Часть 2: Кальпастатин предотвращает опосредованное ангиотензином IL повреждение подоцитов за счет поддержания аутофагии

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 1

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 3

Angel plus HSD активирует активность калпаина в подоцитах, что способствует блокаде аутофагии.

Поскольку было обнаружено, что активность кальпаина (i) активируется Angel в нескольких типах клеток и (ii) расщепляет несколько белков, связанных с аутофагией, мы задались вопросом, может ли AngII плюс HSD-опосредованная блокада аутофагии быть связана с повышенной Angl-индуцированной активностью кальпаина. Сначала мы обнаружили, что первичные подоциты экспрессируют 3 вездесущие формы кальпаинов (рис. 3а). Затем мы показали, что AngII стимулирует активность кальпаина в первичных подоцитах. Это повышение активности кальпаина блокировалось селективным ингибитором кальпаина (рис. 3b). Мы использовали нокаут-мыши с дополнительной экспрессией трансгена кальпастатина (что приводило к снижению активности кальпаина) для оценки роли кальпаинов в AngII плюс HSD-опосредованномпочкаранаи блокада аутофагии. Первичные подоциты мышей CST'g показали снижение активности калпаина в ответ на AngII по сравнению с подоцитами контрольных мышей (рис. 3с). Таким образом, сверхэкспрессия кальпастатина в подоцитах снижала AngII-опосредованную активацию кальпаина.

Цистанхетрубчатыйимеет многопоследствия, Нажмите здесь, чтобы узнать больше

Затем мы оценили уровни аутофагии в подоцитах мышей CSTTg. Мы создали мышей CST с трансгеном GFP-LC3. LC3-Репортер GFP разрешил подсчет аутофагосом как GFP плюс/P62 плюс точки. P62 будет накапливаться агрегатами в клетках, когда аутофагический поток блокируется. В исходном состоянии мы насчитали меньше точек GFP плюс P62 плюс (рис. 4a, b и e) и меньше накопления P62 (рис. 4c, d и f) в подоцитах мышей CST1g GFP-LC3, чем в подоцитах нормальных

Рисунок 4|Оценка потока аутофагии в подоцитах мышей, трансгенных по кальпастатину (CST9). ( a, b ) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) (зеленый) и P62 (красный) в клубочках мышей 12- недельного возраста GFP-LC3 и CST'GFP-LC3. Стрелки указывают GFP плюс P62 плюс аутофагосомы. ( c, d ) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения экспрессии P62 (зеленый) и подокаликсина (PODXL; красный) в клубочках мышей 12- недельного возраста GFP-LC3 и CST'9 GFP-LC3. Части рисунка со штрихом обозначают большее увеличение. Ядра окрашивали Hoechst （синим）. Полосы=50 мкм. (e) Количественное определение количества точек LC3 плюс P62 плюс на подоцит. Тест Манна-Уитни: **P=0.0065. (f) Количественная оценка площади P62 плюс на срез клубочка. Критерий Манна-Уитни: *P= 0.0420.In(e,f), n =5 мышей GFP-LC3 и n =8 мышей CST'9 GFP-LC3. Представлены значения как отдельные графики и среднее значение ± SEM. Чтобы оптимизировать просмотр этого изображения, см. онлайн-версию этой статьи на мышах GFP-LC3, предполагающую повышенный поток аутофагии в подоцитах мышей с высоким содержанием кальпастатина.

Аутофагический поток можно отслеживать путем измерения превращения цитоплазматической формы LC3, LC3-I, в аутофагосомно расщепленную и связанную с фосфатидилэтаноламином форму LC3, LC3-II, на вестерн-блоттинге. . Подоциты мышей CST показали повышенную конверсию LC3-I в LC3-II и снижение экспрессии P62 как в присутствии, так и в отсутствие бафиломицина А (рис. 5a и b), что указывает на усиление потока аутофагии. в подоцитах со сверхэкспрессией кальпастатина. Наконец, накопление точек GFP плюс P62 плюс в подоцитах после введения хлорохина было более важным у мышей CST'g GFP-LC3, чем у мышей GFP-LC3, что подтверждает, что сверхэкспрессия кальпастатина вызывает аутофагический поток в подоцитах in vivo (рис. 5c). -е). В целом, наши данные свидетельствуют о том, что AngII стимулирует активность кальпаина в подоцитах, что аутофагия ингибируется кальпаином в подоцитах и ​​что ингибирование эндогенной активности кальпаина сверхэкспрессией кальпастатина достаточно для стимуляции аутофагического потока в подоцитах.

Мыши CSTT9 защищены от повреждения подоцитов, вызванного Angel plus HSD

CSTT: мыши не показали никакихпочкаизменение до возраста не менее 12 месяцев (дополнительный рисунок S5). Мы проанализировали повреждение подоцитов у мышей CST'号 во время лечения AngII плюс HSD. Хотя у мышей WT развился легкий гломерулосклероз и повреждение подоцитов после 4 недель гипертензии, о чем свидетельствует аномальная экспрессия подокаликсина и нефрина, у мышей CSTTg было меньше склеротических гломерулярных поражений (рис. 6a).

Рисунок 5|Блокирование аутофагосомной деградации подтвердило увеличение потока аутофагии подоцитов у мышей, трансгенных кальпастатину (CSTT). (а) Вестерн-блот-анализ экспрессии LC3. Секвестосома 1 (SOSTM1)/P62 и ATG5 в первичных подоцитах мышей дикого типа (W или CST'9). Экспрессия тубулина служит нормализацией. Подоциты обрабатывали или не обрабатывали бафиломицином A1 (BafA1; 100 нМ) в течение 4 часов перед культивированием. (b) Количественное определение соотношений LC3-II/'тубулин и P62/тубулин.n=10 мышей WT и n =8 мышей CST'9. Значения представлены в виде отдельных графиков и среднее значение ± стандартная ошибка среднего.Двусторонний дисперсионный анализ в паре для лечения: для LC3-II/тубулина: генотип, P= 0,0008; лечение, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">почка-international.org.

Рисунок 6|Сверхэкспрессия кальпастатина предотвращает повреждение подоцитов, опосредованное ангиотензином II (Angel) и диетой с высоким содержанием соли (HSD). (а, б)

Цистанхеможет облегчитьБолезнь почек

Репрезентативные изображения срезов клубочков, окрашенных трихромом по Массону, от мышей дикого типа (WT и трансгенных кальпастатина (CST'9) мышей после 6 недель лечения Angll плюс HSD. Bars =50 um. (c, d, f, g) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения экспрессии (c, d) подокаликсина (PODXL) и (f, g) нефрина (NPHS1) у мышей WT и CST'9 после 6 недель применения Angel plus HSD и (e, h) связанных количественных оценок. {8}} мм (ii)

цистанхеможно лечитьострая почечная недостаточность

Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения экспрессии опухоли Вильмса 1 (WT1; зеленый) и PODXL (красный) в клубочках мышей WT и CST' после 6 недель введения Angel plus HSD и (k) связанная количественная оценка количества клеток WT1 plus на клубочек раздел. Ядра окрашивали Hoechst (синий).Bars =50 мкм. В (e, h, k) значения представлены в виде отдельных графиков и среднего значения ± SEM, n =9 мышей WT и n =7 мышей CSTTg. Непарный t-критерий с одинаковым стандартным отклонением: **P =0,0095 дюйма (д), * ​​P=0,0249 дюйма (h), P=0,7891 дюйма (k).

и b) и сохраненная экспрессия подокаликсина и нефрина (рис. 6c-h). Такие различия в фенотипе подоцитов наблюдались на стадии, когда плотность ядер подоцитов не отличалась между мышами WT и CST'g с гипертензией (фиг. 6i-k).

Точно так же после 6 недель гипертонии у мышей GFP-LC3 и CST'1 GFP-LC3 наблюдалось повреждение подоцитов, но повреждения были более заметными у мышей GFP-LC3 (рис. 7). Отношение альбумина к креатинину в моче было выше у мышей GFP-LC3 после 4 недель приема AnglI плюс HSD (рис. 7а). Количество подоцитов не отличалось между 2 генотипами, но экспрессия нефрина была значительно больше снижена у мышей GFP-LC3 (контроль) (рис. 7b-e). Ультраструктурный анализ, коррелирующий с защитой, опосредованной кальпастатином, показал легкое и локальное сглаживание отростка ножки подоцита у мышей GFP-LC3, получавших Angl плюс HSD, с лучшим сохранением сглаживания отростка ножки у мышей CST'g, хотя глобальная количественная оценка количества отростков стопы на длину клубочковой базальной мембраны (GBM) статистически не различались, скорее всего, потому, что повреждение подоцитов в нашей модели является очаговым и сегментарным (рис. 7f-h). Следует отметить инфильтрацию макрофагов и Т-лимфоцитов впочкимежду группами не различались (дополнительная фигура S6). В совокупности эти результаты показали, что кальпастатин предотвращает повреждение подоцитов, вызванное AngII и HSD.

Сверхэкспрессия кальпастатина восстанавливает поток аутофагии в подоцитах мышей после лечения Ангелом плюс HSD

Наконец, мы задались вопросом, связана ли кальпастатин-опосредованная защита клубочков в модели AngII плюс HSD с поддержанием аутофагии в подоцитах. Интересно, что индуцированное AnglI плюс HSD накопление P62 в подоцитах было предотвращено у мышей CSTTg и GFP-LC3 CST'g (рис. 8a-d), что указывает на то, что кальпастатин предотвращает блокаду аутофагии подоцитов. Следует отметить, что количество GFP плюс P62 плюс точки, маркирующие аутофагосомы, было одинаковым в подоцитах гипертензивных мышей GFP-LC3 и GFP-LC3 CST, что позволяет предположить, что AnglI плюс HSD вызывает замедление аутофагического потока подоцитов, а не полную остановку. (Рисунок 8e-g).

Предсказание in silico сайта расщепления кальпаина в белках подоцитов

Мы использовали несколько инструментов in silico для прогнозирования потенциальных целей кальпаина в подоцитах (дополнительные таблицы S1 и S2). Сравнивались три онлайновые базы данных: GPS-CCD, 4CaMPDB, 5 и DeepCalpain. степень Анализ in silico идентифицировал несколько белков подоцитов, среди них нефрин и подоцин, которые могли быть расщеплены кальпаинами. Таким образом, опосредованная кальпастатином защита клубочков может быть связана со снижением ферментативной активности кальпаина, что приводит к уменьшению деградации некоторых белков подоцитов.

Более того, по крайней мере 3 связанных с аутофагией белка являются прямыми мишенями кальпаинов. ATG5 расщепляется кальпаинами, что приводит к нарушению образования комплекса ATG12-ATG5.57 Введение ингибиторов кальпаина in vivo также предотвращало расщепление белка аутофагии Beclin-1. предполагаемый сайт расщепления белков, связанных с аутофагией, подтверждает гипотезу, что кальпаин может регулировать аутофагию посредством ферментативного расщепления белков аутофагии.

Экспрессия мРНК маркеров эндоплазматического ретикулума (ER) и окислительного стресса в клубочках мышей, получавших Angll плюс HSD

Мы оценили стресс эндоплазматического ретикулума (ER) и окислительный стресс с помощью количественной ПЦР в клубочках во время лечения AngII плюс HSD (таблица 1). На исходном уровне мы не наблюдали каких-либо изменений в экспрессии мРНК анализируемых генов у мышей glomeruli5loxlox (дополнение от WT и Nphs2.cre Atg5, рисунок S7). Через 6 недель гипертензии клубочки Nphs2. Мыши cre Atg5loxlox показали разные профили мРНК генов путей стресса ER и окислительного стресса с повышенной экспрессией Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl и Hsp90b1 по сравнению с клубочками WT, что позволяет предположить, что истощение аутофагии в подоцитах способствует AngII плюс HSD-индуцированный ER стресс и окислительный стресс. Наоборот, в клубочках мышей CST наблюдалось подавление нескольких генов путей стресса ER и окислительного стресса, а также снижение экспрессии некоторых проапоптотических генов (рис. 9).

Взятые вместе, эти результаты показывают, что сверхэкспрессия кальпастатина может предотвратить повреждение клубочков за счет снижения AngII плюс HSD-индуцированного ER и окислительного стресса.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что при гипертензии, вызванной AngII плюс HSD, аутофагия подоцитов заметно подавляется. Кроме того, мыши со специфичной для подоцитов делецией Atg5 были более склонны к гломерулосклерозу, индуцированному AngI плюс HSD, и потере подоцитов, что показывает, что аутофагия в подоцитах предотвращает развитие гипертонической нефропатии, подчеркивая критическую роль аутофагии в подоцитах, индуцированных Angl плюс HSD. рана. Мало что известно о внеклеточных стимулах, которые регулируют клеточную аутофагию, и эти результаты проливают свет на патофизиологическую регуляцию аутофагии подоцитов с помощью AngII.

При большинстве гломерулопатий человека стирание ножки подоцита является признаком гломерулярного повреждения, приводящего к протеинурии. Аутофагия, вероятно, играет важную роль в поддержании функции подоцитов, поскольку эти терминально дифференцированные клетки демонстрируют высокие показатели аутофагии даже в отсутствие стресса. Предыдущее исследование показало, что Angi способствует аутофагии за счет образования активных форм кислорода в условно иммортализованной клеточной линии мышиных подоцитов. 5 Производство активных форм кислорода действительно является общим индуктором аутофагии во многих типах клеток, и причины такого несоответствия с нашими выводы неясны. В отличие от этого последнего исследования, мы использовали мышиные первичные культивируемые подоциты, сохраняющие экспрессию подоцина и нефрина, и подходы in vivo, а не мышиные клеточные линии. Мы подтверждаем предыдущие сообщения о том, что постмитотические подоциты демонстрируют необычно высокий уровень конститутивной аутофагии. Измерение повышенного количества LC3-II после стимуляции AngII в присутствии или в отсутствие лизосомальных ингибиторов необходимо для определения

увеличивается или блокируется аутофагический поток. Предыдущие исследования игнорировали это явление.

Здесь мы использовали гипертоническую модель, основанную на перфузии AnglI и HSD. Подоциты имеют рецепторы ATI и подвергаются воздействию свободных отфильтрованных пептидов, таких как AngII1, 6, 26, 61-6 Предполагается, что наблюдаемые ренопротекторные эффекты ингибирования РААС могут быть, по крайней мере частично, обусловлены блокадой этого подоцита. -специфическая РААС. Аналогично, исследования in vivo

Цистанхеможет облегчитьБолезнь почек