Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы перейти к части 1

2.4. Влияние условий экстракции на CAI

Коллаген является наиболее распространенным белком у млекопитающих и основным структурным компонентом внеклеточного матрикса с повторяющимися единицами gly-pro-hyp длиной более 1400 аминокислот. Коллагеназа представляет собой фермент, расщепляющий пептидные связи коллагена, образующие кожу, кости, сухожилия и связки. Коллаген, присутствующий в дерме, расщепляется коллагеназой, что вызывает появление морщин на коже и снижает эластичность кожи; следовательно, необходимо снизить активность коллагеназы для предотвращения морщин на коже [32,33]. Оптимизацию условий ЭАЭ проводили для максимизации CAI экстракта скорлупы арахиса. Всего для оптимизации трех отдельных переменных потребовалось 17 прогонов, а экспериментальные данные CAI, полученные для экспериментальных наборов, составили 25,2% ~ 92,3% (таблица 2). На основе 17 экспериментальных прогонов, применяя множественный регрессионный анализ экспериментальных данных, ответ и независимые переменные были связаны следующим уравнением квадратичной регрессии с точки зрения закодированных параметров, приведенных в таблице 3. Затем был применен ANOVA для определения коэффициентов регрессии. , статистическая значимость и соответствие математическим моделям. Среднеквадратические значения были рассчитаны путем деления суммы квадратов каждого источника вариаций на их степени свободы, и для определения статистического значение при анализе квадратичной модели. Результаты дисперсионного анализа подтвердили, что R2 уравнения квадратичной регрессии составляет 0,8862, а значение p равно 0,0134, что меньше уровня значимости (p < 0,05),="" что="" указывает="" на="" хорошую="" модель="" соответствия="" и="" статистических="" данных.="" значение="" для="" прогнозирования="" значений="" cai.="" в="" первичном="" члене="" x2="" и="" x3="" показали="" значительные="" эффекты,="" а="" условия="" эффекта="" взаимодействия="" были="" значительными="" в="" x1x2="" и="" x2x3="" (p=""><0,05). подтверждено,="" что="" влияние="" условий="" эаэ="" на="" продукцию="" cai="" находится="" в="" следующем="" порядке:="" температура="" экстракции="" (p="0,0236)"> концентрация этанола (p=0,0240) > время экстракции (p {{37}). }}.8505), что указывает на значительное влияние температуры экстракции и концентрации этанола на CAI.

На рис. 1с показан график возмущений, на котором зафиксированы две переменные, и визуализируется влияние одной переменной на CAI. Было показано, что влияние всех трех переменных на CAI было сходным, и три переменные продемонстрировали значительное влияние и увеличили, а затем уменьшили CAI по мере увеличения каждой независимой переменной. В нашем исследовании были разработаны трехмерные кривые отклика поверхности для визуализации взаимодействия двух независимых переменных в CAI с использованием уравнений квадратичной регрессии (рис. 4). Когда концентрация этанола была зафиксирована в центральной точке, влияние времени экстракции и температуры на CAI оценивали на рисунке 4A. Поскольку две переменные изменились одновременно, CAI увеличился до

33,4 мин и 76,8°C, и снова снизился после максимального CAI 92,8%. Как показано на рис. 4B,C, CAI имел самое высокое значение при концентрации этанола 64,3 процента, демонстрируя после этого тенденцию к постепенному снижению, что свидетельствует о том, что бинарный растворитель, состоящий из 64,3 процента этанола, более подходит в качестве растворителя для экстракции. Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что бинарный растворитель из воды и этанола показал более высокий CAI, чем вода, при экстракции биологически активных соединений из Orostachys japonica, что предполагает, что 50-процентный этанол будет более выгоден для экстракции.кожа-отбеливание ингредиенты [34]. Максимальный CAI экстракта скорлупы арахиса, предсказанный моделью квадратичной регрессии, составил 94,5%, что было получено при условиях времени экстракции 45,1 мин, температуры экстракции 93,6°C и концентрации этанола 42,3%. CAI, полученный в нашем исследовании, составил 94,5 процента, что более чем в два раза превышает эффекты 39,4 процента и 40,3 процента значений CAI экстрактов зеленого чая, о которых сообщают Oh et al. [35].

Рисунок 4. Графики поверхности отклика для CAI экстрактов скорлупы арахиса в зависимости от времени экстракции, температуры экстракции и концентрации этанола. CAI в зависимости от температуры экстракции и времени экстракции (A), времени экстракции и концентрации этанола (B), а также температуры экстракции и концентрации этанола (C).

Цистанхе имееткожаотбеливающий эффект

2.5. Оптимальные условия экстракции

Антиоксидант, кожно-отбеливаниеи эффекты против морщин - все это важные функции для косметики, и необходимо получить условия, которые могут максимизировать эти три функции одновременно при оптимизации условий ОАЭ. На рис. 5 показана процедура оптимизации, которая может одновременно максимизировать RSA (Y1), TAI (Y2) и CAI (Y3) путем наложения каждого оптимального условия контурного графа, полученного с помощью уравнения квадратичной регрессии. Диапазоны независимых переменных для оптимизации трех переменных были ограничены временем экстракции 5,0~55,0 мин, температурой экстракции 26,{{10}}. ~94,0 .C, а концентрация этанола 0,0% ~99,5% (таблица 5). В соответствии с индивидуальными оптимальными условиями экстракции, оптимальными условиями ЭАЭ были время экстракции 31,2 мин, температура экстракции 36,6°С, концентрация этанола 93,2% и, при указанных выше условиях, RSA 74,9%, TAI 50,6% и CAI { {28}}.8 процентов были предсказаны. Когда прогнозируемые значения RSA, TAI и CAI сравнивались с полученными в ходе эксперимента для проверки, значения из проверочного теста были аналогичны предсказанным значениям, где значения составляли 78,2 процента, 52,3 процента и 87,7 процента. соответственно.

Рисунок 5. Наложение контурной карты для одновременной оптимизации трех переменных для максимизации RSA (в процентах), TAI (в процентах) и CAI (в процентах). Концентрация этанола была зафиксирована на оптимальном уровне 93,2%.

Таблица 5. Сравнение RSA, TAI и CAI экстракта скорлупы арахиса, полученного экстракцией по Сокслету (SE) и экстракцией с помощью ультразвука (UAE) при различных условиях экстракции.

1 Ультразвуковая экстракция скорлупы арахиса под центральной точкой ПЗС (серии № 15, 16, 17); 2 ультразвуковых экстракции скорлупы арахиса в оптимальных условиях экстракции.

2.6. Сравнение Юго-Восточной Азии и ОАЭ

Чтобы подтвердить эффективность экстракции ЭМА, мы сравнили RSA, TAI и CAI экстракта скорлупы арахиса, полученного с использованием методов ЭМА и экстракции Сокслета (SE). Когда SE проводили в обычных условиях SE с использованием 99,5% этанола при 70 .C в течение 4 часов экстракции, RSA, TAI и CAI были равны 75,5%, 60,2% и 74,4%. не сильно отличались от результатов, полученных в оптимальных условиях ЭАЭ. Однако, когда условия SE были установлены равными оптимальным условиям ЭАЭ, равным 31,2 мин и 93,2% этанола, RSA, TAI и CAI снизились на 62,0, 28,3 и 45,6% соответственно по сравнению с ЭАЭ в оптимальных условиях. Преимущество ультразвука в производстве полезных материалов из скорлупы арахиса было оценено как процесс, подходящий для высокой производительности и индустриализации из-за низкого расхода растворителя и короткого времени экстракции.

2.7. Экспрессия мРНК MMP-3 и TRP-1

В меланоцитах млекопитающих меланогенез и гидролиз коллагена контролируются генами TRP и MMP соответственно, а TRP{{0}} и MMP-3 известны как основные гены регуляции меланогенеза и гидролиза коллагена. ; поэтому был проведен анализ ОТ-ПЦР лизатов целых клеток клеток B16-F0 и влияние экстракта скорлупы арахиса, полученного из ОАЭ в оптимальных условиях (31,2 мин, 36,6°С, 93,2%). на экспрессию мРНК MMP-3 и TRP-1. Как показано на рис. 6, экстракт скорлупы арахиса значительно снижал экспрессию MMP-3 и TRP-1 в клетках B16-F0, когда эксперименты по экспрессии генов проводились с арахисом. диапазон концентраций экстракта скорлупы 0~1 мг/мл. Экстракт скорлупы арахиса значительно снижал экспрессию MMP-3 и TRP-1 в 6,1- и 8,7- раз соответственно при дозе 1,0 мг. /мл. Эти результаты свидетельствуют о том, что экстракт скорлупы арахиса ингибирует деградацию коллагена в клетках B16F0 путем инактивации MMP-3 до инактивации MMP-1 и препятствует взаимодействию MMP-9 [36]. Существующие исследования показали, что лечение растительными экстрактами ингибирует экспрессию фактора транскрипции, связанного с микрофтальмом (MITF), путем фосфорилирования протеинкиназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK). Таким образом, ингибирующий эффект выработки меланина экстрактом скорлупы арахиса объясняется ингибированием активности тирозиназы посредством ингибирования экспрессии ERK и MITF [37]. Таким образом, экстракты скорлупы арахиса снижают уровни экспрессии мРНК TRP-1 и MMP-3, что указывает на то, что экстракт скорлупы арахиса обладает сильной ингибирующей активностью в отношении коллагенолиза и меланогенеза, что делает его превосходным косметическим материалом для кожи.отбеливаниеи эффект против морщин.

Рисунок 6. Влияние экстракта скорлупы арахиса на экспрессию мРНК TRP-1 и MMP-3. Клетки B16-F0 обрабатывали различными концентрациями экстракта скорлупы арахиса в течение 24 часов. Уровни мРНК MMP-9 и TRP-1 измеряли с помощью ОТ-ПЦР (а). Интенсивность полос оценивали с использованием программного обеспечения Quantity One и нормализовали по -актину (* p < 0,05).="" все="" данные="" выражены="" как="" среднее="" значение="" o="" sd="" для="" трех="" отдельных="" экспериментов,="" проведенных="" в="" трех="" экземплярах.="" nt="необработанный" образец,="" количественная="" оценка="" экспрессии="" мрнк="" trp-1="" (a),="" количественная="" оценка="" экспрессии="" мрнк="" mmp-3="">

cistanche phelypaes приносит пользу коже

3. Материалы и методы

3.1. Материалы и реагенты

Скорлупа арахиса была приобретена в магазине Nonghyup (Гочанг, Чонбук, Корея) 2019 марта и была высушена при 60°C в сушильном шкафу (FC 49, Lab House, Сеул, Корея) в течение 24 часов до сухая масса оставалась постоянной. Высушенную скорлупу арахиса измельчали ​​с помощью кухонного комбайна (Hanil HMF-3800, Сеул, Корея), а затем пропускали через сито с размером ячеек 600 мкм. Этанол был приобретен у Samchun Chemical (95,0% об./об., Сеул, Корея). Реагент Фолина-Чокальтеу, галловая кислота (97%) и кверцетин были приобретены у Merck (Кенилворт, Нью-Джерси, США). 2,2-Дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH), аскорбиновая кислота и 3,4-дигидрокси-L-фенилаланин (L-DOPA) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, МО, США). Все другие химические вещества, использованные в этом эксперименте, были аналитической чистоты и приобретены у Sigma-Aldrich. Все исходные растворы готовили из очищенной деионизированной воды с использованием системы очистки Milli-Q (Millipore, Burlington, VT, USA).

3.2. Ультразвуковая экстракция и экстракция по Сокслету

Порошкообразную скорлупу арахиса (1 г) помещали в экстракционный сосуд, в каждом из которого было 10 мл растворителя, и перемешивали с помощью вихревого миксера (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Вонджу, Корея). на 1 мин. Экстракцию проводили путем циркуляции воды в ультразвуковом экстракторе (250 Вт, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Вонджу, Корея) с использованием внешнего циркуляционного термостата с охлаждающей ванной (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Вонджу, Корея). Корея) с цифровым таймером и регулятором температуры. Экстракцию проводили ультразвуковым аппаратом, оснащенным цифровым таймером и регулятором температуры. Образец подвергали ультразвуковой обработке в течение различных экспериментальных периодов и температур при рабочей частоте 40 кГц. Затем экстракт центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 мин (236R, Labogene, Сеул, Корея). После центрифугирования объемы проб доводили до 5 мл и фильтровали через мембранный фильтр 0,2 мкм перед анализом. Для экстракции по Сокслету порошкообразную скорлупу арахиса (5 г) непрерывно экстрагировали 100 мл с использованием 99,5% этанола в течение 4 ч (8 циклов) при максимальной температуре 70°С в аппарате Сокслета. Было показано, что метод экстракции с помощью ультразвука очень эффективен при экстракции масла из виноградных косточек. Преимущество ультразвука по сравнению с обычными методами экстракции как для масла, так и для полифенолов было одинаковым, поскольку выход масла/полифенолов был получен при более низком растворителе. потребление и более короткое время экстракции.

экстракт цистанхе трубчатой

3.3. Экспериментальная дизайн

План эксперимента был выполнен с использованием ПЗС, типа RSM, чтобы минимизировать количество экспериментов и изучить взаимодействие между факторами. Программное обеспечение Design-Expert® 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) использовалось для планирования экспериментов, анализа данных и оптимизации условий экстракции для максимального извлечения биологически активных соединений, имеющих антиоксидант, кожно-отбеливаниеи антивозрастной эффект арахисовой скорлупы. Эксперименты были спланированы в соответствии с CCD, диапазон и центральные значения трех представленных независимых переменных были основаны на результатах предварительных экспериментов (таблица 1). ПЗС применяли для прогнозирования оптимальных условий ЭМА для максимизации ответов, включая RSA, TAI и CAI из скорлупы арахиса. В качестве независимых переменных были выбраны три переменные: время экстракции (Х1), температура экстракции (Х2) и концентрация этанола (Х3). В общей сложности было проведено 17 экспериментальных прогонов с тремя повторениями в центральных точках для оценки воспроизводимости. Модель квадратичной регрессии использовалась для подбора экспериментальных данных и применялась для прогнозирования переменных отклика, как показано в уравнении (1):

Y= 0 плюс 1X1 плюс 2X2 плюс 3X3 плюс 11X12 плюс 22X22 плюс 33X32 плюс 12X1X2 плюс 13X1X3 плюс 23X2X3 (1)

где Y — прогнозируемый отклик; 0 — константа (перехват); 1, 2 и 3 — коэффициенты регрессии для условий линейного эффекта; 11, 22 и 33 — члены квадратичного эффекта; 12, 13 и 23 — условия эффекта взаимодействия соответственно. Анализ поверхности отклика и дисперсионный анализ использовались для определения коэффициентов регрессии и статистической значимости членов модели, а также для подгонки математических моделей эксперимента [38].

3.4. Активность по удалению радикалов DPPH (RSA)

RSA экстракта скорлупы арахиса был описан Pereira-Caro et al. [39]. Готовили раствор 0.01 мМ DPPH в метаноле (95 процентов) и добавляли 1,25 мл к 0,25 мл разбавленного экстракта. RSA определяли для измерения поглощения при 517 нм с использованием спектрофотометра UV-Vis (UV1650PC, Shimadzu, Киото, Япония) после 20-минутной инкубации. Бланк готовили с использованием дистиллированной воды, и RSA рассчитывали в соответствии с нижеприведенным.

(Уравнение (2)):

3.5. Ингибирование активности тирозиназы (TAI)

TAI проводили по модифицированному методу с использованием L-DOPA в качестве субстрата Jo et al. [40]. Образцы смешивали с 200 мкл L-ДОФА и 200 мкл калий-фосфатного буфера (рН 6,8), добавляли в пробирку 200 мкл тирозиназы (125 ЕД/мл) и инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Поглощение образца измеряли при 475 нм с использованием УФ-видимого спектрофотометра, и результаты сравнивали с контролем. Для каждой концентрации рассчитывали активность фермента в процентах по сравнению с активностью при анализе с использованием буфера без какого-либо ингибитора, а TAI рассчитывали на основе следующей формулы. (Уравнение (3)):

где Abs (контроль) – поглощение буфера плюс коллагеназа; Abs (образец) представляет собой поглощение буфера плюс коллагеназа плюс образец/стандарт.

3.6. Ингибирование активности коллагеназы (CAI)

Измерение ЦАИ экстрактов проводили модификацией методов Вюнша и Хайндриха [41]. Субстрат, 4-фенилазобезилоксилкарбонил-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg (FALGPA), растворяли в 10 мл буфера до концентрации 1,2 мг/мл, затем добавляли 125 мкл раствора и инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Коллагеназу растворяли в буфере до концентрации 0,4 мг/мл и к буферному раствору добавляли 75 мкл раствора фермента. Смесь фермент-субстрат инкубировали на водяной бане при 37°С в течение 30 мин и останавливали реакцию добавлением 75 мкл 20%-ной лимонной кислоты (масса/объем). После добавления 1,5 мл этилацетата этилацетатный слой отделяли и измеряли оптическую плотность при 320 нм. Процент ингибирования рассчитывали по следующей формуле.

w

где Abs (контроль) – поглощение буфера плюс коллагеназа; Abs (образец) представляет собой поглощение буфера плюс коллагеназа плюс образец/стандарт.

3.7. Поддержание и культивирование клеточных линий

Меланин-продуцирующие клетки меланомы B16-F0 были получены из Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Korea) и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, Миссури, США) с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, 10 процентов, Welgene, Gyeongsan, Korea) и раствора антибиотика пенициллина-стрептомицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Трипсин-ЭДТА (Gibco, Grand Island, NY, USA) использовали для трипсинизации клеток. Все используемые материалы были пригодны для клеточных культур.

3.8. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR)

Для измерения изменений уровней экспрессии генов MMP-3 и TRP-1, связанных сотбеливаниепротив морщин, клетки B16-F0 культивировали в 24-луночном планшете, обработанном различными концентрациями экстракта скорлупы арахиса в бессывороточной среде DMEM, и инкубировали в течение 24 часов. . Контроль необработанных клеток поддерживали при

в тех же условиях, что и испытуемая группа во время эксперимента. Выделение РНК из клеток проводили с использованием набора AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Тэджон, Корея). Комплементарную ДНК синтезировали с использованием мастер-микса для синтеза кДНК AmfiRiert Platinum (GenDEPOT, Barker, TX, USA). Анализ RT-PCR проводили с использованием системы CFX 96 touch PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) для определения уровней мРНК. Используемые праймеры были следующими: MMP-3 смысловая, 5/-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3/ и антисмысловая, 5/-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3/; и смысловой TRP{{10}}, 5/-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC- 3/ и антисмысловой, 5/-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-3/. Соответствующий набор упомянутых выше праймеров использовали для амплификации соответствующих генов при следующих условиях циклирования: 94°С в течение 5 мин, затем 25 циклов при 95°С в течение 5 с, 60°С в течение 30 с (для ММР-3). ), и 60°C в течение 30 с (для TRP-1), и 72°C в течение 30 с продления. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали с использованием программного обеспечения Gel Doc TM XR plus System и Quantity One 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Белок «домашнего хозяйства» -актин использовали в качестве контроля загрузки, предполагая, что уровни экспрессии этих белков остаются постоянными.

цистанхе пустынная имеетотбеливаниеи эффект против морщин

4. Выводы

В этом исследовании использовался дополнительный подход к извлечению и использованию биоактивных веществ из сельскохозяйственных побочных продуктов скорлупы арахиса для разработки ингредиентов с добавленной стоимостью для многократного использования. Прежде всего, мы попытались повысить эффективность извлечения биоактивных соединений антиоксидантными, кожно-активными веществами.отбеливание, и эффект против морщин за счет оптимизации процесса ОАЭ. Поэтому в этом исследовании ОАЭ использовались для эффективного производства биоактивных соединений с кожей.отбеливаниеи эффект от скорлупы арахиса против морщин, а также применена статистическая оптимизация для одновременного увеличения RSA, TAI и CAI. Условия ЭАЭ были оптимизированы с использованием ПЗС, и было подтверждено, что выбор растворителя и концентрации следует учитывать при экстракции биоактивных соединений из скорлупы арахиса. Путем наложения поверхностей отклика, кривых трех зависимых переменных, времени экстракции 31,2 мин, температуры экстракции 36,6°С и концентрации этанола 93,2% были определены оптимальные условия ЭАЭ. Подтверждено, что RSA экстрактов скорлупы арахиса очень высока, и можно ожидать увеличения TAI и CAI, которые являются индикаторами кожного заболевания.отбеливаниеи антивозрастной эффект соответственно. Оптимизация условий ОАЭ подтвердила увеличение продукции биоактивных веществ в скорлупе арахиса иотбеливаниеи действие экстракта скорлупы арахиса против морщин за счет снижения активности тирозиназы и коллагеназы. На основании этого было оценено влияние скорлупы арахиса на уровни экспрессии MMP и TRP, чтобы определить, имеют ли ониотбеливаниеи эффекты против морщин на уровне экспрессии генов.Отбеливаниеа действие экстрактов скорлупы арахиса против морщин было подтверждено посредством подавления экспрессии мРНК, а также ингибирования экспрессии белков MMP-3 и TRP-1. Таким образом, было доказано, что экстракт скорлупы арахиса эффективен приотбеливаниеи улучшение морщин на уровне экспрессии белка и генов. Экстракт скорлупы арахиса с использованием ЭАМ обладает высокой антиоксидантной активностью и отлично очищает кожу.отбеливаниеи эффекты против морщин, что дает скорлупе арахиса большой потенциал в качестве натурального косметического и пищевого ингредиента. Кроме того, считается, что производство биоактивных соединений с использованием ОАЭ можно применять в процессе коммерциализации производства косметики, продуктов питания и фармацевтических материалов, учитывая более высокую производительность и снижение затрат на обработку по сравнению с обычными процессами.

Вклад авторов: Индивидуальный вклад авторов определяется следующим образом: написание - подготовка первоначального проекта, получение финансирования, надзор, написание, редактирование, JWK; валидация, анализ, методология, DHG; Исследование, методология, обработка данных, редактирование, JWH; анализ, методология, обзор, JHK; Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование: Это исследование не получило внешнего финансирования.

Заявление Институционального контрольного совета: Неприменимо.

Заявление об информированном согласии: неприменимо.

Заявление о доступности данных: в этом исследовании не создавались и не анализировались новые данные. Обмен данными не применим к этой статье.

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Доступность образцов: образцы соединений не доступны у авторов.