Часть 2 Химическая и генетическая дискриминация Cistanches Herba на основе UPLC-QTOF/MS и ДНК-штрихкодирования

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

OPLS-DA и идентификация маркеров. Чтобы идентифицировать потенциальные химические маркеры для различения двух видов, был создан S-график OPLS-DA (рис. 3). На S-графике каждая точка представляет одну ионную пару tR–m/z. Оси X и Y представляют вклад и достоверность иона соответственно; чем дальше точка ионной пары tR–m/z от нуля, тем больше вклад/достоверность этого значка в разницу между двумя группами. Таким образом, ион tR–m/z, указывающий на два конца буквы «S», представляет характерные маркеры с наибольшей достоверностью в каждой группе. Результаты OPLS-DA показали, что UPLC-QTOF/MS можно использовать для различенияЦистанхе пустыняизЦистанхе трубчатая(рис. 3). Всего было определено шесть достоверных и значимых маркеров для облегчения различения этих групп (таблица 3). Идентичности трех потенциальных маркеров были предварительно определены. Компоненты, коррелирующие с этими тремя ионами, были предварительно идентифицированы как изомеры камнеозида II, цистанозида С и цистанозида А. Маркерные соединения а, b и с можно использовать для различения двух видов растений, поскольку интенсивность ионов а и b вЦистанхе пустынябыло выше, чем вЦистанхе трубчатая(рис. 4А, 4Б), а маркер с можно было обнаружить вЦистанхе трубчатая, но не вЦистанхе пустыня(рис. 4С).

ДНК-штрихкодирование: информация о последовательности и эффективность идентификации

Информация о последовательности показана в таблице 4. Среднее генетическое расстояние psbA-trnH (0.1732) было больше, чем в двух других регионах (0.0740. , 0,1197) значительно. Среднее содержание psbA-trnH в GC (20,64%) было меньше, чем в двух других регионах (55,00 процентов, 55,00 процентов). Хотя в этом исследовании не было получено успешности ITS и ITS2, область psbA-trnH показала хорошие результаты в ПЦР-амплификации и секвенировании (100 процентов, 87,23 процента). Эффективность идентификации была достигнута с помощью анализа BLAST1 и метода ближайшего расстояния и в основном отражала вероятность успеха штрих-кодов. Область psbA-trnH явно превосходила два других штрих-кода по эффективности идентификации на основе двух методов. Нехватка последовательностей, скорее всего, является причиной того, что область ITS показала 100-процентную эффективность идентификации по методу BLAST1 и 0 по методу ближайшего расстояния.

Анализ генетической дивергенции по шести параметрам

Шесть параметров использовались для анализа внутривидовой изменчивости и межвидовой дивергенции с использованием трех штрих-кодов (таблица 5). Значительная разница между межвидовыми и внутривидовыми вариациями указывала на полезность штрих-кодов ДНК. Здесь минимальное межвидовое расстояние трех штрих-кодов было выше, чем максимальное внутривидовое расстояние. Кроме того, область psbA-trnH имела большее максимальное внутривидовое расстояние и среднее межвидовое расстояние, чем два других штрих-кода, что указывает на то, что область psbA-trnH показала хорошие результаты в различении двух источников Cistanches Herba.

Анализ пробелов штрих-кода для выявления

Цистанхе пустыняа такжеЦистанхе трубчатыйРазрыв в штрих-кодировании представляет замечательную вариацию межвидовых и внутривидовых признаков и демонстрирует отдельные, неперекрывающиеся распределения между внутривидовыми и межвидовыми образцами. В этом исследовании (рис. 5) диапазон расстояний был установлен в 0–0.45, поскольку наибольшее расстояние K2P psbA-trnH междуЦистанхе пустыняа такжеЦистанхе трубчатыйбыл близок к 0.45. Три штрих-кода показали отчетливые пробелы в распределении внутри- и межвидовой изменчивости. Кроме того, разрыв psbA-trnH был значительно больше, чем у двух других штрих-кодов. Следовательно, область psbA-trnH может быть идеальным штрих-кодом для различения двух источников происхождения вируса.ЦистанхиХерба.

Дерево присоединения к соседям (NJ)

Дерево Нью-Джерси иллюстрирует взаимосвязь между видами и облегчает определение их кластеризации. В этом исследовании дерево NJ из трех штрих-кодов было построено на основе модели K2P (рис. 6). Результаты показали, что два происхождения Cistanches Herba сгруппированы в две клады по отдельности. Таким образом, дерево NJ четко различаетЦистанхе пустыняа такжеЦистанхе трубчатый.

Обсуждение и выводы

Cistanches Herba является важным лекарственным материалом, обычно используемым для питания азиатского сообщества [38]. Однако два источникаЦистанхиХерба, Цистанхе пустыняа такжеЦистанхе трубчатый, имеют различный химический состав и фармакологическую активность соответственно. В то же время эти два происхождения различаются по клиническому применению и рынку сбыта. Классификация цистанхе запутана, и рынок наводнен массовыми заменителями и примесями из-за нехватки ресурсов и особых условий выращивания цистанхе травы. Род Cistanche принято включать четыре вида и один вариант:Цистанхе пустыня, Цистанхе трубчатый, Цистанхе китайский, Цистанхе сальса, а такжеЦистанхесальсавар. альбифлора [39]. Японские исследователи считают происхождениеЦистанхиХерба какЦистанхе сальса[40–43], в то время как он был идентифицирован какЦистанхе пустыняпо Ту [44–46]. Поэтому в классификации Cistanche путают, и трудно различить два происхождения Cistanches Herba. Традиционными методами контроля качества Cistanches Herba являются морфологическая идентификация [47,48], микроскопическая идентификация [49] и ТСХ (тонкослойная хроматография) [50,51], FTIR (инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье) [14], ВЭЖХ (высокая Эффективная жидкостная хроматография) [52,53]. Морфологический и микроскопический метод позволяет легко дифференцировать виды из разных родов или семейств, обладающих большими различиями в морфологических и микроскопических характеристиках, в то время как различить родственные виды трудно. ТСХ и ИК-Фурье могут четко различать виды, обладающие разным химическим составом, в то время как определить химический компонент и содержание затруднительно. ВЭЖХ в основном используется для дифференциации видов с различным содержанием химических элементов, тем не менее, время анализа больше, а чувствительность относительно ниже по сравнению с УЭЖХ. Соответственно, технология UPLC-QTOF/MS была быстрее и точнее в определении химического состава, чем другие химические методы. Методы молекулярной идентификации хорошо проявляют себя в различении на основе генетической изменчивости, например SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) [54], AFLP (полиморфизм длины амплифицированного фрагмента) [55,56]. Однако эти молекулярные методы непросты в эксплуатации и не универсальны. Соответственно, ДНК-штрихкодирование может распознавать виды более универсально, быстро и точно, чем другие молекулярные методы. Для видов одного рода и близкого генетического родства одни только эти методы могут не сработать при идентификации.

Здесь мы объединили UPLC-QTOF/MS и штрих-кодирование ДНК для идентификацииЦистанхе пустыняа такжеЦистанхе трубчатыйи оценили химические и молекулярные маркеры, которые позволили бы их различать. Было обнаружено 23 квалифицированных масс-пика, а 16 были идентифицированы с помощью UPLC-QTOF/MS, и впервые были обнаружены три потенциальных маркерных соединения, которые облегчают различение двух источников с помощью анализа PCA и OPLS-DA. Кроме того, четыре показателя были оценены с помощью технологии штрих-кодирования ДНК с точки зрения их способности различать два происхождения: эффективность идентификации, генетическая эффективность, пробел в штрих-кодировании и анализ дерева Нью-Джерси. Область psbA-trnH использовалась в качестве подходящего штрих-кода ДНК для различенияЦистанхе пустыняа такжеЦистанхе трубчатый. В заключение, мы впервые установили новый комбинированный метод молекулярного и химического анализа для различения и контроля качества двух источников Cistanches Herba. Штрих-кодирование ДНК может различать два источника генетической изменчивости и универсально и точно аутентифицировать виды; Технология UPLC-QTOF/MS позволяет анализировать химический состав для быстрой и точной оценки качества лекарственных материалов. Комбинированный метод штрих-кодирования ДНК и технология UPLC-QTOF/MS гарантируют более точную и научную идентификацию в нескольких источниках лекарственных материалов и могут служить методом для идентификации других запутанных видов или родов в классификации.

Вклад автора

Задумал и спроектировал эксперименты: ЛФХ ШЗ ЛБВ. Выполнены опыты: ШЗ LBW. Проанализированы данные: ШЗ LBW. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа: LFH. Написал статью: SHZ XJ LBW. Проверьте рукопись: ZHW.

Цистанхе пустынная имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

использованная литература

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY и др. (1996) Сравнение питающей почки и укрепляющей Ян эффективности трех различных видовтравацистанхи. Журнал китайских лекарственных материалов 19: 420–421.

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Сравнение функций питания почек и усиления Ян трех разных видовтравацистанхи. Китайский журнал китайской Materia Medica 19: 169–171.

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Успехи в исследованиях химических компонентов растенийЦистанхепыхтя. и Ссылка. Китайские традиционные и травяные лекарства 34: 473–476.

4. Йошикава М., Мацуда Х., Морикава Т., Се Х., Накамура С. и др. (2006)Фенилэтаноидные аминогликозиды и ацилированные олигосахара с сосудорасширяющей активностью отЦистанхетрубчатый. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475.

5. Симода Х., Танака Дж., Такахара Ю., Такемото К., Шан С.Дж. и др. (2009) Гипохолестеринемические эффектыЦистанхетрубчатыйэкстракт, традиционное китайское сырое лекарство, на мышах. Ам Дж. Чин Мед 37: 1125–1138.

6. Ямада П., Иидзима Р., Хан Дж., Шигемори Х., Йокота С. и др. (2010) Ингибирующее действие актеозида, выделенного изЦистанхетрубчатыйна высвобождение химических медиаторов и продукцию воспалительных цитокинов клетками RBL-2H3 и KU812. Планта Мед, 1512–1518 гг.

7. Морикава Т., Пан Ю., Ниномия К., Имура К., Мацуда Х. и др. (2010)Ацилированные аминогликозиды фенилэтаноидов с гепатопротекторной активностью из растения пустыни.Цистанхетрубчатый. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890.

8. Морикава Т., Пан Ю., Ниномия К., Имура К., Юань Д. и др. (2010) Иридоидные и ациклические монотерпеновые гликозиды, канканозиды L, M, N, O и P изЦистанхетрубчатый. Chem Pharm Bull (Токио) 58: 1403–1407.

9. Хе Ю.П., Инь З.З., Ту П.Ф., Лу З.К. (1997) Идентификация и исследование коммерческого лекарственного сырья цистанхе. Журнал китайских лекарственных материалов 20: 117–122.

10. Чжу С.Ю. (2001) Фармакогностическая идентификацияЦистанхетрубчатыйзапутанный видЦистанхепустыня. Журнал китайских лекарственных материалов 24: 24–25.

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG и др. (2013) Микроскопическая идентификация трехтравацистанхив Синь Цзян. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Микроскопическая идентификация коммерческихХербаЦистанхиметодом цифрового изображения. Журнал китайских лекарственных материалов 27: 400–402.

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Исследование идентификациитравацистанхии прелюбодеев. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN и др. (2010) FTIR и 2D-IR спектроскопические исследования различных источниковтравацистанхи. Гуан Пу Сюэ Юй Гуан Пу Фен Си 30: 897–900.

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J и др. (2009) ВыявлениеЦистанхепустыняиз Boschniakla rossica и солярия Cynomorium с использованием FTIR и двумерной корреляционной ИК-спектроскопии. Гуан Пу Сюэ Юй Гуан Пу Фен Си 29: 1502–1507.

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Исследование отпечатков ВЭЖХЦистанхепустыня. Pharma Care & Res 8: 255–257.

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Хроматографический отпечатокЦистанхепустыняметодом ВЭЖХ. Китайские традиционные и травяные лекарства 36: 268–271.

18. Хань Дж.П., Сонг Дж.И., Лю С., Чен Дж., Цянь Дж. и др. (2010) ВыявлениеЦистанхевидов (Orobanchaceae) на основе последовательностей межгенной области пластиды psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) ИдентификацияЦистанхеВиды с помощью химического и межпростого дактилоскопирования повторяющихся последовательностей. биол. фарм. Бюлл., 32: 142–146.

20. Хань Л.Ф., Ядом М.Б., Лю Э.В., Чжан Ю., Ли В. и др. (2012) Структурная характеристика и идентификация фенилэтаноидных гликозидов изЦистанхипустыняYC Маметодом УВЭЖХ/ESI-QTOF-MS/MS. Фитохимический анализ 23: 668–676.

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Анализ алкалоидов в традиционной обработке Coptis chinensis Franch. Комплемент на основе Evid Alternat Med 2012: 942384.

22. Ву Л.Б., Цзян С., Хуан Л.Ф., Чен С.Л. (2013) Исследование технологии обработки листьев мушмулы (Eriobotrya japonica) с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии – квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрии в сочетании с хемометрией. ПЛОС ОДИН 8: e64178.

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Штрихкодирование жизни животных: расхождения субъединицы 1 цитохром с-оксидазы среди близкородственных видов. проц. Р. Соц. Лонд. Б., 270 Прил. 1: С96–99.

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Биологическая идентификация с помощью штрих-кодов ДНК. Proc Biol Sci., 270: 313:321.

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Использование штрих-кодов ДНК для идентификации цветковых растений. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369–8374.

26. Чен С., Яо Х., Хань Дж., Лю С., Сонг Дж. и др. (2010) Проверка области ITS2 в качестве нового штрих-кода ДНК для идентификации видов лекарственных растений. PLoS One 5: e8613.

27. Тамура К., Петерсон Д., Петерсон Н., Стечер Г., Ней М. и др. (2011) MEGA5: Молекулярно-эволюционный генетический анализ с использованием методов максимального правдоподобия, эволюционного расстояния и максимальной экономии. Мол Биол Эвол 28: 2731–2739.

28. Meyer CP, Paulay G (2005) Штрих-кодирование ДНК: частота ошибок на основе комплексной выборки. PLoS Биол 3: e422.

29. Кобаяси Х., Карасава Х., Миясе Т., Фукусима С. (1984) Исследования составляющих.ЦистанхеХерба.IV. Выделение и структура двух новых фенилпропаноидных гликозидов, цистанозидов C и D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885.

30. Кобаяси Х., Карасава Х., Миясе Т., Фукусима С. (1985) Исследования составляющихЦистанхеХерба. VI. Выделение и структура нового иридоидного гликозида 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650.

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) ДифференциацияХербаЦистанхипо отпечатку пальца с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии – детектирование на диодной матрице – масс-спектрометрия. Журнал хроматографии A 1216: 2156–2162.

32. Хань Л.Ф., Боакье Ю.М., Лю Э., Чжан Ю., Ли В. и др. (2012) Структурная характеристика и идентификация фенилэтаноидных гликозидов изЦистанхи пустынные YC Maметодом УВЭЖХ/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676.

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) Выделение и очистка фенилэтаноидных гликозидов изЦистанхепустыняметодом высокоскоростной противоточной хроматографии. Пищевая химия 108: 702–710.

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) Количественный анализЦистанхиХербас использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с детектированием на диодной матрице и масс-спектрометрии высокого разрешения в сочетании с хемометрическими методами. J Sep Sci 26: 1945–1952.

35. Кобаяси Х., Карасава Х., Миясе Т., Фукусима С. (1985) Исследования составляющих.ЦистанхеХерба. V. Выделение и структура двух новых фенилпропаноидных гликозидов, цистанозидов E и F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457.

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Анализ химических компонентов вЦистанхеразновидность. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.

37. Массарт Д.Л., Вандегинсте Б.М., Деминг С.Н., Мишотт Ю., Кауфман Л. (1988) Обработка данных в науке и технике. Хемометрика: учебник.

38. Хуан Л.Ф., Чжэн С.Х., Ву Л.Б., Цзян Х., Чен С.Л. (2014) ЭкотипыЦистанхе пустыннаяна основе химического компонента и молекулярных признаков. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) исследования и промышленное развитие травцистанхи. Журнал китайской фармацевтики 46: 882–887.

40. Кобаяси Х., Огучи Х., Такидзава, Миясе Т., Уэно А. и др. (1987) Новые фенилэтаноидные гликозиды изЦистанхетрубчатый(ШРЕНК) Крюк. ф. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314.