Часть 2: Эхинакозид увеличивает количество сперматозоидов у крыс, воздействуя на гипоталамический андрогенный рецептор

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Чжихуэй Цзян1,2, Бо Чжоу2, Синьпин Ли2, Гордон М. Кирби3 и Сяоин Чжан1,2

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 1

Эксперимент лечение.

Эксперимент 1. Мышей случайным образом разделили на шесть групп, по семь мышей в каждой группе (n=7).ЭХ(Эхинакозид из цистанхе)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Сычуань, Китай) вводили через внутрижелудочный зонд и вводили тестостерона пропионат (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Тяньцзинь, Китай). внутримышечно один раз в день в течение 14 дней согласно следующей схеме эксперимента: Контрольная группа: физиологический раствор (10 мл/кг), ЭХГ_(L)группа (5 мг/кг), ЭХГ_(M)группа (20 мг/кг), ЭХГ_(H)группа (80 мг/кг), ТП (15 мг/кг) и энзалутамид (ингибитор АР, один раз в день через день в течение 14 дней; 20 мг/кг; CAS: 915087- 33-1; Aladdin, Шанхай, Китай).

Через 2 недели лечения мышей анестезировали диэтиловым эфиром, чтобы собрать образцы крови для анализа уровня гормонов. Затем мышей вскрывали для отделения гипоталамуса, головного мозга и гипофиза, семенников и хвостового придатка яичка. Образцы придатка яичка помещали в физиологический раствор с 5% BSA для оценки качества спермы, а гипоталамус, головной мозг, гипофиз и яички замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 градусов для дальнейших исследований.

Эксперимент 2. Мышей случайным образом разделили на 10 группы, по пять животных в группе. ЭХГ (20 мг/кг) вводили перорально, а мышей в каждой группе анестезировали диэтиловым эфиром в моменты времени 0,5 ч, 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 2,5 ч, 3 ч, 4 ч, 6 ч, 9 ч. ч и 12 ч после введения для сбора образцов.

Собирали плазму и обнажали сердце. Перфузию физиологического раствора в левые желудочки проводили с помощью инфузионного аппарата до тех пор, пока печень и легкие не побледнели. Затем брали гипоталамус и яичко для определения концентрации ЭХГ в тканях.(Эхинакозид из цистанхе).

Эксперимент 3. Мышей случайным образом разделили на 4 группы, по семь в каждой. ЭХ(Эхинакозид из цистанхе)и BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Шанхай, Китай) вводили через внутрижелудочный зонд один раз в день в течение 6 недель согласно следующему плану эксперимента: нормальная группа (кукурузное масло, 10 мл/кг, м.т./ d), модельная группа: группа БФА (БФА 200 мг/кг, масса тела в день, кукурузное масло) и экспериментальная группа: группа БФА плюс ЭХГ (БФА 200 мг/кг; ЭХГ 20 мг/кг).

После 42 дней лечения мышей анестезировали диэтиловым эфиром и брали образцы крови для анализа уровня гормонов. Семенник и хвостовой отдел придатка яичка отделяли и собирали. Хвост придатка использовали для оценки качества спермы, а яички замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 градусов для дальнейшего исследования.

Рисунок 7. Пути, регулируемые выбранными гормонами и белками, связанными с осью HPG, в мужской репродукции, как предсказано базой данных Pathway Ontology Database и базой данных KEGG Pathway.

Примечания: Регулируемые процессы представлены фоном разных цветов и форм, а регулирующие события отображаются с помощью стрелок и линий.

Ссылки, связанные с каждым белком, были основаны на базе данных Pathway Ontology Database и базе данных KEGG Pathway и не указаны.

Определение качества спермы. Приготовление суспензии спермы. Эпидидимиды хвоста измельчали ​​в 5 мл физиологического раствора с 5% BSA и инкубировали в течение 5 мин при 37°, чтобы их содержимое распространилось в среде.

Количество сперматозоидов: В соответствии с методом, описанным Yokoi (2003), разбавленную суспензию сперматозоидов (1:10; об/об; суспензия сперматозоидов/10 % метанола) переносили в каждую счетную камеру гемоцитометра и оставляли на 5 мин, а затем подсчитывали под световым микроскопом (Nikon, Instruments Inc., Япония) при увеличении X200.

Жизнеспособность сперматозоидов: всего 20 мкл суспензии сперматозоидов смешивали с равным объемом красителя эозин-нигрозин в течение 2 мин; неокрашенные сперматозоиды подсчитывали под световым микроскопом при 200-кратном увеличении.

Подвижность сперматозоидов: в общей сложности 10 мкл суспензии сперматозоидов помещали на предметное стекло и регистрировали как подвижные, так и неподвижные под световым микроскопом при 200-кратном увеличении.

Определение уровня гормонов. Уровни тестостерона (Т) и ЛГ определяли количественно в гомогенатах сыворотки, головного мозга, гипофиза и яичка с использованием наборов для радиоиммуноанализа (РИА) (Пекинский китайско-британский институт биологических технологий, Пекин, Китай). К образцам или стандарту (100 мкл) добавляли антитестостероновые или анти-LH антитела IgG (100 мкл) и 125-I-конъюгированные антимышиные антитела и перемешивали на качалке в течение ночи при 4°С. После трехкратной промывки PBS-Tween 20 (500 мкл) смеси центрифугировали (3500 об/мин) при 4 градусах в течение 15 мин. Значения СРМ осадка оценивали с помощью радиоиммуноанализатора (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Пекин, Китай), а концентрации Т и ЛГ рассчитывали по формуле стандарта изгиб. Коэффициент вариации T и LH составляет 2,8% и 3,2% в выборочных группах и 2,1% и 2,8% в стандартных группах соответственно.

Определение экспрессии генов с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Тотальную РНК выделяли из замороженных тканей яичка и головного мозга и гипофиза с использованием набора RNA Simple Total RNA (Tiangen, Пекин, Китай). Количественную ПЦР в реальном времени (q RT-PCR) проводили для амплификации кДНК с использованием 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Нанкин, Китай). Процедура ПЦР состояла из 95 градусов в течение 30 секунд, за которыми следовали 35 циклов 95 градусов в течение 15 секунд, 58 градусов в течение 30 секунд и 72 градусов в течение 30 секунд. Анализ кривой плавления проводили для продуктов ПЦР для проверки специфичности праймера и чистоты продукта. Кривая диссоциации была построена для каждой пластины, чтобы подтвердить образование одного продукта. Рассчитывали относительное содержание каждой мРНК. Праймеры для ПЦР, использованные для исследования, показаны в таблице 2.

Вестерн-блот. Для анализа экспрессии AR экстракцию и выделение цитоплазматического и ядерного белка проводили с использованием набора для извлечения цитоплазматического и ядерного белка (Beyotime, Нанкин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрации цитоплазматических и ядерных белков оценивали с использованием набора Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Цзянсу, Китай). Образцы белка (80 мкг) анализировали на 12-процентном и 5-процентном SDS-PAGE геле и переносили на мембраны PVDF. После блокировки мембраны инкубировали с антителами IgG к AR (1:1,000; Bioss; Пекин, Китай) и мышиными поликлональными антителами к GAPDH (1:1,000; Wuhan Boster биологическийTechnology, Ухань, Китай) или мышиные поликлональные антитела против ламина b1 в течение 2 часов. Мембрану трижды промывали TBST и инкубировали с HRP-конъюгированным кроличьим антителом против IgG мыши (1:5, 000; Bioss; Пекин, Китай). Сигнал визуализировали с помощью системы визуализации ChemiDoc (Tanon-3, 500, Шанхай, Китай).

Анализ высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Кровь собирали в гепаринизированные стеклянные пробирки. Плазму отделяли немедленным центрифугированием при 6{2}} об/мин в течение 10 мин и хранили при температуре -20 градусов для дальнейшего эксперимента. Образцы гипоталамуса и семенников из каждой временной точки объединяли и гомогенизировали метанолом. После центрифугирования при 10{6}} об/мин при 4 градусах в течение 10 мин супернатант концентрировали азотом, остаток растворяли в 50 мкл метанола и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Десять мкл отфильтрованной жидкости образца вводили в систему ВЭЖХ для анализа.

Стандартная кривая состояла из образцов, содержащих 50, 100, 250, 500 и 750 нг/мл ЭХГ.(Эхинакозид из цистанхе)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Сычуань, Китай). Образцы контроля качества плазмы, содержащие 75 нг/мл (низкий уровень), 150 нг/мл (средний уровень) и 300 нг/мл (высокий уровень) ЭХГ, были соответственно подготовлены для измерения точности и прецизионности метода.

Хроматографию проводили с помощью системы ВЭЖХ (серия D2{{10}}00 Elite, Hitachi, Япония), соединенной с УФ-детектором (L-2400, Hitachi, Япония). Разделение выполняли на колонке Thermo-C18 (250 мм × внутренний диаметр 4,6 мм, частицы размером 4,6 мкм) при температуре 25°С. Подвижная фаза представляла собой градиент, приготовленный из 0,1% фосфорной кислоты, содержащей 0,04% триметиламина (компонент А) и метанола (компонент В). Линейный градиент был следующим: 70–90 процентов A в течение 0-2 мин, 60–70 процентов A в течение 2–6 минут, 55–60 процентов B в течение 6–8 минут, а затем возвращались к 90 процентам A в течение 8 минут. мин сразу. Скорость потока составляла 0,8 мл/мин. УФ-детектор работал при 332 нм. Площадь пика оценивали как аналитическое измерение.

Фармакокинетические исследования на мышах. Проникновение ЭХ(Эхинакозид из цистанхе)к гипоталамусу и семенникам подвергали фармакокинетическому анализу с помощью программного обеспечения Drug and Statistics (Drug and Statistics, Профессиональный комитет по математической фармакологии Китая). Фармакокинетические параметры определяли некомпартментным методом, основанным на теории статистических моментов. Предварительные фармакокинетические параметры, включая время до пиковой константы (Tmax), пиковую концентрацию (Cmax), константу скорости элиминации (Ke), период полувыведения (T0,5), площадь под кривой (AUC{ {4}}–12), кажущийся объем распределения (Vc) и клиренс (CL) были получены для дальнейшего анализа. Соотношение мозг/плазма рассчитывали на основе значений AUC0-t для плазмы и мозга.

Синтез и идентификация ЭХГ-овальбумина (ЭХГ-ОВА). Всего 9,8 мг ЭХГ(Эхинакозид из цистанхе)и 1,0 мг ангидрида бутандиола растворяли в 2 мл пиридина, перемешивали в течение 12 ч при перемешивании при комнатной температуре. Смесь концентрировали азотом, остаток объединяли с 10,8 мг N-гидроксисукцинимида (NHS) и 19,3 мг дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и растворяли в 4 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) в течение 12 ч при перемешивании при комнатной температуре. . После центрифугирования при 2,000 g в течение 5 мин при 4°С супернатант добавляли к 5 мл PBS, в котором было растворено 14,4 мг овальбумина (OVA). Новую смесь перемешивали в течение 24 ч при 4°С. Затем реакционный раствор диализовали против PBS в течение трех дней. Присутствие ECH-OVA было подтверждено УФ-спектрами (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) при длине волны в диапазоне от 190 до 400 нм, а также денатурирующим PAGE.

Непрямой ИФА (iELISA). Планшет для микротитрования покрывали ECH-OVA (2 мкг/100 мкл) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет трижды промывали PBST и два раза PBS; и 5% PBSM (PBS, содержащий 5% обезжиренного молока) добавляли для блокирования несвязавшихся участков при 37°С в течение 2 часов. После промывания планшетов PBST и PBS лунки были разделены на 4 группы; опытная группа — 1 мкг общего белка АР/100 мкл; положительная группа, кроличье антитело против OVA (1:1, 000); отрицательная группа, 1 мкг бычьего сывороточного альбумина; и пустая группа, содержащая PBS. После инкубации в течение 1,5 ч планшеты промывали и добавляли 100 мкл/лунку кроличьего HRP-конъюгированного IgG (1:1, 000) к положительной группе, 100 мкл/лунку анти-AR. (1:1,000) к другим группам. После инкубации в течение 1,5 ч в планшеты добавляли конъюгированный с HRP кролика IgG (1:5, 000). После инкубации при 37° в течение 1 ч планшеты промывали три раза PBST и два раза PBS. Затем добавляли ТМБ и инкубировали в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре и добавляли 2 М H2SO4 для остановки реакции. Поглощение считывали при длине волны 450 нм.

Молекулярный докинг. Было проведено исследование молекулярного докинга для изучения способа связывания соединения ECH.(Эхинакозид из цистанхе)к человеческому рецептору андрогенов (AR) с использованием Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Трехмерная (3D) структура AR (идентификатор PDB: 2YHD) была загружена из банка данных белков (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). Трехмерная структура ECH была получена с помощью программного обеспечения ChemBioDraw Ultra 14.0 и ChemBio 3D Ultra 14.0. Пакет AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu) использовался для создания входных файлов стыковки. Сетка поиска AR была определена как центр x: 36,141, центр y: 8,513 и центр z:

21.304 с размерами size x: 15, size y: 15 и size z: 15. Значение полноты было установлено равным 20. Для стыковки Vina использовались параметры по умолчанию, если это не было указано. Была выбрана поза с наибольшей оценкой по оценке стыковки Vina, которая была визуально проанализирована с использованием программного обеспечения PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org).

Анализ данных и статистические методы. Данные анализировали с использованием статистического программного обеспечения SPSS 19.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Для сравнения между группами использовали однофакторный дисперсионный анализ. Были определены сравнительные тесты Тьюки значимых различий между группами. Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) с использованием программного обеспечения Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Software, Inc, Калифорния, США).

Этическое одобрение и согласие на участие. Этическое одобрение этого исследования было получено от Комитета по этике Аньянского технологического института.

использованная литература

1. Кано С.Н., Мисра М. и Акерман К.Е. Упражнения, тренировки и гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось у мужчин и женщин. Фронт. Горм. рез. 47, 27–43 (2016).

2. Пападопулос В. и Миллер В.Л. Роль митохондрий в стероидогенезе. Лучшая практика. рез. Кл. Эн. 26, 771–790 (2012).

3. Роне М.Б. и соавт. Идентификация динамического митохондриального белкового комплекса, управляющего импортом, транспортировкой и метаболизмом холестерина в стероидный гормон. Мол. Эндокринол. 26, 1868–1882 (2012).

4. Шибари С., Илонен Х. и Пальме Р. Экскреция и измерение метаболитов кортикостерона и тестостерона у рыжих полевок (Myodes glareolus). Генерал Комп. Эндокринол. 243, 39–50 (2017).

5. О'Хара Л. и соавт. Передача сигналов гипофизарного андрогенового рецептора регулирует пролактин, но не гонадотропины у самцов мышей. ПлоС один. 10, e0121657 (2015).

6. Амадор, А.Г., Паркенинг, Т.А., Бимер, В.Г., Бартке, А. и Коллинз, Т.Дж. Тестикулярные рецепторы ЛГ и уровни циркулирующих гормонов в трех мышиных моделях наследственных заболеваний (Tfm/y, lit/lit и hyt/hyt). Эндокринол. Эксп. 20, 349–58 (1986).

7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. & Scheiner-Bobis, G. Неклассическая передача сигналов тестостерона, опосредованная ZIP9, стимулирует экспрессию клаудина и образование плотных контактов в клетках Сертоли. Клетка. Сигнал. 28, 1075–85 (2016).

8. Walker, WH Передача сигналов тестостерона и регуляция сперматогенеза. Сперматогенез. 1, 116–20 (2011).

9. Цао, К. и Киндшер, К. Медицинская химия видов эхинацеи (под ред. Киндшера, К.) 127–145 (Springer, 2016).

10. Цзян, ZH, Цзянь, W., Ли, XP и Чжан, XYЭхинакозида такжеЦистанхе трубчатая (Schenk) R. Wight улучшает вызванное бисфенолом А повреждение яичек и сперматозоидов у крыс за счет регулируемых осью гонад стероидогенных ферментов. Дж. Этнофармакол. 193, 321–328 (2016).