250 (Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния, США), как сообщалось ранее [92].

4.13. Съемка клеточной морфологии

Клетки HaCaT высевали в 6-луночные планшеты при плотности клеток 1×10 градусных клеток/мл. Клетки HaCaT обрабатывали G-3-Q в течение 30 минут, а затем облучали УФ-В. Через 24 часа были сделаны фотографии объектива микроскопа 4×, 10× и 20× (Olympus, Токио, Япония).

4.14. Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение по крайней мере трех независимых экспериментов. Критерий Манна-Уитни и t-критерий Стьюдента использовали для сравнения статистических различий между группами. P-значение<0.05 was="" regarded="" as="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" spss(ver.25,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

5. Выводы

Наше исследование показало, что противовоспалительная и антиоксидантная активность Q-3-G защищает от факторов окислительного стресса и воспаления при воздействии УФ-В и HO. Мы также продемонстрировали, что Q-3-G обладает способностью стимулировать увлажнение клеток HaCaT. В дополнение к эффекту Q-3-G против меланогенеза было показано, что он ингибирует секрецию меланина в -MSH-индуцированном B16F10. Наконец, эффект Q-3-G был опосредован через активацию сигнальных путей AP-1 и NF-kB. Кожно-защитная активность Q-3-G в клетках кератиноцитов человека HaCaT и клетках мышиной меланомы B16F10 представлена ​​на рисунке 5. Это исследование показало, что Q-3-G может быть эффективным из-за его противовоспалительного, антиоксидантные, увлажняющие и антимеланогенные свойства в кератиноцитах и ​​клетках меланомы человека посредством активации путей NF-kB и AP-1. В заключение, результаты ясно показывают, что этот конъюгированный метаболит обладает потенциалом для защиты клеток кожи. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения эффекта Q-3-G в различных моделях in vivo, особенно в отношении моделей защиты кожи.

использованная литература

1. Ким, Э.; Хван, К.; Ли, Дж.; Хан, С.Ю.; Ким, Э.-М.; Парк, Дж.; Чо, Дж. Ю. Защитный эффект галлата эпигаллокатехина на кожу. Междунар. Дж. Мол. науч. 2018, 19, 173. [Перекрестная ссылка]

2. Драэлос З.Д. Новые средства для восстановления нарушенной проницаемости эпидермального барьера: кремы для восстановления кожного барьера. клин. Дерматол. 2012, 30, 345–348. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

3. Сломинский А.Т.; Змиевский, Массачусетс; Збайтек, Б .; Тобин, ди-джей; Теохаридес, ТЦ; Ривье, Дж. Ключевая роль CRF в системе реакции кожи на стресс. Эндокр. 2013, 34, 827–884. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

4. Д'Орацио, Дж.; Джарретт, С.; Амаро-Ортис, А .; Скотт Т. УФ-излучение и кожа. Междунар. Дж. Мол. науч. 2013, 14, 12222–12248. [Перекрестная ссылка]

5. Ритти Л.; Fisher, GJ Сигнальные каскады, индуцированные УФ-светом, и старение кожи. Старение рез. 2002, 1, 705–720. [Перекрестная ссылка]

6. Видейра, И.Ф.; Моура, Д. Ф.; Магина С. Механизмы регуляции меланогенеза. Ан. Бюстгальтеры. Дерматол. 2013, 88, 76–83. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

7. Че Д.Н.; Се, GH; Чо, БО; Шин, JY; Канг, Х.Дж.; Джанг, С.И. Защитное действие экстракта виноградных стеблей на кожу мышей C57BL от УФ-индуцированного повреждения. Дж. Фотохим. Фотобиол. Б 2017, 173, 551–559. [Перекрестная ссылка]

8. Чон, Д.; Ли, Дж.; Чон, С.Г.; Хонг, Ю.Х.; Ю, С .; Хан, С.Ю.; Ким, Дж. Х.; Ким, С .; Ким, Дж. С.; Чанг, Ю.С.; и другие. Этаноловый экстракт полыни азиатской проявляет активность против фотостарения. Ж. Этнофармакол. 2018, 220, 57–66. [Перекрестная ссылка]

9. Макдэниел, Д.; Фаррис, П.; Валакки, Г. Атмосферное старение кожи: факторы и ингибиторы. Дж. Космет. Дерматол. 2018, 17, 124–137. [Перекрестная ссылка]

10. Рао, резюме; Пал, С .; Мохаммед, А .; Фаруки, М .; Дошер, член парламента; Аш, А.С.; Yamada, HY Биологические эффекты и эпидемиологические последствия воздействия мышьяка, а также реагенты, которые могут ослабить повреждения мышьяком in vivo. Онкотаргет 2017, 8, 57605–57621.

11. Синха, К.; Дас, Дж.; Пал, ПБ; Сил, П.С. Окислительный стресс: митохондриально-зависимый и митохондриально-независимый пути апоптоза. Арк. Токсикол. 2013, 87, 1157–1180. [Перекрестная ссылка]